Chọn ra dòng vi khuẩn đồng thời có khả năng cố định đạm cao và có gen nifH để tiến hành định danh bằng giải trình tự vùng 16S rDNA:
Ly trích DNA: Sử dụng mẫu DNA đã ly trích ở mục a thí nghiệm 3.2.3.
Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA:
Bảng 6. Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA
Thành phần Nồng độ Thể tích cho một phản ứng(µl) Nước cất hai lần 1X 11,9 Buffer 1X 1X 2,5 MgCl2 2mM 25mM 2 dNTPs 20ng cho mỗi dNTP 4 Mồi 27F 0,2µM 1 Mồi 1492R 0,2µM 1
Taq polymerase 0,5u 0,6
DNA vi khuẩn 50 ng/µl 2
Tổng thể tích 25
Gen 16S rDNA được chọn khuếch đại để tiến hành định danh vi khuẩn. Đây là đoạn gen bảo tồn đặc trưng cho cho từng loài vi khuẩn. Sử dụng cặp mồi tổng 27F và 1492R (Lane et al., 1985).
Mồi xuôi: 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ Mồi ngược: 1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine (Mỹ). Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA
Hình 13. Chu kỳ nhiệt phản ứng khuếch đại 16S rDNA
Điện di sản phẩm PCR:
Sản phẩm sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng PCR được trữ ở 10oC đem tiến hành điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE có bổ sung Ethidium Bromide. Gel được sử dụng có thể tích 20 ml với 5 giếng/gel.
Các bước chuẩn bị gel agarose 1,5 % trong dung dịch đệm TBE 1X tương tự như ở mục c thí nghiệm 3.2.3.
Kết quả: Nhận diện các dòng vi khuẩn cho band ở vị trí khoảng 1500 bp theo thang chuẩn 100bp plus. DNA trong sản phẩm này sẽ được sử dụng như một template cho phản ứng giải trình tự.
Giải trình tự vùng 16S rDNA:
Sử dụng sản phẩm PCR để giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động ABI 3130 thông qua công ty MACROGEN, Hàn Quốc. Sử dụng chương trình BLAST N (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) để so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn với trình tự gen 16S rDNA của các loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information).
94oC 5’ 94oC 1’ 53oC 45’ 72oC 1’30s 72oC 7’ 4oC 35 chu kỳ
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN