Phân Lập Vi Khuẩn Kháng Benzene

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN KHÁNG BENZENE CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs.Ts.NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN VŨ THÀNH CÔNG MSSV:3064441 LỚP:CNSH tiên tiến k32 Cần Thơ, Tháng 11/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN KHÁNG BENZENE CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs.Ts.NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN VŨ THÀNH CÔNG MSSV:3064441 LỚP:CNSH tiên tiến k32 Cần Thơ, Tháng 11/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) Nguyễn Hữu Hiệp SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Vũ Thành Công DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Để luận văn hồn thành, tơi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến: -Thầy PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp truyền đạt kinh nghiệm quý báo, tận tình giúp đỡ chỉnh sửa nội dung câu chữ từ tiếng Việt đến tiếng cấu trúc tiếng Anh cung cấp tài liệu, hình ảnh để minh họa cho luận văn hồn chỉnh -Cơ cố vấn TS.Ngơ Thị Phương Dung, thầy Trần Vũ Phương hổ trợ trình thực luân văn -Ks Nguyễn Thị Phương Tâm tận tình hướng dẫn suốt trình thực thí nghiệm - Và bạn lớp Cơng Nghệ Sinh học tiên tiến K32 ủng hộ hồn thành tốt luận văn TĨM TẮT Hai mươi dịng vi khuẩn có khả kháng benzene phân lập từ mẫu đất khác ba tỉnh Cần Thơ, Đồng Tháp, Vĩnh Long Tất có khả kháng benzene 1% có khác biệt lớn khả kháng dịng Khi tăng đến 5% benzene, có dịng B8 B40 sống tốt Mật số vi khuẩn giảm mạnh tăng 7,5% benzene vào mơi trường ni Dịng B8 B40 có khả sinh bốn loại enzyme protease, amylase, cellulase, lipase mạnh so với đối chứng dương Dòng B8 đạt mật số cao 1,7.109 CFU/ml dòng B40 đạt mật số cao 2,2.109 CFU/ml vào ngày thứ môi trường MSB có bổ sung yeast (1%) glucose (1%) Năm dịng vi khuẩn B8, B21, B22, B30 B40 có khả sử dụng benzene nguồn carbon Kết giải trình tự gene 16S rDNA dịng B8, B21, B40 Bacillus subtilis Từ khóa: Bacillus subtilis, benzene, enzyme, glucose, kháng dung môi hữu MỤC LỤC TRANG KÝ TÊN HỘI ĐỒNG CẢM TẠ TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v TỪ VIẾT TẮT .vi CHƯƠNG GIỚI THIỆU CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.Dung môi hữu ( organic solvent ) 2.Vi khuẩn kháng dung môi hữu .4 3.Cơ chế kháng dung môi hữu vi khuẩn 4.Cơ chế phân hủy benzene 12 5.Ứng dụng vi khuẩn kháng dung môi công nghiệp 13 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 1.Phương tiện nghiên cứu 15 2.Phương pháp 17 2.1.Phân lập vi khuẩn 17 2.2.Kiểm tra khả kháng benzene 19 2.3.Khảo sát hoạt tính số enzyme 19 2.4.Khảo sát đường tăng trưởng dòng vi khuẩn môi trường bổ sung benzene .20 2.5.Thí nghiệm chứng minh vi khuẩn sử dụng benzene làm nguồn carbon 21 2.6.Giải trình tự 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .22 1.Phân lập vi khuẩn 22 2.Kiểm tra khả kháng benzene 24 3.Khảo sát hoạt tính số enzyme 31 4.Khảo sát đường tăng trưởng vi khuẩn môi trường bổ sung benzene 33 5.Thí nghiệm chứng minh vi khuẩn sử dụng benzene làm nguồn carbon36 6.Giải trình tự .38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 Kết luận 41 Đề nghị 41 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Số liệu thí nghiệm Phụ lục 2: Số liệu thí nghiệm Phụ lục 3: Số liệu thí nghiệm Phụ lục 4: Thống kê số liệu thí nghiệm Phụ lục 5: Thống kê số liệu thí nghiệm Phụ lục 6: Thống kê số liệu thí nghiệm Phụ lục 7: Kết giải trình tự dịng vi khuẩn B8 Phụ lục 8: Kết giải trình tự dịng vi khuẩn B21 Phụ lục 9: Kết giải trình tự dịng vi khuẩn B40 DANH SÁCH BẢNG TRANG Bảng 1: Giá trị log P số dung môi hữu Bảng 2: Một số vi khuẩn kháng dung môi hữu nghiên cứu Bảng : Tên nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập 22 Bảng : Đặc tính khuẩn lạc 20 dịng vi khuẩn phân lập 24 Bảng 5: Đặc tính tế bào 20 dòng vi khuẩn phân lập 25 Bảng 6: Kết khảo sát hoạt tính enzyme 31 DANH SÁCH HÌNH TRANG Hình 1: Cấu trúc màng tế bào vi khuẩn Gram âm Gram dương Hình 2: Các kiểu kháng dung môi vi khuẩn 11 Hình 3: Cơ chế phân hủy benzene nhờ enzyme dioxygenase .12 Hình 4: Khuẩn lạc dịng B40 .23 Hình 5: Dịng B40 mơi trường MSB 1% benzene sau ngày ni 26 Hình 6: Khả kháng 20 dịng vi khuẩn phân lập mơi trường MSB có 1% benzene 26 Hình 7: Khả kháng dòng vi khuẩn phân lập mơi trường MSB có 2,5% benzene 28 Hình 8: Khả kháng dịng vi khuẩn phân lập mơi trường MSB có 5% benzene 28 Hình 9: Dịng B30 mơi trường MSB chứa 7,5% benzene 29 Hình 10: Tế bào biến dạng vi khuẩn B40 môi trường có 2% benzene quan sát kính hiển vi vật kính 100 29 Hình 11: Sự phát triển dịng vi khuẩn môi trường MSB chứa từ đến 7,5 % benzene .30 Hình 12: Khả sinh enzyme protease dịng B8 32 Hình 13: Khả sinh enzyme cellulase dòng B40 32 Hình 14: Khả sinh enzyme amylase dòng B30 32 Hình 15 : Khả tăng trưởng dịng vi khuẩn B8 môi trường MSB chứa 5% benzene 33 Hình 16: Đường tăng trưởng dịng vi khuẩn B8 môi trường MSB chứa 5% benzene theo thời gian 34 Vi khuẩn B8 B21 B22 B30 B40 OD 600 nm 7.5% benzene Lần I Lần II Lần III TB 0.747 0.525 0.463 0.578 0.212 0.436 0.111 0.253 0.213 0.333 0.476 0.341 0.121 0.257 0.347 0.242 0.679 0.525 0.423 0.542 B8 B21 B22 B30 B40 Tổng kết lại khả kháng benzene 1.00% 2.50% 5.00% 1.76 1.9 1.571 1.84 1.51 1.179 1.08 1.5 1.329 1.88 1.29 1.256 2.36 2.18 1.663 7.50% 0.578 0.253 0.341 0.242 0.542 % benzene PHỤ LỤC SỐ LiỆU THÍ NGHIỆM Mật số CFU/ml hai dịng B8 B40 mơi trường 5% benzene B8 Ngày Nồng độ PL Lần I Lần II Lần III TB B8 1.E+01 63 66 45 B40 1.E+01 53 86 65 58.00 68.00 Ngày B8 B40 1.E+03 1.E+03 11 15 27 4.67 17.67 Ngày B8 B40 1.E+04 1.E+04 30 43 54 54 41 49 41.67 48.67 Ngày B8 B40 1.E+05 1.E+05 29 39 31 51 11 41 23.67 43.67 Ngày B8 B40 1.E+05 1.E+05 67 97 90 102 110 130 89.00 109.67 Ngày B8 B40 1.E+05 1.E+05 42 24 31 31 46 96 39.67 50.33 Ngày B8 B40 1.E+05 1.E+05 10 14 13 13 21 10.00 16.00 Ngày B8 B40 1.E+04 1.E+04 23 35 43 83 17 49 27.67 55.67 CFU/ml Đổi log 1.16E+05 5.064 1.36E+05 5.134 9.33E+05 3.53E+06 5.970 6.548 8.33E+07 9.73E+07 7.921 7.988 473333333.33 873333333.33 8.675 8.941 1780000000 2193333333.33 9.250 9.341 793333333.33 1006666666.67 8.90 9.00 200000000 320000000 8.30 8.51 5.53E+07 111333333.33 7.74 8.05 PHỤ LỤC SỐ LiỆU THÍ NGHIỆM khả sử dụng Benzene nguồn carbon dòng vi khuẩn Ngày nồng độ PL Lần I Lần II Lần III TB CFU/ml B8 1.E+01 63 66 45 58.00 1.16E+05 B21 1.E+01 55 43 31 43.00 8.60E+04 B22 1.E+01 37 42 51 43.33 8.67E+04 B30 1.E+01 33 53 29 38.33 7.67E+04 B40 1.E+01 53 86 65 68.00 1.16E+05 Ngày B8 B21 B22 B30 B40 nồng độ PL Lần I 1.E+03 1.E+03 1.E+03 1.E+03 1.E+03 Lần II 41 33 11 21 22 Lần III 45 21 13 55 TB 69 13 17 11 CFU/ml 51.667 1.03E+07 22.333 4.47E+06 12.333 2.47E+06 14.333 2.87E+06 29.333 5.87E+06 Log 5.064 4.934 4.938 4.885 5.064 Log 7.014 6.650 6.392 6.457 6.768 PHỤ LỤC SỐ LiỆU THÍ NGHIỆM Đếm mật số vi khuẩn phương pháp đo phổ OD OD 600 nm Vi khuẩn Lần I Lần II Lần III TB 0.021 0.027 0.051 B2 0.072 0.014 0.031 B3 1.723 1.552 2.004 B8 0.033 0.053 0.057 B9 0.077 0.052 2.223 B10 0.099 0.051 0.077 B12 0.031 0.043 0.071 B14 0.033 0.035 0.021 B15 0.045 0.022 0.042 B16 0.066 0.076 0.091 B17 0.022 0.031 0.044 B18 0.055 0.078 0.092 B20 1.532 1.991 2.000 B21 1.221 0.991 1.017 B22 0.023 0.077 0.042 B25 1.557 2.052 2.041 B30 0.441 0.541 0.091 B33 0.043 0.067 0.072 B35 0.097 0.112 0.197 B36 2.055 2.578 2.441 B40 1% benzene 0.033 0.039 1.760 0.048 0.784 0.076 0.048 0.030 0.036 0.078 0.032 0.075 1.841 1.076 0.047 1.883 0.358 0.061 0.135 2.358 Vi khuẩn B8 B21 B22 B30 B40 OD 600 nm 2,5% benzene Lần I Lần II Lần III TB 1.357 2.152 2.191 1.900 1.797 1.052 1.689 1.513 2.221 1.054 1.222 1.499 1.567 1.351 0.961 1.293 1.776 2.543 2.213 2.177 Vi khuẩn B8 B21 B22 B30 B40 OD 600 nm 5% benzene Lần I Lần II Lần III TB 1.247 1.552 1.915 1.571 1.397 1.052 1.089 1.179 1.251 0.984 1.752 1.329 1.765 1.143 0.861 1.256 1.486 1.583 1.921 1.663 Vi khuẩn B8 B21 B22 B30 B40 OD 600 nm 7.5% benzene Lần I Lần II Lần III TB 0.747 0.525 0.463 0.578 0.212 0.436 0.111 0.253 0.213 0.333 0.476 0.341 0.121 0.257 0.347 0.242 0.679 0.525 0.423 0.542 B8 B21 B22 B30 B40 Tổng kết lại khả kháng benzene 1.00% 2.50% 5.00% 1.76 1.9 1.571 1.84 1.51 1.179 1.08 1.5 1.329 1.88 1.29 1.256 2.36 2.18 1.663 7.50% 0.578 0.253 0.341 0.242 0.542 % benzene PHỤ LỤC SỐ LiỆU THÍ NGHIỆM Mật số CFU/ml hai dịng B8 B40 môi trường 5% benzene B8 Ngày Nồng độ PL Lần I Lần II Lần III TB B8 1.E+01 63 66 45 B40 1.E+01 53 86 65 58.00 68.00 Ngày B8 B40 1.E+03 1.E+03 11 15 27 4.67 17.67 Ngày B8 B40 1.E+04 1.E+04 30 43 54 54 41 49 41.67 48.67 Ngày B8 B40 1.E+05 1.E+05 29 39 31 51 11 41 23.67 43.67 Ngày B8 B40 1.E+05 1.E+05 67 97 90 102 110 130 89.00 109.67 Ngày B8 B40 1.E+05 1.E+05 42 24 31 31 46 96 39.67 50.33 Ngày B8 B40 1.E+05 1.E+05 10 14 13 13 21 10.00 16.00 Ngày B8 B40 1.E+04 1.E+04 23 35 43 83 17 49 27.67 55.67 CFU/ml Đổi log 1.16E+05 5.064 1.36E+05 5.134 9.33E+05 3.53E+06 5.970 6.548 8.33E+07 9.73E+07 7.921 7.988 473333333.33 873333333.33 8.675 8.941 1780000000 2193333333.33 9.250 9.341 793333333.33 1006666666.67 8.90 9.00 200000000 320000000 8.30 8.51 5.53E+07 111333333.33 7.74 8.05 PHỤ LỤC SỐ LiỆU THÍ NGHIỆM khả sử dụng Benzene nguồn carbon dòng vi khuẩn Ngày nồng độ PL Lần I Lần II Lần III TB CFU/ml B8 1.E+01 63 66 45 58.00 1.16E+05 B21 1.E+01 55 43 31 43.00 8.60E+04 B22 1.E+01 37 42 51 43.33 8.67E+04 B30 1.E+01 33 53 29 38.33 7.67E+04 B40 1.E+01 53 86 65 68.00 1.16E+05 Ngày B8 B21 B22 B30 B40 nồng độ PL Lần I 1.E+03 1.E+03 1.E+03 1.E+03 1.E+03 Lần II 41 33 11 21 22 Lần III 45 21 13 55 TB 69 13 17 11 CFU/ml 51.667 1.03E+07 22.333 4.47E+06 12.333 2.47E+06 14.333 2.87E+06 29.333 5.87E+06 Log 5.064 4.934 4.938 4.885 5.064 Log 7.014 6.650 6.392 6.457 6.768 ... THẢO LUẬN Phân lập vi khuẩn Hai mươi dịng vi khuẩn có khả kháng benzene phân lập từ mẫu đất thu ba tỉnh Cần Thơ, Đồng Tháp, Vĩnh Long đặt tên bảng Bảng : Tên nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập Stt... MSB 1% benzene sau ngày ni 26 Hình 6: Khả kháng 20 dịng vi khuẩn phân lập mơi trường MSB có 1% benzene 26 Hình 7: Khả kháng dịng vi khuẩn phân lập mơi trường MSB có 2,5% benzene. .. nghiên cứu Bảng : Tên nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập 22 Bảng : Đặc tính khuẩn lạc 20 dịng vi khuẩn phân lập 24 Bảng 5: Đặc tính tế bào 20 dịng vi khuẩn phân lập 25 Bảng 6: Kết khảo sát hoạt tính