2.4.1. Phân loại khoa học
Giới Plantae Chi Ipomoea
Bộ Solanales Loài Ipomoea batatas
Họ Convolvulaceae Danh pháp hai phần Ipomoea batatas L.
2.4.2. Giới thiệu
Khoai lang là một loài cây nông nghiệp với các rễ củ lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, được gọi là củ khoai lang và nó là một nguồn cung cấp rau ăn củ quan trọng, được sử dụng trong vai trò của cả rau lẫn lương thực. Các lá non và thân non cũng được sử dụng như một loại rau.
Đây là một loài cây thân thảo dạng dây leo sống lâu năm, có các lá mọc so le hình tim hay xẻ thùy chân vịt, các hoa có tràng hợp và kích thước trung bình. Rễ củ ăn được có hình dáng thuôn dài và thon, lớp vỏ nhẵn nhụi có
màu từ đỏ, tím, nâu hay trắng. Lớp cùi thịt có màu từ trắng, vàng, cam hay tím. Khoai lang có rất nhiều loại:
- Có loại củ to, vỏ trắng, ruột trắng hoặc ruột vàng sẫm, có nhiều chất tinh bột. - Khoai lang bí: là loại củ dài, vỏ đỏ, ruột vàng tươi.
- Khoai lang Nhật: vỏ đỏ, ruột vàng rất thơm, ngon.
- Khoai lang ngọc nữ: vỏ tím, ruột tím….và nhiều loại khoai lang khác. (http://vi.wikipedia.org/wiki/Khoai_lang, ngày 02/08/2013)
Hình 8.Cây khoai lang
Nguồn:
http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh- vat-hoc/thuc-vat/25551_Nhung-loai-cay- luong-thuc-chinh-cua-the-gioi.aspx, (Ngày
2.4.2. Nguồn gốc và tình hình sản xuất
Nguồn gốc và phân bố
Khoai lang có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới châu Mỹ, nó được con người trồng cách đây trên 5.000 năm. Nó được phổ biến rất sớm trong khu vực này, bao gồm cả khu vực Caribe. Nó cũng đã được biết tới trước khi có sự thám hiểm của người phương tây tới Polynesia. Nó được đưa tới đây như thế nào là chủ đề của các cuộc tranh luận dữ dội, có sự tham gia của các chứng cứ từ khảo cổ học, ngôn ngữ học và di truyền học.
Khoai lang phân bố chủ yếu tập trung ở các nước châu Á (Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia, Philipines, India), là những nước sản xuất khoai lang quan trọng; ở Đông Phi có một số nước trồng khoai lang đáng chú ý như Uranda, Rwanda, Burundi, Kenya.
Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai lang trên thế giới
Trong tất cả các cây trồng chính, khoai lang đứng vị trí thứ 10 về diện tích, nhưng tính riêng cây có củ: khoai tây, củ cải đường, sắn… thì khoai lang đứng thứ 3 sau khoai tây và sắn. Về sản lượng, theo FAO năm 1999 khoai lang chiếm diện tích không lớn (8,9 triệu ha) nhưng lại có một sản lượng tương đối cao (129,2 triệu tấn), đứng ở vị trí thứ 9 trong các loại cây trồng chính. Điều này cho thấy cây khoai lang có tầm quan trọng và vị thế nhất định trong nền sản xuất nông nghiệp của thế giới.
Đến năm 2008, toàn thế giới có 111 nước trồng khoai lang (FAO 2009) trên diện tích 8,17 triệu ha, trong đó 95% tại các nước đang phát triển, năng suất bình quân 13,46 tấn/ha, sản lượng 110,13 triệu tấn (so với năm 2005 là 123,27 triệu tấn và năm 1961 là 98,19 triệu tấn).
Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai lang ở Việt Nam
Khoai lang là cây lương thực trồng lâu đời ở Việt Nam, xếp hàng thứ 3 sau cây lúa, cây ngô và là nước có diện tích khoai lang đứng hàng thứ 6 trên thế giới sau Trung Quốc, Mỹ, Urandda, Nigeria và Tanzania. Sản lượng khoai lang của Việt Nam đạt 1,32 triệu tấn, đứng thứ năm toàn thế giới sau Trung Quốc (85,21 triệu tấn), Nigeria (3,31 triệu tấn), Uganda (2,70 triệu tấn) và Indonesia (1,87 triệu tấn). Năm 2005, cả nước có 188,400 ha năng suất bình quân đạt 7,75 tấn/ha, sản lượng đạt 1,46 triệu tấn (năng suất thấp hơn so với bình quân chung của thế giới là 14,0 tấn/ha).
Hiện nay, cây khoai lang được phân bố rộng rãi ở nước ta. Ở vùng núi, Trung du Bắc Bộ, Duyên hải Miền Trung, Châu thổ sông Hồng, Tây Nguyên và vùng Đồng bằng sông Cửu Long khoai lang luôn có mặt trong nhiều cơ cấu luân canh của nhiều vùng đất.
Thị trường xuất khẩu khoai lang của Việt Nam dự báo thuận lợi và có lợi thế cạnh tranh cao do có nhu cầu về chế biến khoai lang xuất khẩu các loại thức ăn gia súc. Diện tích khoai lang của Việt Nam dự kiến ổn định khoảng 188,4 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và lượng khoai lang bằng cách chọn tạo và phát triển các giống khoai lang tốt có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác khoai lang bền vững và thích hợp vùng sinh thái, đảm bảo thu nhập cho người dân.
(http://www.doko.vn/luan-van/danh-gia-tinh-hinh-san-xuat-va-tieu-thu-khoai- lang-nhat-ban-tai-mot-so-xa-thuoc-huyen-nho-quan-tinh-ninh-binh-160440, ngày 02/08/2013)
Giá trị dinh dưỡng
Trong củ khoai lang bao gồm một lượng lớn tinh bột, các acid amin, beta carotene, vitamin C, B1 và hơn 10 loại nguyên tố vi lượng cần thiết cho sức khỏe con người như canxi, phospho, kẽm, sắt, magie, natri, kali,… Vì vậy, các chuyên gia dinh dưỡng đã gọi khoai lang là loại “thực phẩm cân bằng dinh dưỡng nhất”.
Hàm lượng sắt trong các loại khoai lang đều cao (giống khoai lang màu cam), ngoài ra khoai lang còn chứa khá nhiều chất kẽm (giống khoai lang màu trắng và màu cam). Kẽm và sắt là 2 chất rất thiếu trong gạo, chẳng những thế, trong gạo còn có chất phytase ngăn cản hấp thu sắt và kẽm của các loại thực phẩm khác trong ruột, nên ăn độn trong thời kỳ kinh tế khó khăn cũng có cơ sở khoa học về mặt dinh dưỡng. Ngoài ra khoai lang còn có khá nhiều canxi và kali.
Các vi chất có trong khoai lang khá dồi dào, ăn khoai lang đơn thuần bảo đảm cung cấp thừa lượng vitamine A, đáp ứng 28% nhu cầu vitamine C, 25% chất manganese, 16% chất đồng, xơ và vitamine B6, 8% chất sắt và kali. Khoai lang có khối lượng đường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng lượng cao hơn so với lúa mì, lúa nước và sắn. Cùng với gạo, khoai lang và bắp là hai cây lương thực chính ở nước ta. Trong những năm khó khăn về lương thực, khoai lang trở thành cây cứu đói cho
làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần đây đang được nghiên cứu làm màng phủ sinh học (bioplastic).
(http://www.rauhoaquavietnam.vn/printversion.aspx?ContentID=947,ngày
02/08/2013)
Khám phá gần đây cho thấy trong khoai lang có chứa nhiều chất chống ô-xy hóa ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư, chống lão hóa và làm sạch các chất bẩn trong mạch máu. Bao gồm các hợp chất phenol, anthocyanin (có nhiều trong khoai lang tím), carotenoid, trong đó khoai lang tím chứa nhiều chất chống ô-xy hóa tổng số nhất, kế đến là khoai lang hồng và khoai lang bí. Đó là lý do ở Nhật lấy khoai lang tím và khoai lang bí để làm nước ép, loại nước uống của thực phẩm chức năng
Ngoài ra, củ và rau khoai lang có còn những giá trị chữa bệnh nên từ lâu trong dân gian có nơi còn gọi khoai lang là "Sâm nam".
(http://doc.edu.vn/tai-lieu/tieu-luan-tim-hieu-ve-khoai-lang-va-quy-trinh-san- xuat-tinh-bot-khoai-lang-11454/, ngày 02/08/2013)
2.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu.
Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết.
Nguyên tắc phân lập: Tách rời tế bào vi sinh vật; Nuôi các tế bào bên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. Các bước tách vi sinh vật để tạo dòng thuần được thực hiện như sau:
- Dùng kim cấy mềm lấy một ít vi sinh vật từ khuẩn lạc. - Trải vi sinh vật (đường thứ nhất)
- Vẽ đường thứ hai cắt ngang đường thứ nhất (đường cấy ngoằn ngoèo hoặc đường cấy thẳng.
- Vi sinh vật được kéo rời rạc qua các đường cấy và cuối đường thứ ba sẽ còn vài tế bào rời sẽ phát triển thành khuẩn lạc độc lập.
- Trong trường hợp mật số vi sinh vật quá nhiều, hoặc đối với những vi khuẩn có liên kết chặt chẽ khó tách ròng, chúng ta phải pha loãng mật số vi khuẩn rồi hút một thể tích nhất định cho vào đĩa petri, sau đó thực hiện giống các thao tác trên để thu được khuẩn lạc ròng.
(Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
2.6 Sơ lược về gen nif
Gen nif được tìm thấy ở các loài vi sinh vật có khả năng cố định đạm sống tự do và sống nội sinh, chúng tồn tại ở cả hai dạng gen trội và gen lặn. Một số gen nif được biết đến là: nif A, D, L, K, F, H, U, Y, W, Z.
Gen nifH là gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình cố định nitơ khí quyển thành dạng nitơ có sẵn cho cây trồng. Tiền enzyme được mã hóa bởi gen nifH là phức hợp nitrogenase, có vai trò chuyển đổi nitơ trong không khí thành các dạng nitơ khác mà cây trồng có thể sử dụng được.
Hình 9. Bản đồ gen nif và vai trò của chúng ở vi khuẩn Klebsiella pneumoniae
(Nguồn: http://www.asahi-net.or.jp/~it6i-wtnb/BNF.html, ngày 02/08/2013)
Ngoài việc mã hóa các enzyme thì gen nif cũng có khả năng mã hóa một số protein điều hòa liên quan đến cố định đạm. Quá trình biểu hiện của gen nif được kích hoạt khi nồng độ nitơ cố định và nồng độ oxy thấp.
Ở phần lớn thực vật, việc kích hoạt quá trình mã hóa gen nif được thực hiện bởi protein A cảm ứng với nitơ. Khi lượng nitơ không đủ cho cây sử dụng, NtrC – một loại
ARN polymerase sẽ kích hoạt sự biểu hiện của nifA và nifA sẽ tiếp tục kích thích mã hóa các gen còn lại. Khi có đủ nitơ hoặc có sự hiện diện của oxy, một loại protein khác sẽ kích hoạt gen nifL và nifL sẽ ức chế hoạt động của gen nifA dẫn đến việc ức chế nitrogenase. NifL được điều hòa bởi protein glnD và glnK.
Gen nif cũng được tìm thấy trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn (nhưng đôi khi lại được phát hiện trong plasmid), cùng với các gen khác tham gia vào quá trình tổng hợp protein.
(www.ajol.info/index.php/ajb/article/viewFile/68763/56829, ngày 02/08/2013)
2.7 Giới thiệu về kỹ thuật PCR
PCR được viết tắt từ cụm từ Polymerase Chain Reaction, là một kỹ thuật trong sinh học phân tử dùng để khuếch đại một hay nhiều đoạn DNA lên nhiều lần để tạo ra một số lượng lớn bản copy của đoạn DNA ban đầu.
Được phát triển từ năm 1983 bởi Kary Mullis, kỹ thuật PCR đã được ứng dụng mạnh mẽ vào các ngành y dược và nhiều ngành nghiên cứu sinh học khác.
Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai mồi chuyên biệt nhờ enzyme DNA polymerase sau nhiều chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi tách thành 2 sợi đơn. Nhiệt độ tăng lên 94 - 96oC để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nhiệt độ tăng lên sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng 1 - 2 phút.
- Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính khoảng 45 - 60oC. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian bắt cặp từ 1 - 2 phút.
- Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc 1000bp/1 phút.
Các đoạn DNA mới dược hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo.
Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n-1.
(Trần Nhân Dũng et al., 2012)
Hình 10. Phản ứng PCR
(Nguồn: http:// users.ugent.be , 23/06/2013)
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR:
- Nước: phải thật tinh khiết, không chứa bất kì một thành phần nào khác.
- Buffer: hiệu suất của enzyme polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo.
- dNTP (deoxy nucleotide triphosphate): lượng DNA tối ưu là 200l cho mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác.
- Nồng độ Mg2+: tăng nồng độ Mg2+ có thể làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu. Thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp. Nồng độ Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template và thành phần buffer.
- Số lượng chu kỳ phản ứng: từ 25 - 40 chu kỳ, khi vượt quá sẽ phân hủy và cạn kiệt thành phần phản ứng, xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao có thể bắt cặp với nhau.
(http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR, ngày 2/08/2013).
2.8 Kỹ thuật điện di DNA
Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở pH trung tính) nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
Hai loại gel được sử dụng trong điện di là agarose và polyacrylamide. Nồng độ agarose trong dung dịch đệm thường là 0,6 - 2,5%, đây là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 - 20kb. Gel polyacrylamide dùng để phân tách các đoạn có kích thước dưới 1000bp. Dung dịch đêm dùng trong kỹ thuật điện di thường là TAE, TE, TBE…
Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó được duy trì cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (thường là xanh bromphenol) chạy tới cuối gel.
Các acid nucleic trong gel agarose sẽ hiện band dưới tia tử ngoại (UV = 300nm) nhờ Ethidium Bromide được cho vào trước khi đổ gel.
(Nguyễn Thị Kiều Diễm, 2012)
2.9 Giải trình tự DNA
Kỹ thuật giải trình tự DNA (DNA sequencing) là kỹ thuật xác định tất cả các hợp phần do nucleotide hình thành nên phân tử DNA chuyên tính nào đó. Khả năng đọc được chuỗi mã DNA gắn liền với nhiệm vụ trung tâm của công nghệ sinh học phát triển. Những kỹ thuật giải trình tự DNA cũng chỉ mới được hoàn thiện trong những năm gần đây. Các công trình đầu tiên được công bố của Maxam và Gilbert (1975), Fred Ganger et al (1977). Nhưng trong hơn hai mươi năm qua, kỹ thuật này được cải tiến rất nhiều. Đặc biệt với sự trợ giúp của máy tính, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ của
PCR… phương pháp giải trình tự trở thành công cụ rất có giá trị làm nền tảng cho phân tích bộ gen (genome) (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005).
2.9.1. Giải trình tự gen 16S rDNA bằng hệ thống tự động
Đoạn gen 16S rDNA ở vi khuẩn là một công cụ hữu ích để phân loại và định danh vi khuẩn. Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, vùng gen 16S rDNA có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự khác nhau giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi khuẩn, đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ có kích thước vừa phải (1500 bp) thuận tiện cho việc giải trình tự.
Máy giải trình tự ABI 3130 hoạt động theo nguyên tắc của phương pháp dideoxy