Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ đồ uống boz

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG Tên đề tài: T PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GAMMA-POLYGLUTAMIC ACID (γ-PGA) TỪ ĐỒ UỐNG BOZA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG Tên đề tài: T PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GAMMA-POLYGLUTAMIC ACID (γ-PGA) TỪ ĐỒ UỐNG BOZA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : 42 - CNSH Khoá học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : ThS Bùi Tuấn Hà TS Dương Văn Cường Khoa CNSH - CNTP trường ĐHNL Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Thực tập trình học tập sinh viên vận dụng kiến thức, lý luận học ghế nhà trường vào thực tiễn, tạo cho sinh viên làm quen phương pháp làm việc, kỹ công tác Đây giai đoạn thiếu sinh viên trình học tập Trong suốt trình thực tập phòng Công Nghệ Vi Sinh, khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Tôi nhận nhiều giúp đỡ từ ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, thầy cô hướng dẫn, bạn bè gia đình Trước hết xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Tuấn Hà, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên lời cảm ơn sâu sắc Thầy tạo điều kiện, trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ suốt trình thực tập hoàn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn chân thành tới TS Dương Văn Cường, bạn nhóm nghiên cứu cán phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên động viên bảo suốt trình thực tập giúp đỡ hoàn thành khóa luận Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè người động viên, giúp đỡ điểm tựa tinh thần giúp đỡ suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 18 tháng 08 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Phương DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Từ, cụm từ viết tắt APCs Nguyên gốc tiếng anh Antigen Presenting Cells Nghĩa Tế bào trình diện kháng nguyên DNA Deoxyribonucleic Acid Et al Et alii kGy Kilo Gray kDa Kilo Dalton LB Lauria Broth NPs Nanoparticles Nguyên tố nhỏ OD Optical Density Độ hấp phụ ánh sáng ORF Open Reading Fame Khung đọc mở OVA Ovalbumin PGA Polyglutamic Acid PAC Polyalumin Clorua TCA Tricarboxylic Acid Cycle TGEN γ-PGA Transmissible gastro enteritis virus nucleocapsid Gamma Polyglutamic Acid Cộng Chu trình cacbon MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN 2.1 Gamma-Polyglutamic acid 2.1.1 Công thức phân tử 2.1.2 Tính chất vật lý 2.1.3 Ứng dụng gamma-polyglutamic acid 2.1.3.1 Ứng dụng y học 2.1.3.2 Ứng dụng ngành công nghệ thực phẩm 2.1.3.3.Ứng dụng công nghệ mỹ phẩm 2.1.3.4 Ứng dụng xử lí môi trường 2.1.3.5 Ứng dụng ngành chăn nuôi 2.1.3.6 Trong lĩnh vực nông nghiệp 10 2.1.4 Phương pháp kết tủa tinh acid gamma-polyglutamic 11 2.2 Vi khuẩn tổng hợp gamma-polyglutamic acid 13 2.2.1 Đặc điểm phân loại vi khuẩn Bacillus 13 2.2.2 Tổ chức di truyền vi khuẩn Bacillus tổng hợp gamma-polyglutamic acid 14 2.2.3 Quá trình tổng hợp γ-PGA vi khuẩn 15 2.3 Boza - nguồn phân lập vi khuẩn Bacillus 17 2.4 Tình hình nghiên cứu gamma-polyglutamic acid nước nước 19 2.4.1 Tình hình nghiên cứu gamma-polyglutamic acid nước 19 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 20 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 23 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 23 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 23 3.3.1 Hóa chất 23 3.3.2 Thiết bị sử dụng 24 3.3.3 Các môi trường sử dụng 24 3.4 Nội dung nghiên cứu 24 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.5.1 Phương pháp phân lập 25 3.5.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái vi khuẩn 25 3.5.2.1 Hình thái khuẩn lạc 25 3.5.2.2 Hình thái tế bào 25 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa vi khuẩn 25 3.5.3.1 Thử nghiệm khả sinh Catalase 25 3.5.3.2 Thử nghiệm khả sinh oxydase 26 3.5.3.3 Thử nghiệm khả lên men đường glucose 26 3.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới khả sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn 26 3.5.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng gamma polyglutamic acid dịch nuôi cấy 26 3.5.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới khả tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn 27 3.5.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường tới khả tổng hợp γ-PGA vi khuẩn 27 3.5.4.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả tổng hợp gamma polyglutamic acid 27 3.5.5 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 28 3.5.6 Phương pháp nhân giống vi khuẩn 28 3.6 Phương pháp sử lý số liệu 28 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza 29 4.2 Kết nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh tổng hợp gammma polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza 29 4.2.1 Kết nghiên cứu hình thái vi khuẩn BL4 29 4.2.2 Kết nghiên cứu đặc tính sinh hóa vi khuẩn BL4 30 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố lên trình tổng hợp gamma polyglutamic acid 31 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới trình sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid chủng BL4 31 3.3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường tới khả tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn BL4 33 3.3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn BL4 34 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 Tiếng việt 37 Tiếng anh 37 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tính chất vật lý, hóa học gamma-polyglutamic acid Bảng 2.2: Kết khảo sát ảnh hưởng phân bón chứa γ-PGA tới giống sắn KM140 KM 94 10 Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 24 Bảng 4.1: Kết phân lập vi khuẩn tổng hợp γ-PGA từ Boza 29 Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BL4 30 Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa vi khuẩn BL4 31 Bảng 4.4: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh γ-PGA chủng BL4 32 Bảng 4.5: Ảnh hưởng pH tới khả sinh tổng hợp gamma polyglutamic vi khuẩn BL4 33 Bảng 4.6: Ảnh hưởng nguồn cacbon tới tổng hợp gamma polyglutamic vi khuẩn BL4 35 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Công thức cấu tạo gamma-polyglutamic acid Hình 2.2: Kết sử dụng phân bón γ-PGA không sử dụng phân bón γ-PGA 11 Hình 2.3: Sơ đồ phục hồi tinh poly γ-glutamic acid 12 Hình 2.4: Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus 14 Hình 2.5: Tổng hợp γ-PGA tham gia gen tương ứng chủng Bacillus 15 Hình 2.6: Con đường tổng hợp γ-PGA Bacillus subtilis IFO 3335 17 Hình 2.7: Sản phẩm Boza 17 Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn BL4 30 Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới trình sinh tổng hợp gamma polyglutamic vi khuẩn BL4 32 Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng pH tới khả sinh gamma polyglutamic vi khuẩn BL4 34 Hình 4.4: Biểu đồ ảnh hưởng nguồn cacbon tới tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn BL4 35 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Acid gamma polyglutamic (γ-PGA) polyme tự nhiên có tính chất sinh hóa học quan trọng có khả hòa tan nước, phân hủy sinh học, không độc ăn γ-PGA ứng dụng rộng rãi ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm sinh học, y tế, mỹ phẩm, xử lý môi trường lĩnh vực khác (Shih et al 2001) γ-PGA tổng hợp từ số loài vi khuẩn (tất vi khuẩn gram dương), chủ yếu chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống như: vi khuẩn Bacillus subtilis (Bacillus subtilis Natto) phân lập từ natto Nhật Bản (Shih et al 2001), Thua-nao từ Thái Lan, chungkookjang từ Hàn Quốc Bên cạnh sản phẩm lên men kể trên, loại sản phẩm lên men truyền thống quan tâm tới khả phân lập chủng Bacillus có hoạt lực sinh γ-PGA cao Boza Boza biết đến loại đồ uống lên men truyền thống làm từ lúa mì kê, có độ nhớt nồng độ cồn thấp, thường từ 0,5% – %, có vị chua, sản phẩm lành tính giàu dinh dưỡng Trong boza có chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic nấm men có lợi cho sức khỏe như: Lactobacillus brevis subsp lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Enterococcus faecium, Lactobacillus graminis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus rhamnosus, Pediococcus sp Lactobacillus paracasei, Bacillus subtilis (Kivanc et al 2011) Hệ vi sinh vật Boza lên 26 Lấy vi khuẩn đĩa thạch LBA vào que cấy nhúng vào giọt H2O2 Nếu có bọt khí xuất phản ứng (+) tính, ngược lại phản ứng (-) tính 3.5.3.2 Thử nghiệm khả sinh oxydase Nguyên tắc: Phát khả sinh enzyme cytochrome, oxydase vi khuẩn Lấy chút sinh khối vi khuẩn bôi lên giấy lọc Nhỏ thuốc thử (N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride), vòng 10s có mầu tím (+) tính 3.5.3.3 Thử nghiệm khả lên men đường glucose Nguyên tắc: Xác định khả sử dụng nguồn cacbohydrate cụ thể kết hợp với môi trường bản, có sinh H2S Sử dụng môi trường Triple Sugar Iron Agar Test (TSI) Kết sau: - Đáy ống nghiệm: Màu vàng: glucose dương tính; Màu đỏ/không đổi màu: glucose dương tính; Màu đen: sinh H2S; Vỡ thạch: Sinh từ glucose - Mặt nghiêng: Màu vàng: lactose và/hoặc sucrose dương tính; Màu đỏ/không đổi màu: lactose sucrose âm tính 3.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới khả sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn 3.5.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng gamma polyglutamic acid dịch nuôi cấy γ-PGA kết tủa ethanol theo phương pháp Manocha et al (2010) Sau kết thúc trình lên men, tế bào vi khuẩn tách khỏi dịch nuôi cấy phương pháp ly tâm 10.000 rpm 20 phút 4oC Dịch chứa γ-PGA bổ sung lần thể tích ethanol lạnh lắc nhẹ, giữ yên 4oC qua đêm γ-PGA kết tủa thu phương pháp ly tâm 10.000 rpm 20 phút 4oC Sau γ-PGA hòa tan vào nước khử ion chất tạp nhiễm kết tủa loại bỏ cách ly tâm 10.000 rpm 20 27 phút 4oC Tiếp theo lại kết tủa γ-PGA ethanol, kết tủa tách phương pháp ly tâm sấy nhiệt độ 70oC khối lượng không đổi 3.5.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới khả tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn Chủng vi khuẩn nuôi lắc (220 vòng/phút) 100ml môi trường PGM bình tam giác 250ml 37oC Sau khoảng thời gian 12h, 24h, 36h, 48h, 60h 72h tiến hành lấy 10ml dịch nuôi cấy phân tích hàm lượng γ-PGA 3.5.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường tới khả tổng hợp γ-PGA vi khuẩn Chủng vi khuẩn nuôi lắc (220 vòng/phút) 50ml môi trường PGM bình tam giác 250ml 37oC pH ban đầu môi trường điều chỉnh với giá trị: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 dung dịch NaOH 1N HCl 1N Sau 60h nuôi cấy tiến hành xác định hàm lượng γ-PGA 3.5.4.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả tổng hợp gamma polyglutamic acid Chủng vi khuẩn nuôi cấy lắc (220 vòng/phút) nhiệt độ 37oC 50ml môi trường PGM có nguồn cacbon thay glucose (nồng độ 2,5%) sau: Môi trường Nguồn cacbon PGM1 Glucose PGM2 Lactose PGM3 Glycerol PGM4 Sucrose 28 Vi khuẩn nuôi cấy môi trường 37oC, lắc 220 vòng/phút bình tam giác 250ml Sau 60h nuôi cấy tiến hành xác định hàm lượng γPGA dịch nuôi cấy 3.5.5 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Giống vi sinh vật bảo quản môi trường thạch nghiêng LBA nhiệt độ 4oC Sau 2-3 tuần giống vi sinh vật cấy chuyển lần để đảm bảo sức sống ổn định giống vi sinh vật trình nghiên cứu 3.5.6 Phương pháp nhân giống vi khuẩn Dùng que cấy lấy sinh khối từ ống giống cấy vào môi trường LB, sau nuôi lắc (150 vòng/phút) nhiệt độ 37oC 24h Sau kết thúc thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào tăng lên khoảng 108 tế bào/ml (đo OD610nm = 1) cấy chuyển vào môi trường lên men γ-PGA với tỷ lệ 10% (v/v) 3.6 Phương pháp sử lý số liệu Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để tính toán vẽ đồ thị 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza Kết phân lập vi khuẩn từ mẫu đồ uống lên men Boza thể bảng 4.1 Bảng 4.1: Kết phân lập vi khuẩn tổng hợp γ-PGA từ Boza Hàm lượng gamma STT Chủng vi khuẩn BL1 6,6 BL2 4,3 BL3 4,5 BL4 17,4 BL5 - polyglutamic acid (g/l) Kết phân lập thu chủng vi khuẩn khiết ký hiệu BL1, BL2, BL3, BL4, BL5 Qua bảng 4.1 cho thấy khả tổng hợp γ-PGA chủng BL4 tốt nhất, 17,4g/l dịch lên men sau 48h nuôi cấy Điều phù hợp với độ nhớt cao dịch lên men chủng Các chủng lại có hàm lượng γ-PGA thấp, chủng BL5 gần không thu kết tủa ethanol Vì tiến hành lựa chọn chủng BL4 để tiến hành nghiên cứu 4.2 Kết nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh tổng hợp gammma polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza 4.2.1 Kết nghiên cứu hình thái vi khuẩn BL4 Kết nghiên cứu hình thái vi khuẩn BL4 thể bảng 4.2 hình 4.1 30 Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BL4 Chủng BL4 Hình dạng, Màu sắc Bề mặt Ria Hình tròn gần Trắng sữa, Ướt, có nếp nhăn, Ria tròn, trung bình không tiết bám yếu lên bề không (0,2-0,3cm) sắc tố mặt môi trường kích thước Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn BL4 Vi khuẩn BL4 có khuẩn lạc hình tròn gần tròn, kích thước trung bình từ 2-3mm, màu trắng sữa không tiết sắc tố Bề mặt khuẩn lạc BL4 ướt, nhăn, dễ bong khỏi mặt thạch Khuẩn lạc vi khuẩn BL4 có ria không dạng cưa Tế bào vi khuẩn BL4 có đạng hình que, kích thước 0,8 x 1,5 µm, hai đầu tế bào tròn đều, có khả sinh bào tử, phù hợp với đặc tính vi khuẩn Bacillus 4.2.2 Kết nghiên cứu đặc tính sinh hóa vi khuẩn BL4 Một số đặc tính sinh hóa vi khuẩn BL4 đánh giá, kết nghiên cứu trình bày bảng 4.3 31 Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa vi khuẩn BL4 Đặc tính Kết đánh giá Bắt màu nhuộm Gram + Sinh bào tử + Sinh catalase + Sinh oxidase + Phân giải glucosea + Phân giải glucoseb + Phân giải lactoseb - Phân giải sucroseb - Sinh + Sinh H2S + Ghi chú: (+): có, phát triển dương tính; (-): Không, không phát triển âm tính; (a) Chuyển hóa đường tạo acid; (b): Chuyển hóa đường sinh khí Vi khuẩn BL4 có đặc tính sinh hóa đặc trưng vi khuẩn Bacillus, khả sinh catalase, hô hấp hiếu khí, có khả chuyển hóa loại đường tiết acid môi trường, sinh khí H2S Để xác định loài vi khuẩn BL4 cần có nghiên cứu bổ sung đặc tính sinh hóa khác theo hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey phương pháp sinh học phân tử thông qua phân tích trình tự rDNA 16S 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố lên trình tổng hợp gamma polyglutamic acid 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới trình sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid chủng BL4 Kết đánh giá ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trình tổng hợp γ-PGA vi khuẩn BL4 trình bày bảng 4.4 32 Bảng 4.4: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh γ-PGA chủng BL4 Thời gian nuôi cấy OD610nm (h) Hàm lượng gamma polyglutamic acid (g/l) 12 0,2 2,3 24 0,8 4,3 36 1,1 7,9 48 1,2 17,6 60 1,3 21,3 72 1,3 21,2 Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới trình sinh tổng hợp gamma polyglutamic vi khuẩn BL4 Qua bảng 4.4 hình 4.2 cho thấy vi khuẩn BL4 tổng hợp γ-PGA chủ yếu từ pha phát triển (sau 24h lên men) đến pha cân vi 33 khuẩn (sau 60h lên men) Tại thời điểm sau 60h lên men, vi khuẩn tổng hợp sản phẩm nồng độ cao (21,3g/l) Như thời gian nuôi cấy để thu γPGA phù hợp 60h 3.3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường tới khả tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn BL4 pH ảnh hưởng mạnh tới trình xúc tác enzyme vận chuyển chất qua màng tế bào phục vụ cho phát triển tổng hợp sản phẩm vi khuẩn (Andrew Richard and Argyrios Margaritis., 2003) Vì khẳng định pH môi trường có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp γ-PGA vi khuẩn Để đánh giá ảnh hưởng pH tới khả tổng hợp γ-PGA vi khuẩn BL4, vi khuẩn nuôi pH môi trường ban đầu có giá trị khoảng từ 5-8 Kết nghiên cứu trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5: Ảnh hưởng pH tới khả sinh tổng hợp gamma polyglutamic vi khuẩn BL4 Nồng độ gamma polyglutamic pH acid (g/l) 7,2 16,5 21,4 8,7 34 Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng pH tới khả sinh gamma polyglutamic vi khuẩn BL4 Qua bảng 4.5 hình 4.3 ta thấy pH môi trường có ảnh hưởng lớn tới khả sinh γ-PGA vi khuẩn BL4 Môi trường trung tính với pH = phù hợp cho trình tổng hợp nồng độ γ-PGA dịch nuôi cấy đạt nồng độ tới 21,4 (g/l) Khi pH giảm tăng lên làm cho hàm lượng γ-PGA giảm xuống nhanh chóng 3.3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn BL4 Nguồn dinh dưỡng cacbon nhân tố định tới phát triển tổng hợp γ-PGA vi khuẩn Để đánh giá ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon tới tổng hợp γ-PGA vi khuẩn BL4, môi trường lên men PGM thay đổi nguồn cacbon glucose, Lactose, glycerol sucrose Kết nghiên cứu thể thông qua bảng 4.6 35 Bảng 4.6: Ảnh hưởng nguồn cacbon tới tổng hợp gamma polyglutamic vi khuẩn BL4 Nguồn cacbon 0,1% (w/v) Glucose Lactose Glycerol Sucrose 21,4 15,9 23,1 15,2 Hàm lượng gamma polyglutamic acid dịch lên men sau 60h Nồng độ PGA (g/l) 25 20 15 10 Glucose Lactose Glycerol Sucrose Nguồn cacbon Hình 4.4: Biểu đồ ảnh hưởng nguồn cacbon tới tổng hợp gamma polyglutamic acid vi khuẩn BL4 Qua số liệu bảng 4.6 hình 4.4 cho thấy nguồn dinh dưỡng cacbon có ảnh hưởng định tới tổng hợp γ-PGA vi khuẩn BL4 Nguồn cacbon thích hợp glycerol, sau glucose với nồng độ sản phẩm sau 60h lên men 23,1 21,4 g/l Suctose chất cho kết tổng hợp γPGA thấp loại chất khảo sát với hàm lượng γ-PGA 15,2 g/l, thấp 25% so với glycerol có nồng độ môi trường 36 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Từ sản phầm đồ uống lên men truyền thống phân lập chủng vi khuẩn có khả tổng hợp γ-PGA, chủng BL4 có khả tổng hợp γ-PGA cao - Chủng BL4 vi khuẩn gram dương, hình que, có đặc điểm hình thái sinh hóa với nhiều điểm tương đồng với Bacillus subtilis - Điều kiện sinh tổng hợp γ-PGA vi khuẩn BL4 là: môi trường nuôi cấy PGM với nguồn cacbon thay glycerol 2,5%; pH môi trường thời gian nuôi cấy 60h Với điều kiện nuôi cấy cho sản lượng γ-PGA môi trường lên men cao 23,1 g/l 5.2 Kiến nghị Do thời gian điều kiện nghiên cứu hạn chế, để đề tài hoàn thiện cần phải thực nghiên cứu sau đây: - Định danh chủng vi khuẩn BL4 nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng khác nhiệt độ nuôi cấy, nguồn nitơ, khoáng đến sinh tổng hợp γ-PGA vi khuẩn nhằm tối ưu hóa trình - Nghiên cứu ứng dụng chủng BL4 sản xuất γ-PGA sử dụng chủng vào chế phẩm sinh học cần có mặt γ-PGA 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Lê Phước Cường, Lê Thị Xuân Thúy (2013), “Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật tuyển sử dụng axit gamma-polyglutamic để tách loại than hoạt tính ion chì nước”, Tạp chí KHCN-DHDN, số 12 Tô Minh Châu, 2001, Giáo trình thực tập vi sinh vật học, NXB Hà Nội Nguyễn Hương (2005), “Nghiên cứu ứng dụng chất keo tụ PGα21 có khả phân huỷ sinh học”, Tạp chí CN hóa chất, số Nguyễn Quang Huy (2004) “ Hoạt tính bảo vệ polyglutamic acid (PGA) papain chống lại tác dụng tia phóng xạ gamma” Tạp chí KHCN-DHQGHN KHTN & CN TXX Số Tiếng anh Ashiuchi, M., Soda, K., and Misono, H (1999) A poly-γ-glutamate synthetic system of Bacillus subtilis IFO 3336 gene cloning and biochemical analysis of poly-γ-glutamate produced by Escherichia coli clone cells Biochem Biophys Res Commun 263: 6–12 Andrew Richard, Argyrios Margaritis., (2003) Optimization of cell growth and poly(glutamic acid) production in batch fermentation by Bacillus subtilis Biotechnology Letters, Issue 6, pp 465-468 Ben-Zur, N., Goldman, D.M., 2007 γ -Poly glutamic acid: a novel peptide for skin care Cosmetics Toiletries Mag 122 (4), 64–72 Candela, T., Mock, M., and Fouet, A (2005a) CapE, a 47-amino-acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis poly-glutamate capsule synthesis J Bacteriol 187: 7765–7772 Dekie, L., Toncheva, V., Dubruel, P., Schacht, E.H., Barrett, L., Seymour, L.W., 2000 Poly-L-glutamic acid derivatives as vectors for gene therapy J Controlled Release 65, 187–202 38 10 Dengyi X, Guangzheng L, Yunsen L , Xiaoping L, Fengxin Y and Xiaodong z Study on sterlization and storage o f enzymatic preparations by irradiation, Radiat Phys Chem, 42, 1993, pp 617-619 11 Ho, G.H., Ho, T.I., Hsieh, K.H., Lin, P.Y., Yang, J., Yang, K.H., Yang, S.C γ-Polyglutamic Acid Produced by Bacillus Subtilis (Natto): Structural Characteristics, Chemical Properties and Biological Functionalities 2006 Journal of the Chinese Chemical Society, 53, 1363-1384 12 Inbaraj, B.S., Wang, J.S., Lu, J.F., Siao, F.Y., Chen, B.H., 2009 Adsorption of toxic mercury (II) by an extracellular biopolymer poly(γ glutamic acid) Bioresour Technol 100, 200–207 13 Ishwar B Bajaj and Rekha S Singhal, 2009 Sequential optimization approach for enhanced production of gamma polyglutamic acid from newly isolated Bacillus subtilis Food technol Biotechnol 47 (3) 313 322 ISSN 1330-9862 14 Kivanc, M., Yilmaz, M., Cakir , E., 2011 Isolation and identification of lactic acid bacteria from boza and their microbial activity against several reporter strains Turk Biol 35: 313-314.) 15 Kunioka, M., (1997), “Biosynthesis and chemical reactions of poly(amino acid) from microorganisms”, Appl Microbiol Biotechnol, 47, 469-475 16 King, W.E., Fister, R.P., Norris, S.J., 2007 Slow-release fertilizer and method of making and using same WO/024753 17 Li, C., Yu, D.F., Newman, A., Cabral, F., Stephens, C., Hunter, N., Milas, L., Wallace, S.,1998 Complete regression of well-established tumors using novel water-soluble poly (L-glutamic acid)–paclitaxel conjugate Cancer Res 58, 2404–2409 18 Manocha, B., Margaritis, A A Novel Method for the Selective Recovery and Purification gamma-Polyglutamic Acid from Bacillus licheniformis 39 Fermentation Broth 2010 Biochemical 734-736 19 Otani, Y., Tabata, Y., Ikada, Y., 1999 Sealing effect of rapidly curable gelatin-poly (L-glutamic acid) hydrogel glue on lung air leak Ann Thorac Surg 67, 922–926 20 Ornek D , Jayaraman A, Syrett BC , Hsu CH , Mansfeld FB , Wood T Pitting corrosion inhibition of aluminum 2024 bu Baccillus biofilms secreting polyaspartate or γ- polyglutamate Appl Microbiol Biotechnol 2002 Apr: 58(5):651-657 21 Okamoto, S., Yoshii, H., Ishikawa, T., Akagi, T., Akashi, M., Takahashi, M., Yamanishi, K., Mori, Y., 2008 Single dose of inactivated Japanese encephalitis vaccine with poly(γ-glutamic acid) nanoparticles provides effective protection from Japanese encephalitis virus Vaccine 26 (5), 589–594 22 Stadtman ER (1966) Allosteric regulation of enzyme activity Adv Enzymol 28: 41-154 23 Rao M, Porwate A.V, Bhole A G Removal of Cr6+ and Ni2+ from oqueous solution using bagosse and flyash Woste Manage: 2002, 22: 821-830 24 Shi, F., Xu, Z., Cen, P., 2007 “Microbial production of natural poly amino acid”, Science in China Series: Chemistry, vol 50, no 3, pp 291-303 25 Shih, I.L., Van, Y.T., 2001 The production of poly (γ-glutamic acid) from microorganism and its various applications Bioresour Technol 79, 207–225 26 Sakai, K., Sonoda, C., Murase, K., 2000 Bitterness relieving agent WO0021390 27 Sung, M H Chung Park, Chul-Joong Kim, Haryoung Poo, Kenji Soda, Makoto Ashiuchi Natural and edible biopolymer poly-gamma-glutamic acid: synthesis, production, and applications (2005) Chem Rec 5,352 - 66 40 28 Sung, M.H., Kim, C.J., Poo, H.R., Hong, S.P., Lee, J.S., Kim, J.Y., 2006 Composition for adjuvant containing poly-gamma-glutamic WO090968 29 Thorne, C B., Leonard, C.G., 1958 “Isolation of D- and L-glutamyl polypeptides from culture filtrates of Bacillus subtilis”, J Biol Chem., Vol 233, no 5, pp 1109-1112 30 Tanimoto, H., Sato, H., Kuraishi, C., Kido, K., Seguto, K., 1995 High absorption mineral-containing composition and foods US patent US5447,732 31 Tanimoto, H., Fox, T., Eagles, J., Satoh, H., Nozawa, H., Okiyama, A., Morinaga, Y., Susan, J., Fairweather-Tait, S.J., 2007 Acute effect of poly-glutamic acid on calcium absorption in post-menopausal women J Am College Nutr 26 (6), 645–649 32 Uto, T., Wang, X., Akagi, T., Zenkyu, R., Akashi, M., Baba, M., 2009 Improvement of adaptive immunity by antigen-carrying biodegradable nanoparticles Biochem Biophys Res Commun 379 (2), 600–604 33 Urushibata, Y., Tokuyama, S., and Tahara, Y (2002) Characterization of the Bacillus subtilis ywsC gene, involved in γ-polyglutamic acid production J Bacteriol 184: 337–343 34 Yang, L.C., Wu, J.B., Ho, G.H., Yang, S.C., Huang, Y.P., Lin, W.C., 2008 “Effects of Poly-γ-glutamic Acid on Calcium Absorption in Rats” Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Vol 72 No 12 P 3084-3090 35 Yao J., Xu H., Wang J., Yang M, Ouyang P “Removal of Cr (III), Ni (III) and Cu (III), by poly(γ-glutamic acid) from Bacillus subtilis NX-2 J Biomater Sci Polyme Ed 2007; 18:133-204 [...]... chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp γ-PGA Với nhu cầu ngày càng cao về γ-PGA, các nhà nghiên cứu không ngừng tìm kiếm và chọn lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA với hiệu suất cao từ tự nhiên Xuất phát từ vấn đề trên, để phân lập và đánh giá khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn Bacillus trong đồ uống Boza, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phân lập vi khuẩn có khả năng. .. năng sinh tổng hợp gamma- polyglutamic acid từ đồ uống Boza’’ 1.2 Mục đích nghiên cứu - Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ Boza - Nghiên cứu điều kiện: pH, thời gian, môi trường nuôi cấy thích hợp để vi khuẩn tổng hợp γ-PGA cao nhất 1.3 Yêu cầu - Phân lập được các chủng vi khuẩn Bacillus từ Boza - Đánh giá được ảnh hưởng của pH, thời gian, môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh. .. sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn 1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh γ-PGA từ Boza, đánh giá được các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Giúp sinh vi n rèn luyện thành thạo các kỹ thuật vi sinh như: phân lập, nghiên cứu hình thái và động thái sinh tổng hợp γ-PGA của vi. .. and Margaritis 2010) 2.2 Vi khuẩn tổng hợp gamma- polyglutamic acid 2.2.1 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Bacillus Các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng tổng hợp γ-PGA là trực khuẩn gram dương thuộc chủng Bacillus Bacillus là những vi khuẩn gram dương Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng... 2024 giảm sự ăn mòn do vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp γ-PGA hình thành màng sinh học Màng sinh học hình thành do vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtillis làm giảm tốc độ ăn mòn của nhôm 2024 tới 90% Khả năng chống ăn mòn của nhôm 2024 tăng từ 0,15-0,44V do sự hình thành màng sinh học bởi vi khuẩn B subtilis và B licheniformis γ-PGA tổng hợp bởi vi khuẩn cũng có tác dụng làm giảm... 2-Oxoglutaric acid + L-glutamine + (2 H) 2L-glutamic acid GOGAT L-Glutamic acid + NH3 + ATP L-glutamine + ADP + Pi GS Vi khuẩn B anthracis và B subtilis có khả năng chuyển hóa trực tiếp hay gián tiếp L-glutamic acid thành D-glutamic acid Acid 2-Oxoglutaric và LAlanine được tổng hợp từ axit L-glutamic và acid pyruvic D-Alanine được hình thành bởi sự raxemic hóa từ L-Alanine Axit D-glutamic và acid pyruvic được tổng. .. Môi trường LB dùng để nhân giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; pH 7,2 - 7,4 3.4 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp γ-PGA từ Boza 25 - Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn đã phân lập - Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới hoạt tính sinh γ-PGA của vi khuẩn: thời gian nuôi cấy, pH ban... cấy tới khả năng tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn Chủng vi khuẩn được nuôi lắc (220 vòng/phút) trong 100ml môi trường PGM trong bình tam giác 250ml ở 37oC Sau những khoảng thời gian 12h, 24h, 36h, 48h, 60h và 72h tiến hành lấy 10ml dịch nuôi cấy và phân tích hàm lượng γ-PGA 3.5.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn Chủng vi khuẩn. .. năng tổng hợp gamma polyglutamic acid 3.5.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn 3.5.2.1 Hình thái khuẩn lạc Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LBA ở nhiệt độ 37oC trong 24h và đánh giá hình thái khuẩn lạc vi khuẩn với các tiêu chí: Kích thước, hình dạng, màu sắc, bề mặt, ria của khuẩn lạc 3.5.2.2 Hình thái tế bào Tiêu bản nhuộm Gram của vi khuẩn được quan sát trên kính hiển vi. .. đã chứng minh là có khoảng 45 chủng vi khuẩn axit lactic được phân lập từ 10 mẫu khác nhau của Boza được sản xuất ở Thổ Nhĩ Kỳ Các chủng đã được thử nghiệm là có hoạt động ức chế chống lại vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm Vi khuẩn lactic phân lập có hoạt 19 tính kháng khuẩn được xác định là Lactobacillus brevis subsp lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus