Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu.
Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết.
Nguyên tắc phân lập: Tách rời tế bào vi sinh vật; Nuôi các tế bào bên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. Các bước tách vi sinh vật để tạo dòng thuần được thực hiện như sau:
- Dùng kim cấy mềm lấy một ít vi sinh vật từ khuẩn lạc. - Trải vi sinh vật (đường thứ nhất)
- Vẽ đường thứ hai cắt ngang đường thứ nhất (đường cấy ngoằn ngoèo hoặc đường cấy thẳng.
- Vi sinh vật được kéo rời rạc qua các đường cấy và cuối đường thứ ba sẽ còn vài tế bào rời sẽ phát triển thành khuẩn lạc độc lập.
- Trong trường hợp mật số vi sinh vật quá nhiều, hoặc đối với những vi khuẩn có liên kết chặt chẽ khó tách ròng, chúng ta phải pha loãng mật số vi khuẩn rồi hút một thể tích nhất định cho vào đĩa petri, sau đó thực hiện giống các thao tác trên để thu được khuẩn lạc ròng.
(Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).