phân lập vi khuẩn cố định đạm vùng rễ và nội sinh ở khoai lang (ipomoean batatas) trồng tại tỉnh vĩnh long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM NỘI SINH VÀ Ở VÙNG RỄ KHOAI LANG Ipo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cần Thơ, tháng 11/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM NỘI SINH VÀ Ở

VÙNG RỄ KHOAI LANG (Ipomoean batatas) TRỒNG

TẠI TỈNH VĨNH LONG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:

NGUYỄN THỊ LIÊN PHẠM KIM NGÂN

MSSV: 3102755 LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Sau một thời gian học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Công nghệ sinh học tại viện NC&PT CNSH, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô cùng với sự giúp đỡ nhiệt tình của bạn bè để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai, cô Nguyễn Thị Pha, cán bộ phụ trách của phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật, trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện tốt nhất

về dụng cụ thí nghiệm cũng như là những trang thiết bị cần thiết để tôi có thể hoàn thành tốt để tài này

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện NC&PT Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn

Cảm ơn các bạn trong phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật đã luôn sát cánh, nhiệt tình giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành suôn sẻ luận văn của mình

Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cha mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn qua mọi khó khăn trong cuộc sống

Xin kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công trong cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn!

Phạm Kim Ngân

TÓM LƯỢC

Đề tài đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm từ đất vùng

rễ và từ các giống khoai trồng ở huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có màu trắng trong (24,39%), trắng đục (65,85%), trắng sữa và vàng nhạt (9,76%); dạng tròn (82,93%) hay không đều (14,63%); bìa nguyên (100%); độ nổi lài (65,85%) hoặc mô (34,15%) Tế bào vi khuẩn có dạng hình que (ngắn và dài), 100% chúng thuộc Gram âm, đều có khả năng chuyển động ít hoặc nhiều Kết quả đo đạm cho thấy dòng vi khuẩn VB35 có khả năng cố định đạm cao nhất ở ngày thứ 2 (3,036 mg/l NH 4 + ) và dòng vi khuẩn VB6 cố định đạm thấp nhất cũng ở ngày thứ 2 (0,085 mg/l NH 4 + ) Khảo sát sự hiện diện của gen nifH thì có 8 dòng cho band có kích thước phù hợp là các dòng VB20, VB35, VB37, VB29, VB39, VB18, VB41 và VB12 Giải trình tự dòng vi khuẩn VB35 và sử dụng phần mềm BLAST

N để so sánh với trình tự các dòng vi khuẩn có trong GeneBank của NCBI, kết quả cho thấy dòng VB35 có tỉ lệ đồng hình 100% với các dòng Klebsialla sp TS1, Klebsiella

sp Gp22, Klebsiella pneumoniae S001, Enterobacter sp wengyuan07 và Bacterium

5 – 2 (2013)

Từ khóa: 16S rDNA, cố định đạm, gen nifH, giải trình tự, khoai lang, phân lập

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về đạm 3

2.1.1 Vai trò của đạm đối với cây trồng 3

2.1.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên 3

2.1.3 Cơ chế cố định đạm sinh học 4

2.2 Sơ lược về vi khuẩn cố định đạm sống nội sinh thực vật 6

Vi khuẩn Azospirillum 6

2.2.1 Gluconacetobacter diazotrophicus 8

2.2.2 Vi khuẩn Burkholderia 10

2.2.3 2.3 Sơ lược về vi khuẩn cố định đạm sống tự do trong đất 11

2.3.1 Vi khuẩn Azotobacter 11

2.3.2 Vi khuẩn Clostridium 12

2.3.3 Vi khuẩn Klebsiella 12

2.4 Giới thiệu sơ lược về cây khoai lang 13

2.4.1 Phân loại khoa học 13

2.4.2 Giới thiệu 13

2.4.2 Nguồn gốc và tình hình sản xuất 14

2.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn 16

2.6 Sơ lược về gen nif 17

2.7 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 18

2.8 Kỹ thuật điện di DNA 20

2.9 Giải trình tự DNA 20

2.9.1 Giải trình tự gen 16S rDNA bằng hệ thống tự động 21

2.9.2 So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA với cơ sở dữ liệu 21

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Phương tiện 23

3.1.1 Địa điểm thực hiện 23

3.1.2 Thời gian thực hiện 23

3.1.3 Nguyên liệu 23

3.1.4 Trang thiết bị 23

3.1.5 Hóa chất 24

3.2 Phương pháp 24

3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh và ở vùng rễ khoai lang trên môi trường LGIP không đạm 24

3.2.2 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được 27

3.2.3 Khảo sát sự hiện diện của gen nifH 30

3.2.4 Nhận diện vi khuẩn bằng giải trình tự gen 16S rDNA 32

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 34

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn vùng rễ và nội sinh ở khoai lang trên môi trường LGIP không đạm 34

4.1.1 Đặc tính vi khuẩn phân lập được trên môi trường LGIP 34

4.1.2 Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được 38

4.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được 41

4.3 Sự hiện diện của gen nifH ở một số dòng vi khuẩn 44

4.4 Kết quả giải trình tự vùng gen 16S rDNA 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC……………… Phụ lục 1: Các hình ảnh

Phụ lục 2: Các phương pháp phân tích

Phụ lục 3: Các kết quả

Phụ lục 4: Kết quả thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum ở một số loại hoa màu 7

Bảng 2 Vị trí hiện diện của Glucoacetobacter diazotrophicus trong các loại cây khác nhau 9

Bảng 3 Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ 28

Bảng 4 Mô tả giá trị đường chuẩn NH4+ 29

Bảng 5 Thành phần của phản ứng PCR 31

Bảng 6 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 32

Bảng 8 Kết quả nhuộm Gram và đặc điểm tế bào của 41 dòng vi khuẩn 38

Bảng 9 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của 41 dòng vi khuẩn 42

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Chu trình nitơ trong tự nhiên 4

Hình 2 Sơ đồ giả thuyết về các con đường của quá trình cố định N2 4

Hình 3 Cấu trúc của một enzyme nitrogenase 5

Hình 4 Vi khuẩn Azospirillum 6

Hình 5 Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus 8

Hình 6 Vi khuẩn Burkholderia 10

Hình 7 Vi khuẩn Klebsiella 12

Hình 8 Cây khoai lang 13

Hình 9 Bản đồ gen nif và vai trò của chúng ở vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 17

Hình 10 Phản ứng PCR 19

Hình 11 Quy trình khử trùng bề mặt mẫu khoai lang 25

Hình 12 Chu kỳ nhiệt của phản ứng khuếch đại gen nifH 31

Hình 13 Chu kỳ nhiệt phản ứng khuếch đại 16S rDNA 33

Hình 14 Sự phát triển của vi khuẩn vi hiếu khí tạo vòng pellicle cách mặt môi trường 2 - 5 mm 34

Hình 15 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được 35

Hình 16 Thống kê đặc điểm hình thái các dòng vi khuẩn phân lập 37

Hình 17 Hình dạng khuẩn lạc của môt số dòng vi khuẩn quan sát ở thời điểm hai ngày sau khi cấy 38

Hình 18 Hình dạng tế bào của vi khuẩn dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần 40

Hình 19 Tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fushin dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần 40

Hình 20 Vi khuẩn phát triển trong môi trường Burk’s không đạm 41

Hình 21 Biểu đồ và đường chuẩn đạm từ 0 - 2,5 mg/l 42

Hình 22 Hàm lượng đạm trung bình qua 2,4 và 6 ngày nuôi của 10 dòng vi khuẩn 44

Hình 23 Vi khuẩn phát triển trong môi trường LB sau 2 ngày nuôi cấy 44

Hình 24 Hình gel điện di sản phẩm PCR với cặp mồi nifH 45

Hình 25 Kết quả tra cứu trên BLAST N của dòng VB35 47

Hình 26 Kết quả so sánh trên BLAST N của dòng VB35 so với dòng Klebsiella sp

Gp22 48

Hình 27 Cây phả hệ phân tích mối quan hệ di truyền của dòng VB35 với các dòng vi

khuẩn khác trên CSDL NCBI 49

CÁC TỪ VIẾT TẮT

BLAST N Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool

NCBI National Center for Biotechnology Information

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Khoai lang (Imopoea patatas) là một trong những cây trồng quan trọng hàng đầu,

góp phần đáng kể vào lượng lương thực cung cấp cho đời sống của con người hằng

năm, ở Việt Nam khoai lang được xếp vào vị trí thứ 3 chỉ sau lúa và ngô Năm 2004,

theo Trung tâm nghiên cứu Khoa học Nông Vận toàn thế giới đã trồng 9,01 triệu ha

khoai lang, riêng ở Việt Nam đạt sản lượng 1,65 triệu tấn Trong đó, năng suất khoai

lang của tỉnh Vĩnh Long luôn cao nhất nước nhờ thổ nhưỡng đặc biệt thích hợp và

trình độ thâm canh của nông dân ngày càng được cải thiện

Trong những nguồn dinh dưỡng cần thiết cho khoai lang, đạm là nguồn dinh

dưỡng quan trọng ảnh hưởng lớn đến năng suất của cây Nguồn đạm cung cấp cho

khoai lang một phần là đạm sẵn có trong đất và một phần do con người bón thêm vào

đất Sử dụng phân đạm hóa học mang lại nhiều lợi ích, chúng giúp thúc đẩy quá trình

tăng trưởng của cây, làm cây ra nhiều nhánh, phân cành, ra lá nhiều, lá cây có kích

thước to và quang hợp mạnh, làm tăng năng suất một cách đáng kể Tuy nhiên, nhu

cầu của con người đối với khoai lang nói riêng và đối với cây lương thực nói chung, về

sản lượng lẫn chất lượng ngày càng đòi hỏi cao hơn và nguồn đạm hóa học bón cho

cây từ đó cũng ngày một tăng theo

Việc lạm dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất

đai ngày càng bạc màu, tình trạng ô nhiễm nguồn nước, đất gây ảnh hưởng trực tiếp

đến sức khỏe của con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy et at.,

2001; Huỳnh Thu Hòa, 2006) Vì vậy, gia tăng phân bón đạm hóa học chỉ là biện pháp

tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi phát sinh nhiều mối lo ngại Đòi hỏi con người

phải suy nghĩ đến những chiến lược để tăng sản lượng mà không gây hại đến sức khỏe,

một trong những chiến lược quan trọng là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất

nông nghiệp để đem lại nguồn thực phẩm an toàn và có giá trị kinh tế cao

Việc tận dụng nguồn đạm sẵn có trong tự nhiên, nghiên cứu và sử dụng phân sinh

học có nguồn gốc từ vi sinh vật đang được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm, trong

đó có Việt Nam

Đạm từ không khí và trong đất được tổng hợp bởi các vi khuẩn cố định đạm,

chúng có khả năng gắn kết trực tiếp hoặc tiếp xúc cố định xung quanh vùng rễ và sử

dụng nguồn nitơ trong không khí chuyển đổi thành dạng mà cây có thể sử dụng được,

chúng sống tự do trong đất, trong vùng rễ hoặc nội sinh trong cây mang lại lợi ích cho

cây (Bashan và de-Bashan, 2005) Đặc biệt, nhiều loài vi khuẩn nội sinh như

Azospirillum, Glucoacetobacter, Herbaspirillum, Klebsiella,…đang được quan tâm

nghiên cứu rộng rãi khắp nơi trên thế giới Đề tài “Phân lập vi khuẩn cố định đạm nội

sinh và ở vùng rễ khoai lang (Ipomoean batatas) trồng tại tỉnh Vĩnh Long” được thực

hiện với mục đích tuyển chọn một số dòng vi khuẩn sống nội sinh hay tự do trong đất

có khả năng cố định đạm cao để làm cơ sở sản xuất ra những loại phân bón sinh học,

giúp cân bằng lại lượng phân hóa học bón vào cây, giảm chi phí sản xuất và hạn chế ô

nhiễm môi trường sống

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập, khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn nội sinh và vi

khuẩn sống ở vùng rễ của cây khoai lang và khảo sát sự hiện diện của gen nifH ở một

số dòng có khả năng cố định đạm cao

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về đạm

2.1.1 Vai trò của đạm đối với cây trồng

Sự tăng trưởng của tất cả vi sinh vật phụ thuộc vào các chất dinh dưỡng khoáng và

quan trọng hơn hết là nitơ, sinh vật cần sử dụng lượng lớn nitơ vì đó là thành phần chủ

yếu của protein, acid nucleic và các thành phần khác của tế bào Trong bầu khí quyển

N2 là thành phần chính chiếm gần 80% Tuy nhiên hầu hết các sinh vật không sử dụng

được N2 bởi vì có liên kết ba giữa hai nguyên tử nitơ tạo nên tính trơ của phân tử

Nguồn đạm mà cây trồng sử dụng được phải ở dạng NH4+ hoặc NO3- (Hubbell và

Kidder, 2003)

Đạm là nguồn dinh dưỡng chủ yếu cho các loại cây trồng Sự hấp thu và đồng hóa

đạm cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng cũng quan trọng không kém so với

quá trình quang hợp (Vance, 1997)

Đạm giữ vai trò quan trọng đối với việc hình thành bộ rễ, thúc đẩy nhanh quá trình

đẻ nhánh, nảy chồi và cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển thân lá Thiếu đạm cây

sinh trưởng còi cọc, trên lá già xuất hiện màu xanh lợt đến vàng nhạt, bắt đầu từ chóp

lá, tiếp đó bị chết hoặc rụng tùy mức độ thiếu Nếu thừa đạm cây thường có màu xanh

đậm, lá nhiều nhưng số rễ hạn chế, phát triển kém (Ngô Thị Đào và Vũ Hữu Yêm,

2005)

2.1.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên

Chu trình nitơ là một quá trình mà theo đó nitơ bị biến đổi qua lại giữa các dạng

hợp chất hóa học của nó Việc biến đổi này có thể được tiến hành bởi cả hai quá trình

sinh học và phi sinh học Quá trình quan trọng trong chu trình nitơ bao gồm sự cố định

nitơ, khoáng hóa, nitrat hóa, và khử nitrat

Thành phần chính của khí quyển (khoảng 78%) là nitơ, có thể xem đó là một bể

chứa nitơ lớn nhất Tuy nhiên, nitơ trong khí quyển có những giá trị sử dụng hạn chế

đối với sinh vật, dẫn đến việc khan hiếm lượng nitơ có thể sử dụng được đối với một

số kiểu hệ sinh thái Chu trình nitơ là một nhân tố đáng chú ý của các nhà sinh thái học

do chúng có thể ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của các quá trình sinh thái chính, như

sản lượng thứ cấp và phân hủy

(http://vi.wikipedia.org/wiki/Chu_trình_nitơ, ngày 17/11/2013)

Hình 1 Chu trình nitơ trong tự nhiên

(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Chu_trình_nitơ , ngày 17/11/2013)

2.1.3 Cơ chế cố định đạm sinh học

Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định đạm cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ

hoàn toàn, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đồng ý với giả thuyết cho rằng đạm là sản

phẩm đồng hóa sơ cấp của N2 và có thể nêu ra giả thuyết về hai con đường cố định

đạm của vi sinh vật sống tự do trong đất như sau:

Hình 2 Sơ đồ giả thuyết về các con đường của quá trình cố định N2

(Nguồn: http://www.sinhk33.com/2013/01/co-che-co-dinh-nito.html , ngày 17/11/2013)

Sự cố định N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo con đường phức tạp hơn

Trong các nốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu

gọi là leghemoglobin Nó sẽ dễ dàng liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin

Leghemoglobin chỉ được tạo thành khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ đậu, còn

khi nuôi cấy các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố định được N2

Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định N2 cho thấy quá trình cố định này đòi

hỏi có sự tham gia của enzyme nitrogenase Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa cho

quá trình này: Enzyme này hoạt động trong điều kiện yếm khí

(http://www.sinhk33.com/2013/01/co-che-co-dinh-nito.html, ngày 17/11/2013)

Cố định đạm sinh học xảy ra khi nitơ trong khí quyển được chuyển thành

amoniac (NH3) bởi một enzyme gọi là nitrogenase (Ngô Thanh Phong, 2010)

Hình 3 Cấu trúc của một enzyme nitrogenase

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrogenase , ngày 17/11/2013)

Quá trình cố định đạm xảy ra trong tế bào vi khuẩn và vi khuẩn lam đều giống

nhau là nhờ chúng có hệ thống gen nif điều khiển quá trình tổng hợp enzyme

nitrogenase Nitrogenase là hệ enzyme xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3 Như

vậy, hệ thống gen nif được xem là hệ thống gen điều khiển cho quá trình cố định đạm

sinh học Tuy nhiên, ở vi khuẩn lam, quá trình cố định đạm không phải xảy ra ở bất kì

tế bào nào mà chỉ có thể xảy ra ở dị bào (Desnoues et al., 2003)

Các loài vi khuẩn cố định đạm sử dụng nitrogenase của chúng nhằm phá vỡ dần

liên kết cộng hóa trị bậc III của nitơ (dạng rất bền) bằng cách gắn thêm dần dần những

proton H+ vào chúng (N≡N) (Sadara et al., 2003)

Quá trình cố định nitơ phân tử theo hai hướng cơ bản: con đường khử và con

đường oxy hóa Qua hai con đường đó người ta thu được kết quả:

- Nếu nồng độ oxy nhiều sẽ ức chế quá trình cố định nitơ phân tử

- Hiệu suất cố định nitơ phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn

những vi sinh vật hiếu khí

2.2 Sơ lược về vi khuẩn cố định đạm sống nội sinh thực vật

Dobereiner và Ruschel (1958) phân lập được loài vi khuẩn Beijerinckia

fluminensis cố định nitơ sống ở vùng rễ cây mía trồng ở vùng nhiệt đới đã cho thấy

một tiềm năng cố định nitơ ở cây họ hòa bản

Những năm gần đây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn sống trong vùng rễ,

trong rễ cây, thân cây và các lá cây không thuộc họ đậu như lúa, bắp, mía, sorghum, và

một số loại cỏ

Các vi khuẩn này giúp cây tăng trưởng tốt hơn và làm gia tăng năng suất hòa tan

lân dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác, sản xuất kích thích tố thực vật

hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng

(Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012)

Vi khuẩn Azospirillum là vi khuẩn Gram

âm, có khả năng chuyển động và có dạng hình

que ngắn, là vi khuẩn cố định đạm thúc đẩy sự

phát triển của cây giúp tăng năng suất cây

trồng, tổng hợp IAA, hòa tan lân dạng khó tan

và các chất dinh dưỡng khác (Bial et al., 1990;

Seshadri et al., 2000; Somers et al., 2005; Lăng

Ngọc Dậu et al., 2007)

Sự tăng sinh của Azospirillum xảy ra dưới cả 2 điều kiện hiếu khí và kỵ khí,

nhưng thích hợp hơn là điều kiện vi hiếu khí với sự hiện diện hoặc không có hợp chất

nitơ trong môi trường (Dobereiner và Pedrosa, 1987) Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển

Hình 4 Vi khuẩn Azospirillum

Nguồn:

của vi khuẩn là 35 - 37oC Những khuẩn lạc Azospirillum trên môi trường khoai tây -

agar có màu hồng nhạt hoặc đậm, thường có nếp gấp và không có chất nhầy, dinh

dưỡng bằng hợp chất hữu cơ Một số dòng Azospirillum là những sinh vật tự dưỡng

không bắt buộc Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên muối của những acid hữu cơ

như maltate, succinate, lactate hoặc pyruvate Fructose và những đường đôi khác cũng

có thể được vi khuẩn sử dụng như là nguồn carbon, vi khuẩn không sử dụng đường

đơn Một số dòng Azospirillum cần biotin cho sự phát triển của chúng Tỷ lệ phần trăm

G + C của DNA là 69 - 71 (Tm) (Krieg et al., 1984)

Bảng 1 Sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum ở một số loại hoa màu

Loài Azospirillum Loại hoa màu Sự hiện diện/ các bộ phận của cây

Cỏ Mía Cây cọ dầu

Rễ, thân, hạt, nhựa nguyên

 Những nghiên cứu về Azospirillum

Ở Mỹ , từ 1984 - 1976 những thí ngiệm cho thấy việc chủng Azospirillum có thể

thay thế 40 kg đạm/ha/năm (Smith et al., 1978) Những nghiên cứu thực địa tiếp theo

(Smith et al., 1984) cho thấy Azospirillum làm tăng sản lượng của Sorghum bicolor và

một giống lai khác loài giữa Pennisetum americanum và Pennisetum purpureum một

cách có ý nghĩa (11 - 24%)

Ở Thái Lan, thí nghiệm được tiến hành trên cây bắp (1984 - 1985) và sản lượng

đã gia tăng từ 15 - 35% và có thể kết luận là việc chủng Azospirillum làm giảm lượng

phân bón sử dụng từ 1/3 - 1/2 (Vasuvat et al., 1986)

Ở Israel, 40 thí nghiệm đã được thực hiện từ 1979 - 1986 trên nhiều loại cây như:

bắp, lúa mì, sorghum,… sử dụng Azospirillum với chất mang than bùn đem lại kết quả

là gia tăng 15 - 20% sản lượng Sorghum bicolor, ở bắp là 20 - 30%, tỷ lệ thành công là

100% ở Panicum miliaceum và Setaria italica (Okon et al., 1988)

Ở Ý, sản lượng lúa mì tăng từ 10 - 40% đã được ghi nhận (Reynders và Vlassak,

1982)

Ở Mexico, sản lượng lúa mì sau khi chủng Azospirillum tăng từ 23% đến 63%

(1986) và từ 24% đến 43% (1987) (Cardona et al., 1988)

Ở Argentina, sản lượng lúa mì tăng 13 - 30% (Caceres et al., 1996)

Các nghiên cứu của Hiệp et al (2005) cho thấy khi sử dụng vi khuẩn

Azospirillum lipoferum chủng cho bắp giúp rễ dài hơn cây đối chứng không chủng vi

khuẩn nhờ đó cây bắp có chủng có thể hấp thu dưỡng chất trong đất tốt hơn đồng thời

được tình cờ phát hiện lần đầu tiên ở cây

mía Vào năm 1988, Cavalcante và

Dobereiner đã báo cáo về một loài vi

khuẩn cố định đạm chịu được acid, sống

trong cây mía và họ gọi đó là vi khuẩn

Acetobacter diazotrophicus Vi khuẩn này

có khả năng cung cấp ra gần một nửa

lượng đạm cố định được cho cây sử dụng

Khi dựa vào trình tự của 16S-rRNA của vi

khuẩn để phân tích Acetobacter

diazotrophicus được đổi tên lại thành Gluconacetobacter diazotrophicus (Yamada Y et

al., 1998) Nhiều dòng vi khuẩn Acetobacter diazotrophicus đã được phân lập trên thế

giới (Bảng 2)

Gluconacetobacter diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm, vi hiếu khí bắt buộc,

chịu được môi trường acid phù hợp cho các loại đất phèn, tế bào có dạng hình que

Hình 5 Vi khuẩn Gluconacetobacter

diazotrophicus

Nguồn:

ngắn thẳng (chiều ngang từ 1-2µm, chiều dọc từ 0,7-0,9µm) Dưới kính hiển vi điện tử

vi khuẩn Glucnoacetobacter diazotrophicus ở dạng tế bào đơn, đôi hoặc dây dài do các

tế bào nối lại mà không có nội bào tử Vi khuẩn này phát triển ở nồng độ sucrose cao

(10%) và pH thấp, đặc biệt có khả năng cố định đạm ở điều kiện ít O2 Nguồn carbon

tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là sucrose ở nồng độ cao 10% và thậm chí ở

nồng độ cao hơn (30%) vi khuẩn vẫn có thể phát triển Bởi vì sucrose không được vận

chuyển hoặc hấp thụ bởi G diazotrophicus nên vi khuẩn sẽ tự tạo ra enzyme ngoại bào

có thể thủy phân sucrose thành fructose và glucose

Bảng 2 Vị trí hiện diện của Glucoacetobacter diazotrophicus trong

các loại cây khác nhau

Ngoài khả năng cố định đạm, người ta còn phát hiện khả năng tạo ra kích thích tố

tăng trưởng (phytohormone) như indole acetic acid (IAA), hòa tan lân và kẽm của vi

khuẩn này Gluconacetobacter diazotrophicus có thể chịu đựng được các loại kháng

sinh như: ampicillin, erythromycine và roxithromycine

Nhờ vào khả năng nội cộng sinh cố định nitơ mà không gây hại cho cây, lại sản

xuất ra hormone thực vật (auxin, gibberellin), có thể hòa tan Zn và phospho

(Madhaiyan et al., 2004) nên G diazotrophicus được xem là một loài vi khuẩn đầy hứa

hẹn, với khả năng cung cấp gần một nửa N cố định được ở dạng hữu ích cho cây Thực

nghiệm ngoài đồng cho thấy lượng N mà G diazotrophicus tạo ra bằng đối chứng có

bón 275 Kg N/ha (Muthukumarasamv et al., 2002)

 Những nghiên cứu về Gluconacetobacter diazotrophicus

Vào năm 1988, Cavalcante và Dobereiner đã phân lập được G diazotrophicus từ

rễ, thân và lá mía trồng ở Brazil; chúng hiện diện trong các khoảng trống gian bào của

tế bào nhu mô Li và Macrae (1991); James et al (1994) cũng đã phân lập được vi

khuẩn này ở mía đường

Hiện nay, người ta đã nghiên cứu và tìm thấy vi khuẩn này hiện diện ở cây cà

phê, khóm, lúa, khoai lang (Salgalo et al., 1997; Hernandez et al., 2000;

Muthukumarasamy et al., 2002)

Gần đây, Prabudoss và Stella (2009) phân lập Gluconacetobacter diazotrophicus

từ rễ, thân, chồi, lá ở mía đường, khoai lang, khóm; vi khuẩn này có khả năng cố định

đạm mạnh mẽ làm tăng sản lượng mía đường, khóm, khoai lang

(Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012)

Vi khuẩn Burkholderia

2.2.3.

 Giới thiệu

Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn Gram

âm, hình que, có đường kính khoảng 1 m, chúng

có thể di chuyển nhờ chiên mao ở đầu (Jesús et

al., 2004) Vi khuẩn Burkholderia sinh trưởng và

phát triển tốt trong điều kiện kị khí hoặc hiếu khí,

nhưng trong môi trường ít oxy thì phát triển tốt

nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi

cấy từ 1 - 4 mm (Paulina et al., 2001) Trong môi

trường nuôi cấy chúng tạo thành khuẩn lạc màu

trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2 - 4 mm, tròn, phẳng hoặc lài (Jesús et al.,

2004)

Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định

đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại

cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella et al., 2003; Chen et al., 2006)

(Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2012)

Hình 6 Vi khuẩn Burkholderia

Nguồn:

http://www.sciencephoto.com/media/1262

 Những nghiên cứu về vi khuẩn Burkholderia

Nhiều nghiên cứu thấy loài Burkholderia cepacia cộng sinh ở rễ bắp (Hebbar,

K.P et al., 1994), bắp trồng ở Châu Âu, rễ lúa và đậu trồng ở Úc (Balandreau

et al., 2001), giúp cây phát triển nhanh (Bevivino et al., 1998), tăng năng suất (Charini

et al., 1998), tăng khả năng kháng bệnh (Hebbar et al., 1996), giảm lượng thuốc trừ sâu

sử dụng (Daubaras et al., 1996)

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy ở rễ bắp trồng ở Pháp được loài Burkholderia

graminus (Viallard et al., 1998) và loài Burkholderia cepacia genomovar III

(Baladnreau et al., 2001)

Ở Italy người ta nghiên cứu sự phát triển của Burkholderia cepacia đối với các

giai đoạn phát triển của cây bắp, kết quả sự phát triển của Burkholderia cepacia không

phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây bắp (Di Cello et al., 1997)

Loài Burkholderia vietnamiensis cũng được tìm thấy ở rễ cây lúa trồng ở miền

Nam Việt Nam, thí nghiệm ở cây lúa chủng Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày

chủng giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, chiều dài rễ tăng 57%, bề mặt lá tăng 30%,

năng suất lúa tăng 13 - 22% Thí nghiệm cũng cho thấy cây lúa được chủng

Burkholderia vietnamiensis và cây lúa trồng ngoài đồng bón phân đạm 25 - 30kg có

năng suất tương đương nhau (Van et al., 2000)

Bramer et al (2001) cũng đã phân lập được loài Burkholderia sacchari từ đất

trồng mía ở Brazil

(Cao Ngọc Điệp, 2011)

2.3 Sơ lược về vi khuẩn cố định đạm sống tự do trong đất

Các giống vi khuẩn sống tự do trong đất thường gặp có khả năng cố định nitơ

bao gồm: Azotobacter, Clostridium và Klebsiella

2.3.1 Vi khuẩn Azotobacter

Vi khuẩn Azotobacter là vi khuẩn hình que, hiếu khí, di động nhờ chiên mao

Giống Azotobacter có 4 loài là A agilis, A beijerinckii, A chroococcum và A

vinelandii

Giống này có tính mẫn cảm với độ pH, nồng độ phosphate cao và với nhiệt độ

trên 35oC Các giống Azotobacter ở môi trường biển hay các giống chịu được mặn rất

hiếm

Azotobacter được tìm thấy ở vùng rễ của một số cây Chúng có thể sản xuất ra

chất kích thích tăng trưởng giống như hormone Nhiều nước đã sản xuất phân bón vi

sinh có chứa vi khuẩn Azotobacter đã được phổ biến sử dụng dưới dạng bột khô như

Amrutham ở Ấn Độ hay dạng dịch lỏng như Azotobacter

(Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp 2012)

2.3.2 Vi khuẩn Clostridium

Giống này bao gồm các vi khuẩn hình que, kỵ khí, di động nhờ chiên mao, có

khả năng tạo nội bào tử Các loài thường gặp của giống Clostridium là Clostridium

perfringens và Clostridium pasteurianum

(Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp 2012)

2.3.3 Vi khuẩn Klebsiella

Vi khuẩn Klebsiella  - Proteobacteria, là

vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc Có hai loài quan trọng là

Klebsiella pneumonia và Klebsiella oxytoca

Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên

trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định đạm trong các điều kiện kỵ khí

Vi khuẩn Klebsiella oxytoca dòng

SG - 11 được phân lập từ rễ lúa, chúng có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm từ nitơ không khí và sinh tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ

trình indole - 3 - pyruvic acid của chúng

 Những nghiên cứu về vi khuẩn Klebsiella

Ở Ấn Độ, Jha và Kumar (2007) nghiên cứu vi khuẩn K oxytoca dòng GR - 3

được phân lập từ rễ và thân của cây cỏ đuôi mèo (Typha australis) thì nhận thấy chúng

có mật số ở rễ là 6.106 CFU.g-1, khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan là 30

g/mg trọng lượng khô, khả năng hòa tan lân khó tan là 31,5 g/mg trọng lượng khô,

và mức độ biểu hiện hoạt tính của phức hệ nitrogenase qua phản ứng khử acetylene là

Hình 7 Vi khuẩn Klebsiella

Nguồn:

khá cao (1,25molC2H4/mg protein h-1) Sau đó, các nhà nghiên cứu sử dụng vi khuẩn

K oxytoca dòng GR - 3 chủng cho giống lúa Malviya dhan - 36 thì nhận thấy vi khuẩn

này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll - a có hiệu quả;

đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây

(Cao Ngọc Điệp, 2011)

2.4 Giới thiệu sơ lược về cây khoai lang

2.4.1 Phân loại khoa học

Họ Convolvulaceae Danh pháp hai phần Ipomoea batatas L

2.4.2 Giới thiệu

Khoai lang là một loài cây nông nghiệp

với các rễ củ lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị

ngọt, được gọi là củ khoai lang và nó là một

nguồn cung cấp rau ăn củ quan trọng, được sử

dụng trong vai trò của cả rau lẫn lương thực

Các lá non và thân non cũng được sử dụng

như một loại rau

Đây là một loài cây thân thảo dạng dây

leo sống lâu năm, có các lá mọc so le hình tim

hay xẻ thùy chân vịt, các hoa có tràng hợp và

kích thước trung bình Rễ củ ăn được có hình

dáng thuôn dài và thon, lớp vỏ nhẵn nhụi có

màu từ đỏ, tím, nâu hay trắng Lớp cùi thịt có màu từ trắng, vàng, cam hay tím

Khoai lang có rất nhiều loại:

- Có loại củ to, vỏ trắng, ruột trắng hoặc ruột vàng sẫm, có nhiều chất tinh bột

- Khoai lang bí: là loại củ dài, vỏ đỏ, ruột vàng tươi

- Khoai lang Nhật: vỏ đỏ, ruột vàng rất thơm, ngon

- Khoai lang ngọc nữ: vỏ tím, ruột tím….và nhiều loại khoai lang khác

(http://vi.wikipedia.org/wiki/Khoai_lang, ngày 02/08/2013)

Hình 8.Cây khoai lang

Nguồn:

vat-hoc/thuc-vat/25551_Nhung-loai-cay- luong-thuc-chinh-cua-the-gioi.aspx , (Ngày

http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh-23/06/2013)

2.4.2 Nguồn gốc và tình hình sản xuất

 Nguồn gốc và phân bố

Khoai lang có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới châu Mỹ, nó được con người trồng

cách đây trên 5.000 năm Nó được phổ biến rất sớm trong khu vực này, bao gồm cả

khu vực Caribe Nó cũng đã được biết tới trước khi có sự thám hiểm của người

phương tây tới Polynesia Nó được đưa tới đây như thế nào là chủ đề của các cuộc

tranh luận dữ dội, có sự tham gia của các chứng cứ từ khảo cổ học, ngôn ngữ học và di

truyền học

Khoai lang phân bố chủ yếu tập trung ở các nước châu Á (Trung Quốc, Việt

Nam, Indonesia, Philipines, India), là những nước sản xuất khoai lang quan trọng; ở

Đông Phi có một số nước trồng khoai lang đáng chú ý như Uranda, Rwanda, Burundi,

Kenya

 Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai lang trên thế giới

Trong tất cả các cây trồng chính, khoai lang đứng vị trí thứ 10 về diện tích,

nhưng tính riêng cây có củ: khoai tây, củ cải đường, sắn… thì khoai lang đứng thứ 3

sau khoai tây và sắn Về sản lượng, theo FAO năm 1999 khoai lang chiếm diện tích

không lớn (8,9 triệu ha) nhưng lại có một sản lượng tương đối cao (129,2 triệu tấn),

đứng ở vị trí thứ 9 trong các loại cây trồng chính Điều này cho thấy cây khoai lang có

tầm quan trọng và vị thế nhất định trong nền sản xuất nông nghiệp của thế giới

Đến năm 2008, toàn thế giới có 111 nước trồng khoai lang (FAO 2009) trên diện

tích 8,17 triệu ha, trong đó 95% tại các nước đang phát triển, năng suất bình quân

13,46 tấn/ha, sản lượng 110,13 triệu tấn (so với năm 2005 là 123,27 triệu tấn và năm

1961 là 98,19 triệu tấn)

 Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai lang ở Việt Nam

Khoai lang là cây lương thực trồng lâu đời ở Việt Nam, xếp hàng thứ 3 sau cây

lúa, cây ngô và là nước có diện tích khoai lang đứng hàng thứ 6 trên thế giới sau Trung

Quốc, Mỹ, Urandda, Nigeria và Tanzania Sản lượng khoai lang của Việt Nam đạt

1,32 triệu tấn, đứng thứ năm toàn thế giới sau Trung Quốc (85,21 triệu tấn), Nigeria

(3,31 triệu tấn), Uganda (2,70 triệu tấn) và Indonesia (1,87 triệu tấn) Năm 2005, cả

nước có 188,400 ha năng suất bình quân đạt 7,75 tấn/ha, sản lượng đạt 1,46 triệu tấn

(năng suất thấp hơn so với bình quân chung của thế giới là 14,0 tấn/ha)

Hiện nay, cây khoai lang được phân bố rộng rãi ở nước ta Ở vùng núi, Trung du

Bắc Bộ, Duyên hải Miền Trung, Châu thổ sông Hồng, Tây Nguyên và vùng Đồng

bằng sông Cửu Long khoai lang luôn có mặt trong nhiều cơ cấu luân canh của nhiều

vùng đất

Thị trường xuất khẩu khoai lang của Việt Nam dự báo thuận lợi và có lợi thế

cạnh tranh cao do có nhu cầu về chế biến khoai lang xuất khẩu các loại thức ăn gia

súc Diện tích khoai lang của Việt Nam dự kiến ổn định khoảng 188,4 nghìn ha nhưng

sẽ tăng năng suất và lượng khoai lang bằng cách chọn tạo và phát triển các giống khoai

lang tốt có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy

trình kỹ thuật canh tác khoai lang bền vững và thích hợp vùng sinh thái, đảm bảo thu

nhập cho người dân

(

http://www.doko.vn/luan-van/danh-gia-tinh-hinh-san-xuat-va-tieu-thu-khoai-lang-nhat-ban-tai-mot-so-xa-thuoc-huyen-nho-quan-tinh-ninh-binh-160440, ngày

02/08/2013)

Giá trị dinh dưỡng

Trong củ khoai lang bao gồm một lượng lớn tinh bột, các acid amin, beta

carotene, vitamin C, B1 và hơn 10 loại nguyên tố vi lượng cần thiết cho sức khỏe con

người như canxi, phospho, kẽm, sắt, magie, natri, kali,… Vì vậy, các chuyên gia dinh

dưỡng đã gọi khoai lang là loại “thực phẩm cân bằng dinh dưỡng nhất”

Hàm lượng sắt trong các loại khoai lang đều cao (giống khoai lang màu cam),

ngoài ra khoai lang còn chứa khá nhiều chất kẽm (giống khoai lang màu trắng và màu

cam) Kẽm và sắt là 2 chất rất thiếu trong gạo, chẳng những thế, trong gạo còn có chất

phytase ngăn cản hấp thu sắt và kẽm của các loại thực phẩm khác trong ruột, nên ăn

độn trong thời kỳ kinh tế khó khăn cũng có cơ sở khoa học về mặt dinh dưỡng Ngoài

ra khoai lang còn có khá nhiều canxi và kali

Các vi chất có trong khoai lang khá dồi dào, ăn khoai lang đơn thuần bảo đảm

cung cấp thừa lượng vitamine A, đáp ứng 28% nhu cầu vitamine C, 25% chất

manganese, 16% chất đồng, xơ và vitamine B6, 8% chất sắt và kali Khoai lang có

khối lượng đường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng lượng cao hơn so với lúa mì,

lúa nước và sắn Cùng với gạo, khoai lang và bắp là hai cây lương thực chính ở nước

ta Trong những năm khó khăn về lương thực, khoai lang trở thành cây cứu đói cho

làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần đây đang được nghiên

cứu làm màng phủ sinh học (bioplastic)

(http://www.rauhoaquavietnam.vn/printversion.aspx?ContentID=947,ngày

02/08/2013)

Khám phá gần đây cho thấy trong khoai lang có chứa nhiều chất chống ô-xy hóa

ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư, chống lão hóa và làm sạch các chất bẩn

trong mạch máu Bao gồm các hợp chất phenol, anthocyanin (có nhiều trong khoai

lang tím), carotenoid, trong đó khoai lang tím chứa nhiều chất chống ô-xy hóa tổng số

nhất, kế đến là khoai lang hồng và khoai lang bí Đó là lý do ở Nhật lấy khoai lang tím

và khoai lang bí để làm nước ép, loại nước uống của thực phẩm chức năng

Ngoài ra, củ và rau khoai lang có còn những giá trị chữa bệnh nên từ lâu trong

dân gian có nơi còn gọi khoai lang là "Sâm nam"

(

http://doc.edu.vn/tai-lieu/tieu-luan-tim-hieu-ve-khoai-lang-va-quy-trinh-san-xuat-tinh-bot-khoai-lang-11454/, ngày 02/08/2013)

2.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu

và đưa về dạng thuần khiết Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc

nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật

được tạo ra từ một tế bào ban đầu

Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại

dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hóa

hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần

khiết

Nguyên tắc phân lập: Tách rời tế bào vi sinh vật; Nuôi các tế bào bên trong môi

trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau Các bước tách

vi sinh vật để tạo dòng thuần được thực hiện như sau:

- Dùng kim cấy mềm lấy một ít vi sinh vật từ khuẩn lạc

- Trải vi sinh vật (đường thứ nhất)

- Vẽ đường thứ hai cắt ngang đường thứ nhất (đường cấy ngoằn ngoèo hoặc đường

cấy thẳng

- Hơ lửa kim cấy, tiếp tục vẽ đường thứ ba cắt ngang đường thứ hai

- Vi sinh vật được kéo rời rạc qua các đường cấy và cuối đường thứ ba sẽ còn vài

tế bào rời sẽ phát triển thành khuẩn lạc độc lập

- Trong trường hợp mật số vi sinh vật quá nhiều, hoặc đối với những vi khuẩn có

liên kết chặt chẽ khó tách ròng, chúng ta phải pha loãng mật số vi khuẩn rồi hút

một thể tích nhất định cho vào đĩa petri, sau đó thực hiện giống các thao tác trên

để thu được khuẩn lạc ròng

(Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)

2.6 Sơ lược về gen nif

Gen nif được tìm thấy ở các loài vi sinh vật có khả năng cố định đạm sống tự do

và sống nội sinh, chúng tồn tại ở cả hai dạng gen trội và gen lặn Một số gen nif được

biết đến là: nif A, D, L, K, F, H, U, Y, W, Z

Gen nifH là gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình cố định nitơ khí

quyển thành dạng nitơ có sẵn cho cây trồng Tiền enzyme được mã hóa bởi gen nifH là

phức hợp nitrogenase, có vai trò chuyển đổi nitơ trong không khí thành các dạng nitơ

khác mà cây trồng có thể sử dụng được

Hình 9 Bản đồ gen nif và vai trò của chúng ở vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

Ngoài việc mã hóa các enzyme thì gen nif cũng có khả năng mã hóa một số

protein điều hòa liên quan đến cố định đạm Quá trình biểu hiện của gen nif được kích

hoạt khi nồng độ nitơ cố định và nồng độ oxy thấp

Ở phần lớn thực vật, việc kích hoạt quá trình mã hóa gen nif được thực hiện bởi

protein A cảm ứng với nitơ Khi lượng nitơ không đủ cho cây sử dụng, NtrC – một loại

ARN polymerase sẽ kích hoạt sự biểu hiện của nifA và nifA sẽ tiếp tục kích thích mã

hóa các gen còn lại Khi có đủ nitơ hoặc có sự hiện diện của oxy, một loại protein khác

sẽ kích hoạt gen nifL và nifL sẽ ức chế hoạt động của gen nifA dẫn đến việc ức chế

nitrogenase NifL được điều hòa bởi protein glnD và glnK

Gen nif cũng được tìm thấy trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn (nhưng đôi khi lại

được phát hiện trong plasmid), cùng với các gen khác tham gia vào quá trình tổng hợp

protein

(www.ajol.info/index.php/ajb/article/viewFile/68763/56829, ngày 02/08/2013)

2.7 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

PCR được viết tắt từ cụm từ Polymerase Chain Reaction, là một kỹ thuật trong

sinh học phân tử dùng để khuếch đại một hay nhiều đoạn DNA lên nhiều lần để tạo ra

một số lượng lớn bản copy của đoạn DNA ban đầu

Được phát triển từ năm 1983 bởi Kary Mullis, kỹ thuật PCR đã được ứng dụng

mạnh mẽ vào các ngành y dược và nhiều ngành nghiên cứu sinh học khác

Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai mồi chuyên biệt

nhờ enzyme DNA polymerase sau nhiều chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi tách thành 2 sợi

đơn Nhiệt độ tăng lên 94 - 96oC để tách hai sợi DNA ra Bước này gọi là biến

tính, nhiệt độ tăng lên sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA Trước chu kỳ

1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và

mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian ở giai đoạn này

khoảng 1 - 2 phút

- Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung

Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi

DNA đơn Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn

nhiệt độ biến tính khoảng 45 - 60oC Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn

đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy

tiện Thời gian bắt cặp từ 1 - 2 phút

- Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc

DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc

theo sợi DNA Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài

mảnh DNA cần khuếch đại Như một quy tắc 1000bp/1 phút

Các đoạn DNA mới dược hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp

cho các chu kỳ tiếp theo

Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính

theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n-1

(Trần Nhân Dũng et al., 2012)

Hình 10 Phản ứng PCR

(Nguồn: http:// users.ugent.be , 23/06/2013)

 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR:

- Nước: phải thật tinh khiết, không chứa bất kì một thành phần nào khác

- Buffer: hiệu suất của enzyme polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng

Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với enzyme do nhà sản

xuất khuyến cáo

- dNTP (deoxy nucleotide triphosphate): lượng DNA tối ưu là 200l cho mỗi loại

dNTP Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm so với việc hiệu

chỉnh các yếu tố khác

- DNA khuôn (DNA template): phải thật tinh sạch

- Nồng độ Mg2+: tăng nồng độ Mg2+ có thể làm xuất hiện các sản phẩm không đặc

hiệu Thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp Nồng độ Mg2+ phụ

thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template và thành phần buffer

- Số lượng chu kỳ phản ứng: từ 25 - 40 chu kỳ, khi vượt quá sẽ phân hủy và cạn

kiệt thành phần phản ứng, xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao

có thể bắt cặp với nhau

(http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR, ngày 2/08/2013)

2.8 Kỹ thuật điện di DNA

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic

Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở pH trung tính) nên

khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường

Hai loại gel được sử dụng trong điện di là agarose và polyacrylamide Nồng độ

agarose trong dung dịch đệm thường là 0,6 - 2,5%, đây là loại gel thông dụng nhất,

một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước

trong khoảng 0,5 - 20kb Gel polyacrylamide dùng để phân tách các đoạn có kích

thước dưới 1000bp Dung dịch đêm dùng trong kỹ thuật điện di thường là TAE, TE,

TBE…

Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một

điện áp vào đó Trạng thái đó được duy trì cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (thường

là xanh bromphenol) chạy tới cuối gel

Các acid nucleic trong gel agarose sẽ hiện band dưới tia tử ngoại (UV = 300nm)

nhờ Ethidium Bromide được cho vào trước khi đổ gel

(Nguyễn Thị Kiều Diễm, 2012)

2.9 Giải trình tự DNA

Kỹ thuật giải trình tự DNA (DNA sequencing) là kỹ thuật xác định tất cả các hợp

phần do nucleotide hình thành nên phân tử DNA chuyên tính nào đó Khả năng đọc

được chuỗi mã DNA gắn liền với nhiệm vụ trung tâm của công nghệ sinh học phát

triển Những kỹ thuật giải trình tự DNA cũng chỉ mới được hoàn thiện trong những

năm gần đây Các công trình đầu tiên được công bố của Maxam và Gilbert (1975),

Fred Ganger et al (1977) Nhưng trong hơn hai mươi năm qua, kỹ thuật này được cải

tiến rất nhiều Đặc biệt với sự trợ giúp của máy tính, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ của

PCR… phương pháp giải trình tự trở thành công cụ rất có giá trị làm nền tảng cho

phân tích bộ gen (genome) (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005)

2.9.1 Giải trình tự gen 16S rDNA bằng hệ thống tự động

Đoạn gen 16S rDNA ở vi khuẩn là một công cụ hữu ích để phân loại và định

danh vi khuẩn Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, vùng gen 16S

rDNA có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng

trình tự khác nhau giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi khuẩn, đặc biệt là

thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ có kích thước vừa phải (1500 bp) thuận tiện cho

việc giải trình tự

Máy giải trình tự ABI 3130 hoạt động theo nguyên tắc của phương pháp dideoxy

của Fred Sanger, tức là trong quá trình chạy PCR, mạch DNA đang được tổng hợp,

nếu gặp dideoxy nucleotide thì bị dừng lại và các dòng nucleotide được tạo ra có độ

dài khác nhau Với máy giải trình tự, chúng ta sử dụng vật liệu đánh dấu là 4 màu

huỳnh quang gắn vào các ddNTP’s Hệ thống đọc huỳnh quang của máy sẽ ghi nhận

các tín hiệu từ các màu huỳnh quang của các đoạn DNA đã được đánh dấu Và như

vậy chúng ta cũng thu được những đoạn DNA với chiều dài dài ngắn khác nhau

Với thời gian thực hiện nhanh và tương đối chính xác, việc giải trình tự DNA

bằng hệ thống tự động đã giúp biết được cụ thể trình tự của đoạn gen đến từng

nucleotide, giúp cho việc phân tích đa dạng di truyền các giống, các loài được dễ dàng,

thuận lợi hơn

Ngày nay, với sự ra đời của hệ thống giải trình tự DNA tự động đã góp phần đáng

kể vào công việc phân tích đa dạng di truyền giữa các giống loài bổ sung cho các

phương pháp trên hoàn chỉnh hơn

(Trần Nhân Dũng et al., 2012)

2.9.2 So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA với cơ sở dữ liệu

Theo Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh (2011), hai giải thuật tìm kiếm cơ sở

dữ liệu phổ biến nhất hiện nay trên thế giới là BLAST và FASTA, trong đó giải thuật

BlAST (Basic Local Alignment Search Tool) được đánh giá nhanh hơn và đang sử

dụng rộng rãi BLAST tìm kiếm những trình tự bắt cặp có điểm số cao giữa chuỗi truy

vấn và các chuỗi trong cơ sở dữ liệu Giải thuật BLAST được thực hiện qua các

chương trình BLAST P, BLAST N, BLAST X, TBLAST N, TBLAST X của National

Center for Biotechnology Information (NCBI) Có trên 500 cơ sở dữ liệu sinh học,

trong đó cơ sở dữ liệu NCBI của Mỹ là được dùng phổ biến nhất

Theo Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Hữu (2008), hai chuỗi trình tự DNA được

xem là tương đồng khi có một phần chung Cách tốt nhất để tìm sự tương đồng là sử

dụng chương trình BLAST và theo tiêu chuẩn ít nhất 70% đồng nhất trên 100 base

hoặc giá trị E-value thấp hơn 10-4

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện

3.1.1 Địa điểm thực hiện

Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện NC & PT Công nghệ sinh học, Trường

Đại học Cần Thơ

3.1.2 Thời gian thực hiện

Từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013

3.1.3 Nguyên liệu

Mẫu khoai lang được lấy ở huyện Bình Tân tỉnh Vĩnh Long Các bộ phận dùng để

trích vi khuẩn gồm rễ, lóng thân, lá và lấy kèm theo đất vùng rễ Ghi lại địa điểm và

ngày thu mẫu trên túi đựng mẫu, sau đó đem về phòng thí nghiệm tiến hành trích vi

khuẩn trong cây và trong đất

3.1.4 Trang thiết bị

- Đĩa petri

- Ống nghiệm 10ml

- Các loại ống tuýp 0,2ml, 1,5ml và 2,2ml

- Cốc thủy tinh, ống đong, đèn cồn, que cấy

- Đầu col xanh, vàng, trắng

- Kính hiển vi, kẹp, lame, lamelle

- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P200, P1000

- Găng tay, túi nylon đựng mẫu

- Kim cấy các loại, dụng cụ trải mẫu bằng thủy tinh

- Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge

- Kính hiển vi

- pH kế Orion 420A (Mỹ)

- Tủ ủ vi sinh vật Incuall III (Đức)

- Tủ lạnh trữ mẫu International (Nhật Bản)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức), Tuttnaeur 3870 MLV (Đức)

- Cân điện tử Sartorius TE 612 (Đức)

- Tủ sấy (EHRET) (Đức), tủ hút, máy trộn mẫu Vortex

- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)

- Tủ cấy vi sinh vật Flow Cabinet 125B-81804 (Pháp)

- Máy khuấy từ yellow MAG HS 7

- Máy đo OD GENESYS 10TM

- Hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ) và bộ điện di một chiều

Embi-Tee (Hoa Kỳ)

3.1.5 Hóa chất

 Hóa chất khử trùng mẫu: Nước cất khử trùng, cồn 70o, Tween 20, oxy già,…

 Hóa chất dùng để quan sát sự chuyển động và nhuộm Gram vi khuẩn: Nước cất

khử trùng, iod, fushin, Crystal violet, cồn 70o

 Hóa chất dùng để đo đạm bằng phương pháp Indolphenol blue

 Hóa chất dùng trong điện di sản phẩm PCR: agarose 1,5%, TBE buffer 1X,

loading buffer, Ethidium Bromide, thang chuẩn 100bp

3.2 Phương pháp

3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh và ở vùng rễ khoai lang trên môi trường

LGIP không đạm

a Phân lập vi khuẩn

 Khử trùng bề mặt mẫu: Đối với mẫu khoai lang thu về

- Rửa thật sạch bùn đất, để ráo tự nhiên (để riêng từng bộ phận) Nếu chưa phân

lập ngay thì để riêng các bộ phận trong túi nylon buộc chặt và bảo quản trong tủ

lạnh ở 5oC

- Khử trùng nước cất, bình tam giác (để đựng mẫu khử), eppendorf, đầu col xanh,

col vàng, môi trường LGIP bán đặc (không đạm), cối, chày, bình tam giác Việc

khử trùng mẫu được thực hiện trong điều kiện vô trùng

 Cắt mẫu thành những đoạn nhỏ dài khoảng 2 - 3cm (để riêng các bộ phận) Rửa

thật sạch dưới vòi nước

 Cho mẫu vào bình tam giác đã khử trùng để tiến hành khử trùng bề mặt mẫu theo

quy trình:

Hình 11 Quy trình khử trùng bề mặt mẫu khoai lang

 Phân lập vi khuẩn

 Vi khuẩn vùng rễ:

- Cân 10g mẫu đất thêm 90ml nước cất khử trùng cho vào bình tam giác, khuấy

trộn đều mẫu bằng máy khuấy từ trong 1 giờ, để yên 30 phút

- Pha loãng 10o, 10-1, 10-2, 10-3

- Tiến hành trải mẫu trong tủ cấy vô trùng:

 Môi trường đặc: Hút 50µl dịch mẫu cho vào môi trường LGIP đặc trong đĩa

petri (Đã chuẩn bị từ trước) Tiến hành trải mẫu bằng que cấy thủy tinh Sau đó

tiến hành cấy phân lập

 Môi trường bán đặc: Hút 50µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường LGIP

bán đặc trong ống nghiệm Đậy nắp lại và dùng tay se mạnh ống nghiệm Cho

vào tủ ủ, ủ ở 30oC Sau 2 – 3 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu sáng (vòng

pellicle), cách bề mặt môi trường 2 – 5 mm (Tran Van Van et al., 1997) Sau đó,

chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc: hút 2 - 5µl dung

dịch từ vòng pellicle cho vào đĩa petri có môi trường LGIP đặc, từ đó cấy phân

lập (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002), ủ ở 30oC

Ngâm mẫu trong nước rửa chén + Tween 20 trong 10 phút

 Vi khuẩn nội sinh

- Cho khoảng 2g mẫu cho vào cối giã nhuyễn, thêm 0,5 – 2ml nước cất vô trùng

vào cối, để yên 10 phút và hút lấy phần trong cho vào tuýp

- Để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và hút 100µl phần trong và cho vào

900µl nước cất; có nghĩa là đã pha loãng 10 lần, tiến hành pha loãng 10-1, 10-2,…

nếu cần thiết

- Tiếp tục phân lập trên môi trường đặc và bán đặc giống như ở trên đối với vi

khuẩn vùng rễ (tr 25)

 Sau 2 – 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy

để cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi

khuẩn đã ròng

 Trữ giống: Khi vi khuẩn đã ròng thì cấy trữ trên ống nghiêng chứa môi trường

đặc tương ứng, trữ ở 4oC và được xem là một dòng ròng

b Quan sát hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn

Khi các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các

dạng khuẩn lạc như bao gồm các chỉ tiêu về: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa

khuẩn lạc bằng mắt thường Phương thức tiến hành quan sát và mô tả hình thái dựa

trên giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp

(2002)

- Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn, không đều, hình rễ cây và hình thoi

- Bìa khuẩn lạc: bìa nguyên, bìa gợn sóng, bìa chia thùy, bìa răng cưa và bìa sợi

- Độ nổi của khuẩn lạc: phẳng, lài, mô và cầu chồng

- Màu sắc khuẩn lạc: đục, trong, vàng, cam, xám, đen…

- Bề mặt khuẩn lạc: ướt, khô

c Quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn

Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự

chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ

phóng đại 400 lần Tương tự, cách tiến hành quan sát và mô tả cũng được thực hiện

dựa trên giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu

Hiệp (2002)

Các bước chuẩn bị mẫu vi khuẩn để quan sát dưới kính hiển vi:

- Nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên lame

- Hơ nóng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

- Dùng kim cấy lấy một ít mẫu vi khuẩn từ khuẩn lạc trải đều lên giọt nước

- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc

với lame một góc 45o, rồi hạ lamen xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho mẫu vật

không có bọt khí

- Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần

d Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn

- Lấy 10 µl nước cất vô trùng nhỏ lên kính mang vật

- Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi sinh vật trải đều lên kính

- Hơ mẫu vật trên ngọn đèn cồn, cố định vi sinh vật

- Nhỏ 1-2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều khoảng 2 phút

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô

- Rửa mẫu bằng cồn 70% đến khi mất hết màu tím

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô vài giây

- Nhỏ 1-2 giọt Fushin, trải đều, để yên 1 phút

- Rửa lại nước cất vô trùng đến khi mất hết màu Fushin

- Dùng giấy thấm chấm nhẹ khô nước

- Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 và 1000 lần

 Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: vi khuẩn Gram dương vì vách tế bào ăn

màu Crystal violet nên có màu tím xanh

 Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: vi khuẩn Gram âm do không còn màu

của Crystal violet nên có màu hồng của Fushin

3.2.2 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được

Cấy chuyển tất cả các dòng vi khuẩn nội sinh và sống tự do trong đất sang môi

trường Burk không đạm đặc và ủ ở 30oC, theo dõi từ 1 – 2 ngày (Cao Ngọc Điệp,

2011) Sau đó tiến hành khảo sát khả năng cố định đạm của chúng trên môi trường

Burk không đạm lỏng bằng phương pháp Indophenol blue (Page et al., 1982)

 Nguyên tắc

Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng giữa phenol và NH3 với sự hiện diện của

tác nhân oxy hóa là hypocloride hình thành phức có màu xanh dưới điều kiện pH

kiềm Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3

và phenol lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982)

 Chuẩn bị hóa chất

- Phenol (C5H5OH) – Nitroprusside (Na2Fe(CN)5NO(2H2O)): Hòa tan 5g phenol

và 0,025g nitroprusside trong nước cất cho đủ thể tích 500ml

- Sodium hypochloride: Hòa tan 100/Cml dung dịch Sodium hypocloride và 15g

NaOH trong nước cất cho đủ thể tích 1 lít (C: nồng độ Chlorine trong dung dịch

hypocloride)

- Dung dịch chuẩn NH4+ (1mg/l)

 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn

Dùng que cấy lấy một phần sinh khối vi khuẩn đã được phân lập ròng lần lượt

cho vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường Burk (không đạm) dạng lỏng và ủ ở nhiệt

độ phòng trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 3 ngày Để đảm bảo lượng vi

khuẩn được chủng vào môi trường tương đối đều nhau cần chú ý thao tác khi lấy mẫu

 Chuẩn bị mẫu

Chủng 1ml vi khuẩn gốc được nuôi ở trên vào các ống falcon 50ml có chứa 10

ml môi trường Burk (không đạm) lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, mỗi

nghiệm thức lặp lại 3 lần (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007)

 Các bước tiến hành

Bước 1: Xây dựng đường chuẩn NH4+

Sử dụng 6 ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 0 đến 5, lần lượt thêm vào mỗi ống các

thành phần như Bảng 3, hút hóa chất theo đúng thứ tự từ trên xuống dưới

Bảng 3 Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+

Như vậy, các ống nghiệm số 0, 1, 2, 3, 4, 5 có hàm lượng NH4+ là 0; 0,5; 1; 1,5;

2; 2,5 mg/ml Tiến hành vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng khoảng 15 – 30