LGIP không đạm.
a. Phân lập vi khuẩn
Khử trùng bề mặt mẫu: Đối với mẫu khoai lang thu về.
- Rửa thật sạch bùn đất, để ráo tự nhiên (để riêng từng bộ phận). Nếu chưa phân lập ngay thì để riêng các bộ phận trong túi nylon buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh ở 5oC.
- Khử trùng nước cất, bình tam giác (để đựng mẫu khử), eppendorf, đầu col xanh, col vàng, môi trường LGIP bán đặc (không đạm), cối, chày, bình tam giác. Việc khử trùng mẫu được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Cắt mẫu thành những đoạn nhỏ dài khoảng 2 - 3cm (để riêng các bộ phận). Rửa thật sạch dưới vòi nước.
Cho mẫu vào bình tam giác đã khử trùng để tiến hành khử trùng bề mặt mẫu theo quy trình:
Hình 11. Quy trình khử trùng bề mặt mẫu khoai lang
Phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn vùng rễ:
- Cân 10g mẫu đất thêm 90ml nước cất khử trùng cho vào bình tam giác, khuấy trộn đều mẫu bằng máy khuấy từ trong 1 giờ, để yên 30 phút.
- Pha loãng 10o, 10-1, 10-2, 10-3.
- Tiến hành trải mẫu trong tủ cấy vô trùng:
Môi trường đặc: Hút 50µl dịch mẫu cho vào môi trường LGIP đặc trong đĩa petri (Đã chuẩn bị từ trước). Tiến hành trải mẫu bằng que cấy thủy tinh. Sau đó tiến hành cấy phân lập.
Môi trường bán đặc: Hút 50µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường LGIP bán đặc trong ống nghiệm. Đậy nắp lại và dùng tay se mạnh ống nghiệm. Cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 – 3 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu sáng (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 – 5 mm (Tran Van Van et al., 1997). Sau đó, chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc: hút 2 - 5µl dung dịch từ vòng pellicle cho vào đĩa petri có môi trường LGIP đặc, từ đó cấy phân lập (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002), ủ ở 30oC.
Ngâm mẫu trong nước rửa chén + Tween 20 trong 10 phút
Rửa sạch bằng nước cất
Cồn 70o trong 5 phút
H2O2 trong 3 phút
Vi khuẩn nội sinh
- Cho khoảng 2g mẫu cho vào cối giã nhuyễn, thêm 0,5 – 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút và hút lấy phần trong cho vào tuýp.
- Để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và hút 100µl phần trong và cho vào 900µl nước cất; có nghĩa là đã pha loãng 10 lần, tiến hành pha loãng 10-1, 10-2,… nếu cần thiết.
- Tiếp tục phân lập trên môi trường đặc và bán đặc giống như ở trên đối với vi khuẩn vùng rễ (tr 25).
Sau 2 – 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy để cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng.
Trữ giống: Khi vi khuẩn đã ròng thì cấy trữ trên ống nghiêng chứa môi trường đặc tương ứng, trữ ở 4oC và được xem là một dòng ròng.
b. Quan sát hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn
Khi các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc như bao gồm các chỉ tiêu về: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Phương thức tiến hành quan sát và mô tả hình thái dựa trên giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
- Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn, không đều, hình rễ cây và hình thoi.
- Bìa khuẩn lạc: bìa nguyên, bìa gợn sóng, bìa chia thùy, bìa răng cưa và bìa sợi. - Độ nổi của khuẩn lạc: phẳng, lài, mô và cầu chồng.
- Màu sắc khuẩn lạc: đục, trong, vàng, cam, xám, đen… - Bề mặt khuẩn lạc: ướt, khô.
c. Quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Tương tự, cách tiến hành quan sát và mô tả cũng được thực hiện dựa trên giáo trình thực tập vi sinh vật đại cương của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Các bước chuẩn bị mẫu vi khuẩn để quan sát dưới kính hiển vi: - Nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên lame.
- Hơ nóng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy lấy một ít mẫu vi khuẩn từ khuẩn lạc trải đều lên giọt nước.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc với lame một góc 45o, rồi hạ lamen xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho mẫu vật không có bọt khí.
- Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần.
d. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn
- Lấy 10 µl nước cất vô trùng nhỏ lên kính mang vật
- Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi sinh vật trải đều lên kính - Hơ mẫu vật trên ngọn đèn cồn, cố định vi sinh vật
- Nhỏ 1-2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều khoảng 2 phút - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô.
- Rửa mẫu bằng cồn 70% đến khi mất hết màu tím - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô vài giây - Nhỏ 1-2 giọt Fushin, trải đều, để yên 1 phút
- Rửa lại nước cất vô trùng đến khi mất hết màu Fushin - Dùng giấy thấm chấm nhẹ khô nước.
- Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 và 1000 lần.
Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: vi khuẩn Gram dương vì vách tế bào ăn màu Crystal violet nên có màu tím xanh.
Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: vi khuẩn Gram âm do không còn màu của Crystal violet nên có màu hồng của Fushin.