PCR được viết tắt từ cụm từ Polymerase Chain Reaction, là một kỹ thuật trong sinh học phân tử dùng để khuếch đại một hay nhiều đoạn DNA lên nhiều lần để tạo ra một số lượng lớn bản copy của đoạn DNA ban đầu.
Được phát triển từ năm 1983 bởi Kary Mullis, kỹ thuật PCR đã được ứng dụng mạnh mẽ vào các ngành y dược và nhiều ngành nghiên cứu sinh học khác.
Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai mồi chuyên biệt nhờ enzyme DNA polymerase sau nhiều chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi tách thành 2 sợi đơn. Nhiệt độ tăng lên 94 - 96oC để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nhiệt độ tăng lên sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng 1 - 2 phút.
- Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính khoảng 45 - 60oC. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian bắt cặp từ 1 - 2 phút.
- Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc 1000bp/1 phút.
Các đoạn DNA mới dược hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo.
Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n-1.
(Trần Nhân Dũng et al., 2012)
Hình 10. Phản ứng PCR
(Nguồn: http:// users.ugent.be , 23/06/2013)
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR:
- Nước: phải thật tinh khiết, không chứa bất kì một thành phần nào khác.
- Buffer: hiệu suất của enzyme polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo.
- dNTP (deoxy nucleotide triphosphate): lượng DNA tối ưu là 200l cho mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác.
- Nồng độ Mg2+: tăng nồng độ Mg2+ có thể làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu. Thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp. Nồng độ Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template và thành phần buffer.
- Số lượng chu kỳ phản ứng: từ 25 - 40 chu kỳ, khi vượt quá sẽ phân hủy và cạn kiệt thành phần phản ứng, xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao có thể bắt cặp với nhau.
(http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR, ngày 2/08/2013).