Khảo sát sự hiện diện của gen nifH

Tuyển chọn ra một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao nhấtđể tiến hành khảo sát sự hiện diện của gen nifH.

a. Trích DNA của các vi khuẩn đã phân lập

Nuôi vi khuẩn trong 3ml môi trường LB lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 2 – 4 ngày ở nhiệt độ phòng (30oC)để thu sinh khối. Tiến hành trích DNA vi khuẩn bằng quy trình sốc nhiệt của Luciana et al., (2001):

- Chuyển 2ml dịch vi khuẩn nuôi trong LB sang eppendorf 2,2ml. - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.

- Bỏ phần dung dịch trong, lấy phần tủa. - Hòa tan kết tủa bằng 1ml dung dịch TE 1X. - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút. - Đổ bỏ dung dịch trong, lấy phần tủa.

- Hòa tan kết tủa bằng 1ml dung dịch TE 1X. - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút. - Đổ bỏ dung dịch trong, lấy phần tủa.

- Hòa tan kết tủa thu được bằng 100µl dung dịch TE 1X. - Ủ ở 95oC trong 10 phút.

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.

- Bỏ phần tủa, hút phần trong vào eppendorf 1,5ml. - Trữ DNA ở nhiệt độ -20oC.

95oC 5’ 94oC 30s 55oC 1’ 72oC 30s 72oC 10’ 4oC  35 chu kỳ

DNA sau khi ly trích được sử dụng làm khuôn để khảo sát sự hiện diện của gen

nifH qua kỹ thuật PCR với cặp mồi có trình tự như sau và chu kỳ nhiệt như hình 10.

nifH - F: 5’- GGTTGTGACCCGAAAGCTGA -3’

nifH - R: 5’- GCGTACATGGCCATCATCTC -3’ (Helmut et al., 2004)

- Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine (Mỹ).

Bảng 5. Thành phần của phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Thể tích cho một phản ứng(µl) Nước cất hai lần 1X 12,25 Buffer 1X 1X 2,5 MgCl2 2mM 25mM 2 dNTPs 20ng cho mỗi dNTP 4 Mồi NifHF 0,2µM 1 Mồi NifHR 0,2µM 1

Taq polymerase 0,5u 0,25

DNA vi khuẩn 50 ng/µl 2

Tổng thể tích 25

 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen nif H

Hình 12. Chu kỳ nhiệt của phản ứng khuếch đại gen nifH

c. Điện di trên gel kiểm tra sản phẩm PCR

- Khi hoàn tất chương trình chạy PCR thì sản phẩm sẽ được kiểm tra trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE.

- Các bước chuẩn bị gel agarose 1,5 % trong dung dịch đệm TBE 1X. - Gel được đổ có 17 giếng cần sử dụng 0,6g agarose với 40ml TBE 1X. - Đun chảy agarose bằng lò vi sóng khoảng 2 – 3 phút.

- Để nguội khoảng 5 phút (~ 50oC), thêm 0.8l Ethidium Bromide (10mg/ml). - Gắn lược vào khuôn, đổ gel và để nguội 30 - 45 phút.

- Đặt khuôn chứa gel vào trong máy điện di. - Lấy nhẹ lược ra, không đụng vào gel.

- Thêm dung dịch đệm điện di (TBE 1X) cho ngập gel (khoảng 1 mm).

- Nạp mẫu, mỗi giếng cho 10µl mẫu DNA (đã chạy PCR) + 2µl Loading Buffer. - Cho máy điện di chạy ở 80V- 100V bằng bộ điện di một chiều khoảng 90 phút. - Quan sát khi chất chỉ thị màu di chuyển đến gần cuối gel (còn khoảng 1- 2 cm),

lấy gel ra.

- Gel sau khi lấy ra được chụp hình dưới đèn UV của hệ thống chụp hình gel Bio- RAD UV 2000 (Mỹ) rồi quan sát các band xuất hiện trên gel.

Kết quả: Nhận diện các dòng vi khuẩn cho band trong khoảng 300 – 400bp theo thang chuẩn 100bp.