Sau khi khảo sát khả năng cố định đạm và gen nifH ở một số dòng vi khuẩn cho thấy dòng VB35 đồng thời có khả năng cố định đạm cao nhất và có gen nifH. Do đó DNA của dòng vi khuẩn VB35 đã được chọn để khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi 27F và 1492R (Hình 35, phụ lục 2), sau đó tiến hành định danh bằng kỹ thuật giải trình tự DNA vùng gen 16S rDNA (bởi công ty MACROGEN, Hàn Quốc), sử dụng chương trình BLAST để so sánh mức dộ đồng hình của trình tự của dòng vi khuẩn được tuyển chọn với trình tự của các dòng vi khuẩn có sẵn trong GeneBank trên trang web: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
Kết quả: Trình tự nucleotide của dòng VB35:
AGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGT AGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTC ATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTC ACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTC GGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTT GTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAG CGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTG GGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAAT TCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGA AGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG CAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGG AGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCG CCTG
Tổng số nucleotide được giải của dòng VB35 là 770 nucleotide, cho kết quả đồng hình với trình tự của các chủng vi khuẩn Klebsialla sp. TS1, Klebsiella sp. Gp22,
Klebsiella pneumoniae S001, Enterobactersp.wengyuan07 và Bacterium 5 – 2 (2013) đã được đăng ký trong ngân hàng Gene với tỷ lệ là 100% (Hình 25).
Kết quả so sánh có độ tương đồng cao với Klebsiella sp. Gp22 với tỷ lệ 770/770 (100%) và có tỷ lệ khoảng trống (gaps) là 0/770 (0%), không có nucleotide nào khác nhau trên đoạn truy vấn (Hình 26).
Hình 26. Kết quả so sánh trên BLAST N của dòng VB35 so với dòng
Từ kết quả truy cứu trên, sử dụng phần mềm ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) ta vẽ được cây phả hệ (phylogenetic tree) như sau:
Hình 27. Cây phả hệ phân tích mối quan hệ di truyền của dòng VB35 với các dòng vi khuẩn khác trên CSDL NCBI
Qua kết quả tra cứu trên ngân hàng Gene và cây phả hệ, cho thấy dòng vi khuẩn VB35 thuộc chi Klebsiella.
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ – Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, ít chuyển động, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2 loài quan trọng là
Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca. Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh trong cây.
Theo ZX Lü (2000), vi khuẩn Klebsiella oxytoca dòng SG-11 được phân lập từ rễ lúa là vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm từ nitơ không khí và khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ trình indole – 3 – pyruvicacid của chúng.
Ở Ấn Độ, Jha và Kumar (2007) nghiên cứu vi khuẩn K. oxytoca dòng GR-3 được phân lập từ rễ và thân của cây cỏ đuôi mèo (Typha australis) thì nhận thấy chúng có mật số ở rễ là 6x106 CFU.g-1, khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan là 30μg/mg trọng lượng khô, khả năng hòa tan lân khó tan là 31.5 μg/mg trọng lượng khô, và mức độ biểu hiện hoạt tính của phức hệ nitrogenase qua phản ứng khử acetylene là khá cao (1.25μmolC2H4/mg protein h-1). Sau đó, các nghiên cứu tiếp theo còn cho thấy rằng vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả; đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây.
So sánh với kết quả của những thí nghiệm phân lập, khảo sát khả năng cố định đạm, khảo sát gen nifH trước đó thì dòng VB35 là vi khuẩn hiếu khí, Gram âm, hình que và ít chuyển động (Bảng 8, mục 4.1.2.); nó được phân lập từ đất vùng rễ của khoai lang (Bảng 13, phụ lục 3); có khả năng cố định đạm cao nhất (3,036 mg/l NH4+, Bảng 9, mục 4.2) và có gen nifH (mục 4.3), như vậy ta có thể kết luận kết quả thu được là phù hợp.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ