Ly trích DNA
Mẫu vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng (Hình 23). Sau 2 ngày tiến hành trích DNA theo quy trình sốc nhiệt (trình bày trong phần phương pháp thí nghiệm).
Hình 23. Vi khuẩn phát triển trong môi trường LB sau 2 ngày nuôi cấy.
Từ trái qua: Ống đối chứng, ống có chủng vi khuẩn.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
N ồ n g đ ộ N H4 +(m g /l ) VB20 VB35 VB37 VB29 VB39 VB36 VB18 VB41 VB12 VB14
Phản ứng PCR với cặp mồi nifH
Kết quả điện di từ sản phẩm PCR với cặp mồi nifH (Hình 24), qua khảo sát trong 10 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao nhất có 8 dòng vi khuẩn có gen nifH là VB20, VB35, VB37, VB29, VB39, VB18, VB41 và VB12. Trong đó có 2/8 dòng phân lập được từ rễ, 2/8 dòng từ thân, 1/8 dòng từ lá và 3/8 dòng phân lập được từ đất.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 24. Hình gel điện di sản phẩm PCR với cặp mồi nifH
Ghi chú: Giếng M (thang chuẩn); giếng 1 (VB20), 2 (VB35), 3 (VB37), 4 (VB29), 5 (VB39), 6 (VB36), 7 (VB18), 8 (VB41), 9 (VB12),10 (VB14), 11 (đối chứng âm).
Kết quả trên còn cho thấy ngoài một số dòng (VB29, VB39, VB41, VB12) chỉ cho 1 band chính thì các dòng khác (VB20, VB35, VB37, VB36, VB18, VB14) còn cho band phụ nằm ngoài khoảng 300 - 400bp (Hình 24). Các band phụ này có thể tối hoặc sáng hơn band chính. Như đã biết thì cặp mồi nifH được Helmut et al., thiết kế năm 2004 dựa trên trình tự gen nifH của các dòng vi khuẩn thuộc chi Azotobacter. Kết quả điện di có band phụ xuất hiện có thể do primer nifH được thiết kế chuyên biệt với nhóm Azotobacter, nên những dòng không chuyên biệt có thể cho band phụ ngoài band chính đang khảo sát. Theo Rajeswari và Mangai năm 2009, khảo sát gen nifH của các dòng vi khuẩn thuộc chi Azotobacter cho thấy gen nifH có chiều dài khoảng 400bp. Và theo Widmer et al., năm 1998 khi khảo sát gen nifH ở một số chi vi khuẩn khác như: Clostridium, Frankia, Klebsiella,… cho thấy đoạn gen này có kích thước khoảng 370bp. Từ đó có thể thấy, gen nifH là một gen dễ biến động ở các dòng vi khuẩn khác nhau. Các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm có band trong khoảng 300 - 400bp thì phù hợp với kích thước của gen nifH.
Kết quả này phù hợp với kết quả của Nguyễn Thị Kiều Diễm (2012) khi khảo sát sự hiện diện của gen nifH ở các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm đã được phân
lập từ vùng rễ lúa thuộc các tỉnh Vĩnh Long, Cần Thơ, Hậu Giang, Đồng Tháp và Trà Vinh.