Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(4A): 1369-1377, 2015 PHÂN LẬP VI KHUẨN PASTEURIA PENETRANS KÝ SINH TUYẾN TRÙNG BƯỚU RỄ MELOIDOGYNE SPP Ở CÂY HỒ TIÊU Vy Thị Mai Trâm1,2, Bùi Thị Thu Nga2, Nguyễn Hữu Hùng2,3, Đỗ Đăng Giáp2, Lê Thị Ánh Hồng2, Nguyễn Thị Kim Xuân4, Dương Đức Hiếu2 Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trung tâm NCTK-Khu Công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh Ngày nhận bài: 16.4.2015 Ngày nhận đăng: 06.11.2015 TÓM TẮT Pasteuria penetrans vi khuẩn ký sinh bắt buộc tuyến trùng sần rễ gây hại hồ tiêu loại trồng khác Điều cho thấy tiềm lớn vi khuẩn tác nhân phòng trừ sinh học Nhằm nghiên cứu P penetrans, mẫu rễ hồ tiêu thuộc bốn tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước thu thập để phân lập Kết cho thấy có 65 dịng vi khuẩn thuộc chi Pasteuria Trong có 28 dịng vi khuẩn phân lập từ tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu, 11 dòng từ Đồng Nai, 10 dịng từ Bình Dương 16 dịng từ Bình Phước Phần lớn bào tử tìm thấy bên tuyến trùng số tuyến trùng cảm nhiễm tuổi Meloidogyne spp Bằng phân tích hình thái học, vi khuẩn dịng phân lập có hình dạng đặc trưng Vi khuẩn thuộc loại gram dương, có dạng hình chén, mặt lưng bào tử tròn lõi trung tâm dày, mặt bụng tạo thành nếp nhăn đường kính nội bào tử xác định từ 2,7µm-3,9µm Các nội bào tử có khả gắn bám ấu trùng cảm nhiễm tuổi ký chủ Meloidogyne spp Các dòng vi khuẩn nhân giống cách cảm nhiễm ký chủ tuyến trùng Meloidogyne spp mà sau tuyến trùng thả vào chậu đất trồng hồ tiêu tủ vi khí hậu Sau 30 ngày, vi khuẩn tuyến trùng rễ phân tích hình thái cho thấy chúng khơng khác biệt so với dòng phân lập ban đầu Các kết hình thái ký chủ dịng vi khuẩn cho thấy chúng thuộc loài P penetrans Mơ hình tương tác vi khuẩn – tuyến trùng – hồ tiêu mà chúng tơi thiết lập được dùng để nhân giống P penetrans quy mô phịng thí nghiệm Từ khóa: Hồ tiêu, Meloidogyne spp., Pasteuria penetrans, phân lập, tuyến trùng GIỚI THIỆU Tại Việt Nam, hồ tiêu trồng lâu đời hình thành vùng địa lý trồng hồ tiêu chuyên biệt, mang lại giá trị kinh tế cao cho người nông dân Tuy nhiên, việc giữ tăng diện tích hồ tiêu gặp nhiều thách thức xuất nhiều bệnh hại Trong đáng ý bệnh sần rễ tuyến trùng Meloidogyne spp gây nên, từ tạo điều kiện cho loại nấm công làm thối rễ, chậm sinh trưởng chết Hiện nay, để phòng trừ nhóm tuyến trùng này, nơng dân chủ yếu sử dụng biện pháp hóa học Bên cạnh ưu việt mà biện pháp hóa học mang lại cịn ảnh hưởng xấu đến mơi trường sức khỏe người Vì vậy, hồ tiêu, vấn đề phòng trừ tuyến trùng gây hại rễ biện pháp sinh học thực cấp thiết có ý nghĩa kinh tế to lớn Pasteuria penetrans vi khuẩn gram dương, có khả hình thành bào tử ký sinh bắt buộc tuyến trùng Bước chu kỳ sống chúng gắn nội bào tử vào biểu bì ấu trùng cảm nhiễm tuổi Meloidogyne spp Quá trình xảy ấu trùng di chuyển đất nhiễm nội bào tử P penetrans Khi bị nhiễm nội bào tử ấu trùng tuổi Meloidogyne xâm nhập vào rễ bắt đầu dinh dưỡng trước bào tử nảy mầm, ống nảy mầm nhô xuyên qua lớp nội bào tử đâm thủng vách biểu bì tuyến trùng, giải phóng khuẩn lạc dinh dưỡng, khuẩn lạc tiếp tục vỡ ra, sinh sôi nảy nở chiếm ưu khoang thể tuyến trùng làm cản trở sinh sản chúng, từ làm giảm mật độ tuyến trùng đất (Chen Dickson, 1998) Mặc dù kỹ thuật tạo lượng lớn sinh khối vi khuẩn cịn bị hạn chế khơng thể ni cấy môi 1369 Vy Thị Mai Trâm et al trường nhân tạo (Bishop Ellar, 1991) nhiều cơng trình nghiên cứu giới cho thấy loài vi khuẩn có nhiều triển vọng phịng trừ sinh học loài tuyến trùng hại rễ (Chen Dickson, 1998) Tuy nhiên nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu phân lập, nhân sinh khối, triển khai ứng dụng loài vi khuẩn vào phòng trừ sinh học tuyến trùng bướu rễ gây hại trồng Do vậy, nghiên cứu phân lập vi khuẩn P penetrans ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp nhằm mở triển vọng cho việc nghiên cứu sản xuất ứng dụng dòng vi khuẩn vào phòng trừ sinh học bệnh tuyến trùng hại rễ trồng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các mẫu rễ hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng thu vùng trồng tiêu chuyên canh thuộc địa bàn tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước Mỗi nọc tiêu thu khoảng 10g mẫu rễ bị nhiễm tuyến trùng (rễ có nhiều nốt sần) dụng cụ chuyên dụng bảo quản túi nilon điều kiện lạnh 5-10oC Phân lập dòng vi khuẩn thuộc chi Pasteuria Các mẫu rễ sau thu rửa vòi nước, sau tách tuyến trùng Meloidogyne spp từ nốt sần rễ dao kẹp nhỏ Con nghi chứa đầy nội bào tử vi khuẩn nhận diện mờ đục trắng quan sát kính soi chọn lọc bảo quản đệm PBS (Phosphate buffered saline) (Mankau Prasad, 1977) Quan sát diện nội bào tử Pasteuria bên tuyến trùng Meloidogyne spp kính hiển vi quang học (độ phóng đại 100X) Phần rễ lại mẫu sau tách tuyến trùng Meloidogyne spp sử dụng để phân lập tuyến trùng giai đoạn cảm nhiễm (J2) bên rễ theo mô tả Speijer De Waele (1997) Tiến hành lên tiêu tuyến trùng quan sát chúng kính hiển vi quang học để xác định diện bào tử J2 Meloidogyne spp Quan sát đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn phân lập Đặc điểm hình thái vi khuẩn quan sát qua kính hiển vi quang học kính hiển vi điện tử quét (SEM) thông qua phương pháp nhuộm gram tế bào bào tử vi khuẩn mô tả Benson (1990) 1370 kĩ thuật làm tiêu cho SEM theo phương pháp Dykstra (1993) Chuẩn bị dịch treo chứa nội bào tử vi khuẩn Pasteuria spp Nghiền tuyến trùng để giải phóng nội bào tử Sau dịch nghiền lọc qua rây lọc 8µm, thu dịch chứa nội bào tử định lượng bào tử buồng đếm hồng cầu kính hiển vi quang học Ly trích trứng ấp nở tuyến trùng Meloidogyne spp giai đoạn cảm nhiễm tuổi (J2) Ba đến bốn ngày trước thực thí nghiệm, trứng tuyến trùng sần rễ ly trích từ rễ bị nhiễm theo phương pháp mô tả Hussey Barker (1973) J2 Meloidogyne spp ấp nở từ lượng trứng thu phễu Baermann cải tiến theo mô tả Pitcher Flegg (1968) 2-3 ngày nhiệt độ phịng chọn lọc rây lọc kích thước lỗ 26µm J2 định lượng đĩa đếm đồng hồ Kiểm tra khả gắn bám nội bào tử lên J2 Meloidogyne spp Nội bào tử gắn lên J2 cách sử dụng kỹ thuật ly tâm mô tả Hewlett Dickson (1993) với tỷ lệ 103 bào tử/J2 Sau đó, 20 J2 nhặt que gắp chuyên dụng để kiểm trả khả gắn bám nội bào tử kính hiển vi quang học Ni cấy Pasteuria penetrans hệ thống tủ vi khí hậu Thí nghiệm thực tủ vi khí hậu VETC (Versatile Environmental Test Chamber) điều kiện nhiệt độ 26oC, độ ẩm 55%, ánh sáng LS Các tiêu nuôi cấy mô đồng chuyển vào chậu có đánh số thứ tự (đường kính 15cm) chứa đất hấp khử trùng, chậu trồng ủ 1000 J2 gắn vi khuẩn phương pháp ly tâm mô tả với tỷ lệ 103bào tử/J2 Mỗi nghiệm thức nhắc lại 03 lần, có đối chứng Tuyến trùng đưa vào chậu theo bước sau: + Định lượng tuyến trùng đĩa đếm xác định thể tích để ủ với lượng 1000 J2 chậu + Tạo ba lỗ sâu khoảng nửa chậu xung quanh hệ thống rễ đầu đũa thủy tinh Sau đó, đưa J2 vào ba lỗ pipett theo thể tích xác định lấp lỗ lại Hệ thống tiêu trì điều kiện khí hậu kiểm soát cung cấp lượng nước tưới vừa Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(4A): 1369-1377, 2015 đủ ngày 30 ngày sau ủ, hệ thống rễ thu nhận tiến hành phân lập phương pháp mô tả KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập dòng vi khuẩn thuộc chi Pasteuria Từ mẫu rễ thu 30 điểm thuộc địa bàn tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, phân lập 65 dịng vi khuẩn thuộc chi Pasteuria tổng số 139 mẫu nghiên cứu (chiếm 46,76%) Trong đó, 28 dịng vi khuẩn phân lập từ tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, 11 dòng từ tỉnh Đồng Nai, 10 dịng từ tỉnh Bình Dương 16 dịng từ tỉnh Bình Phước (Bảng 1) Các dòng phân lập thu trực tiếp từ ký chủ Meloidogyne spp., vị trí diện bào tử chủ yếu phát bên khoang bụng tuyến trùng Meloidogyne spp cho kết dương tính với phản ứng Gram nhuộm bào tử, có dạng hình chén đặc trưng theo mơ tả Sayre Starr (1985) (Hình 1) Một số mẫu cịn cho thấy có diện bào tử dọc theo thân ấu trùng cảm nhiễm tuổi Meloidogyne spp mà không xuất giống tuyến trùng khác phân lập mẫu rễ Hình A) Mẫu rễ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne spp .B) Tuyến trùng Meloidogyne spp chứa bào tử vi khuẩn Pasteuria quan sát kính hiển vi soi C) Hình ảnh cho kết nhuộm Gram vi khuẩn Pasteuria spp D) Hình ảnh cho kết nhuộm bào tử quan sát kính hiển vi quang học (100X) Bảng Các mẫu phân lập vi khuẩn Pasteuria spp 30 địa điểm khác thuộc tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương Bình Phước Stt Mẫu phân lập HD1A HD1B HD1C HD1D HD1E HD1G HD2B HD3A Phản ứng nhuộm Gram Bào tử + + + + + + + + + + + + + + + + Vị tri phát nội bào tử (*) Pasteuria Stt Mẫu phân lập F, J F F F F, J F F F, J 71 72 73 74 75 76 77 78 SN1A SN1B SN1C SN1D NL1A NL1B NL1C NL1D Phản ứng nhuộm Gram Bào tử + + + + + + Vị tri phát nội bào tử (*) Pasteuria F F F 1371 Vy Thị Mai Trâm et al 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 1372 HD3B HD3C HD3D HD3E HD3F HD3G LL1B LL1C LL1D LL1E LL1F ĐB1A ĐB1B ĐB1C ĐB1D KL1A KL1B KL1C KL2A KL2B KL2C KL2D KL2E QT1A QT1B QT1C QT1D QT1E QT1F XS1A XS1B XS1C XS1D XS1E XS1F HB1A HB1B HB1C HB1D HB1E HH1B HH1D HH1E BL1A BL1B BL1C BL1D BL1E BL1F LS1A LS1B LS1C LS1D LS1E + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - F F F F, J F F F F F F F F F F F F F F F F F F F - 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 NL1E PL1A PL1B PL1C PL1D TP1A TP1B TP1C TP1D LT1A LT1B LT1D LA1C TT1A TT1B TT1C TT1D TT1E TT1F TT1G AB1A AB1B AB1C AB1D AB2B AB2C AB2D AB2D TH1A TH1B TH1C TH1D TH1E TH2A TH2B TH2C TH2D PR1B PR1C PR1D AL1A AL1B MH1A MH1B MH1C MT1B MT1C MT1D MTH1A MTH1B ML1A ML1B ML2A TB1A + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - F F F F F, J F, F F F F F, J F, J F F F F, J F F F F F F F F - Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(4A): 1369-1377, 2015 63 64 65 66 67 68 69 70 BB1A BB1B BB1C BB1D BB1E XT1A XT1B XT1C + + + + - + + + + - F F F F - 133 134 135 136 137 138 139 TB1B TB2A TTH1A TTH1B TTH1C TL1A TL1B + + + + + + F F F (*) F: diện Pasteuria spp bên khoang bụng tuyến trùng trưởng thành Meloidogyne spp.; J: diện Pasteuria spp lớp biểu bì ấu trùng cảm nhiễm tuổi Meloidogyne spp; (-): khơng có diện Pasteuria spp mẫu phân tích Đặc điểm hình thái bào tử vi khuẩn Pasteuria spp phân lập từ tự nhiên Vi khuẩn thuộc chi Pasteuria vi khuẩn nội kí sinh bắt buộc khơng thể ni cấy mơi trường nhân tạo, mà chưa có nghiên cứu việc phân loại loài dựa vào phản ứng sinh hóa lồi vi khuẩn thường gặp Do đó, q trình phân loại lồi thuộc chi Pasteuria dựa hồn tồn vào đặc điểm hình thái chúng như: hình dạng giai đoạn phát triển khác nhau, kích thước mối quan hệ với vật chủ Tuy nhiên, chúng lại có kích thước nhỏ, khó quan sát định lồi kĩ thuật thơng thường Kĩ thuật SEM cho phép quan sát cấu trúc hiển vi với độ phóng đại cao mà khơng thể quan sát kính hiển vi quang học Vì vậy, chúng tơi lựa chọn mẫu có mật độ xuất Pasteuria cao tổng số 65 mẫu dương tính để tiếp tục quan sát hình thái kĩ thuật SEM làm ngun liệu cho thí nghiệm ni cấy vi khuẩn Kết SEM cho thấy bào tử có dạng hình chén, mặt lưng trịn lõi trung tâm dày đặc tạo bề mặt lồi, mặt bụng tạo thành nếp nhăn (Hình3) Đường kính bào tử trưởng thành xác định dao động từ 2.7µm - 3.9µm (Bảng 2) Đồng thời, kết phân tích thống kê khơng cho thấy có khác biệt kích thước trung bình mẫu nghiên cứu khác (p≤0.05) Những đặc điểm hoàn toàn phù hợp với mô tả R M Sayre M P Starr (1985) cho thấy loài Pasteuria penetrans Hình Hình ảnh chụp SEM bào tử vi khuẩn Pasteuria penetrans ký sinh bên khoang tuyến trùng Meloidogyne spp (các chia độ: A=10µm; B, C= 1µm; D=2µm.) 1373 Vy Thị Mai Trâm et al Bảng Kích thước bào tử vi khuẩn Pasteuria penetrans từ dòng vi khuẩn chọn nghiên cứu Mẫu phân lập Trung bình HD1B HD2B Đường kính bào tử (µm) Sai số chuẩn trung bình Khoảng giá trị mẫu 3.12 0.04 3.00 0.04 2.90-3.25 2.85-3.20 HD3A 3.33 0.12 2.80-3.90 LT1D 3.08 0.05 2.90-3.40 PR1B 2.83 0.03 2.70-3.00 TH1B 2.93 0.05 2.70-3.20 TL1B 2.98 0.06 2.80-3.40 TT1B 3.08 0.06 2.90-3.50 TTH1A 2.97 0.06 2.80-3.40 Khả gắn bám dòng vi khuẩn Pasteuria spp lên ấu trùng cảm nhiễm J2 Kết quan sát kính hiển vi quang học cho thấy nội bào tử Pasteuria gắn dọc theo thân J2 (Hình 3) Đếm lượng bào tử gắn lên 20 tuyến trùng J2 kính hiển vi cho thấy có 10,6 bào tử/J2 Kết phù hợp với nghiên cứu Davies cs (1988) khả gắn bám bào tử lên tuyến trùng Hình Hình ảnh quan sát kính hiển vi quang học cho kết gắn bám bào tử Pasteuria lên ấu trùng J2 Meloidogyne spp Nuôi cấy vi khuẩn Pasteuria penetrans Tuyến trùng cảm nhiễm J2 Meloidogyne spp nhiễm bào tử Pasteuria penetrans thả vào đất để chúng ký sinh rễ hồ tiêu tủ vi khí hậu VETC Một tháng sau, chúng tơi tiến hành thu nhận tuyến trùng tách từ rễ (Hình 4) 1374 Kết thu cho thấy, hệ thống rễ tiêu đối chứng khơng có dấu hiệu bị sần tuyến trùng, đồng thời 27 tiêu ủ tuyến trùng dòng vi khuẩn khảo sát bị sần rễ 75% Tiến hành thí nghiệm quan sát hình thái mẫu cho kết giống với kết hình thái ghi nhận từ dịng vi khuẩn phân lập ngồi tự nhiên phù Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(4A): 1369-1377, 2015 hợp với mô tả R M Sayre M P Starr (1985) Từ đặc điểm (Bảng Hình 5) chúng tơi kết luận nhân giống vi khuẩn Pasteuria penetrans phịng thí nghiệm cách chủ động mơ hình tương tác vi khuẩn – tuyến trùng – hồ tiêu Hình A) Các tiêu sau gây nhiễm trì tủ vi khí hậu VETC điều kiện kiểm soát B) Mẫu rễ tiêu đối chứng C) Mẫu rễ tiêu khảo sát thu sau tháng gây nhiễm Pasteuria Bảng Kết quan sát hình thái dịng vi khuẩn P penetrans phân lập từ hệ thống tiêu kiểm sốt tủ vi khí hậu VETC Đặc điểm Kết quan sát Mức độ nhiễm bào tử vi khuẩn P penetrans lên tuyến trùng Meloidogyne spp 30% tuyến trùng xác định có diện vi khuẩn P penetrans Bào tử + Phản ứng gram, nhuộm bào tử + Hình dạng + Đường kính (µm) + Dương tính + Hình chén, bề mặt có lõi trung tâm dày đặc + 2,9 - 3,1 Vị trí phát Bên khoang tuyến trùng Meloidogyne spp thu từ mẫu rễ hồ tiêu Hình Hình ảnh chụp SEM bào tử vi khuẩn P penetrans kí sinh bên khoang tuyến trùng Meloidogyne spp thu sau phân lập hệ thống hồ tiêu thí nghiệm tủ vi khí hậu VETC (các chia độ: A = µm; B = µm.) 1375 Vy Thị Mai Trâm et al KẾT LUẬN the pathogenicity of Pasteuria penetrans a parasite of rootknot nematodes Ann Appl Biol 112: 491-501 Từ 139 mẫu rễ thu vùng trồng tiêu thuộc tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước phân lập 65 dòng vi khuẩn Pasteuria penetrans, dịng quan sát có dạng hình chén, mặt lưng bào tử tròn lõi trung tâm dày, mặt bụng tạo thành nếp nhăn đường kính nội bào tử xác định từ 2,7µm3,9µm, có khả gắn bám lên ký chủ chuyên biệt Meloidogyne spp., tương tự với mô tả tác giả trước Việc nhân giống thành công vi khuẩn mơ hình vi khuẩn – tuyến trùng – hồ tiêu phịng thí nghiệm mở nhiều triển vọng cho việc nghiên cứu sản xuất ứng dụng dòng vi khuẩn vào phòng trừ sinh học bệnh tuyến trùng hại rễ trồng Dykstra MJ (1993) A Manual of Applied Techniques for Biological Electron Microscopy Plenum Press New York Lời cảm ơn: Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí Sở Khoa học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Waterman JT, David MB, Opperman CH (2006) A Method for Isolation of Endospores for Bioassay and Genomic Studies J Nematol 38:165–167 Mankau R, Prasad N (1977) Infectivity of Bacillus penetrans in plant parasitic nematodes J Nematol 9: 40-45 Pitcher RS, Flegg JJ (1968) An improved final separation sieve for the extraction of plant-parasitic nematodes from soil debris Nematologica 14:123-127 Hussey RS, Barker KR (1973) A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp Plant Disease 57: 1025-1028 Sayre RM, Starr MP (1985) Pasteuria penetrans (ex Thorne, 1940) nom Rev., comb N., sp N., a mycelia and endospore-forming bacterium parasitic in plant-parasitic nematode Proceedings of the Helminthological Society of Washington 52: 149-165 TÀI LIỆU THAM KHẢO Speijer PR, De Waele D (1997) INIBAP Technical Guidelines International Plant Genetic Resources Institute 45p Benson HJ (1990) Microbiological applications Wm C Brown Publishers USA pp 56-60 Hewlett TE, Dickson DW (1993) A Centrifugation Method for Attaching Endospores of Pasteuria spp to Nematodes Suppl J Nematol 25: 785-788 Bishop AH, Ellar DJ (1991) Attempts to culture Pasteuria penetrans in vitro Biocontrol Sci Technol 1:101-114 Davies KG, Kerry KR, Flynn CA (1988) Observations on Chen ZX, Dickson DW (1998) Review of Pasteuria penetrans: biology, ecology, and biological control potential J Nematol 30: 313-340 ISOLATION OF PASTEURIA PENETRANS PARASITIZING MELOIDOGYNE SPP NEMATODES ON THE ROOTS OF BLACK PEPPER Vy Thi Mai Tram1,2, Bui Thi Thu Nga2, Nguyen Huu Hung2,3, Do Dang Giap2, Le Thi Anh Hong2, Nguyen Thi Kim Xuan4, Duong Duc Hieu2,* University of Science, Vietnam National University of Ho Chi Minh City Institute of Tropical Biology, Vietnam Academy of Science and Technology Nguyen Tat Thanh University Development and Research Center, Saigon Hi-Tech Park SUMMARY Pasteuria penetrans is a bacterial obligate parasite of root-knot nematodes and shows great potential as a biocontrol agent Roots samples from black pepper in Ba Ria- Vung tau, Dong Nai, Binh Duong, Binh Phuoc provinces were collected for P penetrans isolation The results showed that there were 65 bacterial strains as Pasteuria genus Among isolates, 28 strains were from Ba Ria - Vung Tau, 11 strains from Dong Nai, 10 strains from Binh Duong and 16 strains from Binh Phuoc Most of the endospores were found inside the nematode body and a small number of endospores attached to the cuticle of J2 of Meloidogyne spp * Author for correspondence: E-mail: hieuitb@yahoo.com 1376 Tạp chí Công nghệ Sinh học 13(4A): 1369-1377, 2015 Morphology of these bacterial strains was the same as those described in previous studies The bacteria were positive gram stain, cup-shaped Dorsal sides of sporangia were round and the central body was thick The ventral side was wrinkled Diameter of sporangium of the isolates were 2.70 to 3.90 µm Endospores have the ability to attach to and grow in J2 of Meloidogyne spp that infected the root of black pepper plants growed in climatic chamber 30 days later the bacteria were obtained and showed unchanged morphologic descriptions Therefore, our results demonstrate that the isolated bacterial strains are Pasteuria penetrans which can be infected Meloidigyne spp for multiplication in a laboratoty interaction model of bacteria – nematodes – black pepper Keywords: Black pepper, Meloidogyne spp., Pasteuria penetrans, isolation, nematodes 1377 ... sinh học tuyến trùng bướu rễ gây hại trồng Do vậy, nghiên cứu phân lập vi khuẩn P penetrans ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp nhằm mở triển vọng cho vi? ??c nghiên cứu sản xuất ứng dụng dòng vi. .. ấu trùng cảm nhiễm tuổi Meloidogyne spp mà không xuất giống tuyến trùng khác phân lập mẫu rễ Hình A) Mẫu rễ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne spp .B) Tuyến trùng Meloidogyne spp chứa bào tử vi khuẩn. .. lên ấu trùng J2 Meloidogyne spp Nuôi cấy vi khuẩn Pasteuria penetrans Tuyến trùng cảm nhiễm J2 Meloidogyne spp nhiễm bào tử Pasteuria penetrans thả vào đất để chúng ký sinh rễ hồ tiêu tủ vi khí