Bảng 4.4: Kết quả nhuộm gram và các phép thử sinh hóa Thời gian lên men
(ngày)
Chủng Nhuộm gram Hoạt tính catalase Hoạt tính Oixdase
L1 + - - 5 L2 + - - L1 + - - 10 L2 + - - L1 + - - 15 L2 + - - L1 + - - 20 L2 + - -
Ghi chú: dấu (+) là dương tính; dấu (-) là âm tính
Sau khi quan sát hình dạng và đo kích thước tế bào tiến hành nhuộm gram các chủng vi khuẩn trên. Kết quả tất cả các chủng trên đều bắt màu gram dương (màu tím). Từ các chủng vi khuẩn đã phân lập ròng ta tiến hành các phép thử sinh hóa để thử hoạt tính của catalase và oxidase, kết quả thể hiện ở bảng 4.4. Khi thử hoạt tính catalase các chủng vi khuẩn ròng được chọn đều không sủi bọt với thuốc thử H2O2 thể hiện qua hình 4.20 dẫn đến kết luận là các chủng phân lập được đều có hoạt tính catalase âm tính. Tiếp tục thử hoạt tính oxidase của các chủng được phân lập với thuốc thử Tetramethyl - p - phenylenediamin dihydrochlorid 1% kết quả là chủng vi khuẩn không phản ứng với thuốc thử dẫn đến kết luận là âm tính thể hiện qua hình 4.21. Vậy từ kết quả trên rất phù hợp với tiêu chuẩn để xác định 2 chủng vi khuẩn trên đều thuộc vi khuẩn Lactic vì chúng đều gram dương, hình que, hoạt tính catalase âm tính, hoạt tính oxidase âm tính.
Hình 4.12. chủng thứ nhất đã nhuộm gram Hình 4.13. chủng thứ hai đã nhuộm gram (ngày ủ thứ 5) (ngày ủ thứ 5)
Hình 4.14. chủng thứ nhất đã nhuộm gram Hình 4.15. của chủng thứ hai đã nhuộm gram (ngày ủ thứ 10) (ngày ủ thứ 10)
Hình4.16. chủng thứ nhất đã nhuộm gram Hình 4.17. chủng thứ hai đã nhuộm gram (ngày ủ thứ 15) (ngày ủ thứ 15)
Hình 4.18. chủng thứ nhất đã nhuộm gram Hình 4.19. chủng thứ hai đã nhuộm gram
( ngày ủ thứ 20) (ngày ủ thứ 20)
Hình 4.20. phép thử catalase âm
tính
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Tổng số vi khuẩn hiếu khí và tổng số vi khuẩn Lactic biến đổi trong suốt quá trình chế
biến sản phẩm. Vi sinh vật phát triển theo chiều hướng có lợi vì trong sản phẩm cuối
cùng vi khuẩn Lactic có lợi tăng cao và ổn định còn vi khuẩn tạp giảm nhiều. Vậy sản
phẩm mắm cá sặc lên men chua xương mềm tương đối an toàn về mặt vi sinh vì trong sản phẩm, chủ yếu là các vi khuẩn Lactic mà vi khuẩn Lactic là những vi sinh vật có
lợi.
Quá trình phân lập vi khuẩn Lactic trong công đoạn ủ ở ngày ủ thứ 5, 10, 15 và 20 ngày đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn. Chủng thứ nhất có đặc điểm khuẩn lạc là hình tròn, kích thước nhỏ li ti, bóng, màu trắng đục, hơi lài và đặc điểm tế bào hình que ngắn. Chủng thứ hai có đặc điểm khuẩn lạc hơi khác hơn chủng thứ nhất là hình tròn, kích thước nhỏ, bóng, màu vàng kem, lồi và đặc điểm tế bào hình que dài. Hai chủng này có các đặc điểm về hình dạng, kích thước vi khuẩn phù hợp với mô tả về vi
khuẩn Lactic; đều gram dương và đều cho phản ứng âm tính với phép thử catalase và phép thử oxidase phù hợp với tiêu chuẩn xác định vi khuẩn Lactic của Bộ Y Tế. Vậy
có thể sơ bộ kết luận có 2 chủng vi khuẩn Lactic tham gia vào quá trình chế biến.
5.2. Đề nghị
Từ kết quả thu nhận được đề nghị các nghiên cứu sau có điều kiện tiến hành kiểm tra
bằng kỹ thuật sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) để phân lập các chủng vi khuẩn Lactic đã phân lập được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Quyết định số 08/2006/QĐ-BYT của Bộ Y Tế. Thường quy kỹ thuật xác định tổng
số vi khuẩn Lactic trong thực phẩm.
2. TCVN 5165- 90. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí
3. Biền văn Minh. Cách phân lập vi khuẩn trong dạy thực hành sinh học ở trường
THPT
4. Đỗ Thị Tuyết Nhung. 2009. Đề cương nghiên cứu sinh. Đại học Cần Thơ.
5.Lê Văn Việt Mẫn và Lại Mai Hương. 2006. Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm.
NXB Giáo dục.
6. Lê Xuân Phương. Thí nghiệm vi sinh vật học. NXB Giáo dục.
7. Nguyễn Lân Dũng . Nhuộm Gram phương pháp Hucker cải tiến. NXB Đại học
Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Bá Mão.1962. Ngư loại phân loại học. NXB Nông Thôn. Hà Nội.
9 Nguyễn Đức Lượng. 2006. Thí nghiệm vi sinh vật học. NXB Đại học Quốc gia TP.
Hồ Chí Minh.
10. Tạp chí khoa học. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn Lactic phân lập trên
địa bàn thành phố Hà Nội.
11.Trần Thanh Thủy. 1998. Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học. NXB Giáo dục.
PHỤ LỤC
A. Các phương pháp phân tích
1. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí
Sử dụng kỹ thuật đỗ đĩa, đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở
nhiệt độ 30 ± 10C trong thời gian từ 48 đến 72 giờ. Số lượng vi khuẩn trong 1g hoặc
1ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính từ số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng.
1.1 Hoá chất
Bảng1: Nước pha loãng
Đun sôi để hòa tan các chất.
Để nguội đến 30 ± 50C. Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1N sao cho sau khi
tiệt trùng pH = 7,0 ± 0,2.
Rót vào mỗi erlen 90ml, và 9ml vào các ống nghiệm
Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 1210C/15 phút
Môi trường nếu không dùng ngay, cần được bảo quản nơi khô ráo, trong bóng tối ở
nhiệt độ từ 00C đến 50C không quá 30ngày.
Bảng 2: Môi trường thạch Thành phần Lượng Trypton Cao men Glucoza Thạch Nước cất 5g 2,5g 1g 15-20g 1000ml
Đun nhỏ lửa, quấy đều để hòa tan các chất đến khi sôi.
Để nguội môi trường đến 55 ± 50C, điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt trùng pH = 7,0±0,2. Thành phần Lượng Pepton NaCl Nước 1g 8,5g 1000ml
Rót vào các bình thuỷ tinh lượng môi trường không quá ½ dung tích bình. Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 1210C/15 phút.
Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45 ± 10C.
Nếu chưa sử dụng thì cần bảo quản ở nơi khô ráo, trong bóng tối ở nhiệt độ từ 00C
đến 50C không quá 30ngày.
Trước khi nuôi cấy đun cho môi trường nóng chảy và để nguội đến 45 ± 10C.
Ở đây ta thay thế bằng môi trường Plate Count Agar (chi tiết kèm theo phụ lục 1)
1.2Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
Lượng mẫu cân tối thiểu để pha loãng không ít hơn 1ml đối với các sản phẩm lỏng và
10 ± 0,1g đối với các sản phẩm khác.
1.3 Các bước nuôi cấy
1.3.1 Pha loãng mẫu
Pha loãng mẫu cho đến khi có được đậm độ pha loãng cần thiết đủ đếm được số khuẩn
lạc trên đĩa theo dự tính.
1.3.2 Đổ đĩa
Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa
petri và 1 pipet vô khuẩn riêng (ở đây do dùng pipet piston nên ta sẽ thay đầu tuýp
riêng cho mỗi đậm độ).
Lấy 1ml sản phẩm (lỏng) hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho
vào giữa từng đĩa petri.
Rót vào từng đĩa 12-15ml môi trường thạch, trộn đảo đều dung dịch mẫu và môi
trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang.
Thời gian từ khi bắt đầu pha loãng mẫu đến khi rót môi trường không được quá 30 phút.
Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi
môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên mặt.
1.3.3 Ủ ấm
Khi thạch đã đông, lật sấp các đĩa petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± 10C từ 2 đến 3
ngày.
Sau 2 ngày tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa
1.4 Tính kết quả
Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả. Sự phân bố của các
khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc
càng ít. Nếu kết quả không hợp lý, phải tiến hành lại các bước nuôi cấy.
Tính kết quả như sau:
1.4.1 Chọn những dĩa có từ 15 đến 300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp
Nếu chênh lệch các giá trị của 2 đậm độ trên nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần
Tính số (N) khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho 1g hoặc 1ml sản phẩm bằng cách tính
trung bình cộng tổng số khuẩn lạc của các đĩa trên theo công thức sau:
C : Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
n1, n2 : số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2.
d : Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1.
Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.
Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ thích
hợp của 10).
Thí dụ:Ở đậm độ pha loãng 10-2 có 150 và 215 khuẩn lạc ở đậm độ pha loãng 10-3 có 16
và 25 khuẩn lạc
150 + 215 + 16 + 25
N = = 18480 (2 + 0,1.2).10-2
Kết quả: 1,8.104 vi khuẩn hiếu khí trong 1g hoặc 1ml sản phẩm.
Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần
Lấy giá trị của đậm độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả.
Thí dụ:
Ở đậm độ pha loãng 10-2 có 180 và 250 khuẩn lạc; Ở đậm độ pha loãng 10-3 có 60 và 75 khuẩn lạc.
Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn (10-2) để tính kết quả.
C
N = (n1 + 0,1.n2) x d
180 + 250
N = = 21500 (2 + 0,1.2).10-2
Kết quả: 2,2.104 vi khuẩn hiếu khí trong 1g hoặc 1ml sản phẩm.
1.4.2 Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu có ít hơn 15 khuẩn lạc
Tính kết quả theo trung bình cộng của các khuẩn lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính ra cho 1g hoặc ml sản phẩm.
Thí dụ: Chỉ ở đậm độ pha loãng 10-1 của sản phẩm đặc có 12 và 8 khuẩn lạc.
12 + 8
N = = 100 2.10-2
Kết quả: 1,0.102 vi khuẩn hiếu khí trong 1g sản phẩm.
1.4.3 Nếu ở tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc
Đánh giá kết quả như sau:
Ít hơn 1 vi khuẩn hiếu khí trong 1ml sản phẩm. Ít hơn 1.1/d vi khuẩn hiếu khí trong 1g sản phẩm.
d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu (10-1).
2. Phương pháp kiểm tra tổng số vi khuẩn lactic
Sử dụng kỹ thuật cấy láng, đếm khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch MRS sau khi ủ vi hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 1o C trong 48 giờ.
2.1 Môi trường
Nước pha loãng pepton
Thạch MRS (de Man, Rogosa, Sharpe agar with Sorbic Acid)
2.2. Chuẩn bị môi trường và mẫu thử
2.2.1. Chuẩn bị môi trường
Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và thuốc thử được pha chế theo công thức và hấp tiệt trùng theo hướng dẫn cho từng loại môi trường
Nước pepton 1%
Pepton 1g
NaCl 8,5g
Cách pha chế: Đun sôi để hoà tan các chất. Để nguội đến 30 5 0C. Điều chỉnh pH môi trường bằng dung dich NaOH 0,1 M sao cho sau khi tiệt khuẩn pH = 7,0 0,2. Rót vào các bình dung tích 250 ml mỗi bình 90ml và vào các ống nghiệm 18 mỗi ống 9 ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C/15 phút.
Nếu môi trường không dùng ngay, cần được bảo quản trong tủ lạnh với nhiệt độ từ 0 đến 5°C không quá 30 ngày
Bảng 3: Thạch MRS Thành phần Tỉ lệ sử dụng Pepton 10,0g Cao thịt 8,0g Cao men 5,0g Glucose 20,0g Tween 80 1,0g K2HPO4 2,0g MgSO4 0,2g MnSO4 0,05g Ammoi citrat 2,0g Natri acetate 5,0g Thạch thường 15,0g Nước cất 1000 ml
Pha chế: Đun nhỏ lửa, quấy đều đến khi sôi để hoà tan các chất. Rót vào bình cầu có
dung tích 250 ml mỗi bình 200 ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ
110 oC /30 phút. Để bình thạch nguội khoảng 50oC, rồi cho vào 2 ml dung dịch acid
sorbic lắc đều. Trong điều kiện vô trùng chỉnh pH của thạch đến 5,7 bằng dung dịch
acid hydrocloric 10%. Thạch để nguội đến 45oC, rót vào các hộp lồng vô trùng có
đường kính 90mm, hoặc 110mm, mỗi hộp 15 - 18 ml thạch. Để đĩa thạch đông tự
nhiên, bảo quản trong tủ lạnh với nhiệt độ từ 0o đến 5oC không quá 7 ngày.
2.2.2. Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử
Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 90ml nước pepton. Lắc đều 2-3 phút, thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-2, 10-3, 10-4 …
Hút chính xác 1 ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước pepton. Lắc đều trong 2-3 phút, thu được dung dịch 10-2.
Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4 ...
2.3 Tiến hành thí nghiệm
Bước 1 : Nuôi cấy mẫu
Ghi ký hiệu mẫu và nồng độ dung dịch mẫu thử lên đĩa thạch MRS.
Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml từ dung dịch mẫu thử ở từng đậm độ nhỏ lên bề mặt đĩa thạch MRS đã được hong khô. Dùng que láng vô trùng, láng đều sao cho dung dịch mẫu thử được phân bố đều trên mặt thạch. Mỗi mẫu thực phẩm phải được nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ . Mỗi đậm độ pha loãng phải được nuôi cấy trong 2 đĩa thạch MRS và 1 pipet vô trùng riêng.
Để các đĩa thạch trên mặt phẳng ngang trong vòng 15 phút để dung dịch mẫu thấm hết vào bề mặt thạch. Sau đó lật sấp các đĩa và để vào tủấm 3O ± 1o C ở điều kiện vi hiếu khí trong 48 giờ.
Bước 2: Xác định số khuẩn lạc vi khuẩn Lactic ở từng đậm độ
Chọn các đĩa có không quá 150 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để sơ bộ đọc kết quả.
Đếm và ghi lại số khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn Lactic ở từng đậm độ: khuẩn lạc tròn nhỏ trong bóng, màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem; hoặc khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắng đục (dễ nhầm với khuẩn lạc nấm men); đặc biệt các khuẩn lạc toả ra mùi chua của acid.
Lưu ý: Nhìn chung khuẩn lạc của vi khuẩn Lactic có kích thước nhỏ nên cần sử dụng máy đếm khuẩn lạc để xác định số khuẩn lạc vi khuẩn Lactic.
2.4 Tính kết quả
Để xác định tổng số vi khuẩn Lactic có trong 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn những đĩa có không quá 150 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Sự phân bố các khuẩn lạc phải hợp lý: Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Tổng số vi
∑ C N = ---
V( n1+ 0,1xn2 )d
Trong đó:
∑ C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn. V: Thể tích cấy trên mỗi đĩa tính bằng ml
n1: Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại n2: Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ nhất
Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa (nếu số cần làm tròn nhỏ hơn 5 thì số đứng trước nó không thay đổi. Nếu số cần làm tròn bằng hoặc lớn hơn 5 thì số đứng trước nó tăng lên một đơn vị, tiếp tục làm tròn cho đến khi chỉ còn hai chữ số có nghĩa).
Số vi khuẩn Lactic có trong 1g hoặc 1ml thực phẩm được biểu thị bằng số thập phân