Phân lập, tuyển chọn và đặc tính chủng vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, chịu ph và sinh tổng hợp cellulase để xử lý nước thải nhà máy giấy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ DINH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐẶC TÍNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG CHỊU NHIỆT, CHỊUpH VÀ SINH TỔNG HỢP CELLULASE ĐỂ XỬ LÝ NƢỚC THẢI NHÀ MÁY GIẤY LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI -2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ DINH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐẶC TÍNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG CHỊU NHIỆT, CHỊU pH VÀ SINH TỔNG HỢP CELLULASE ĐỂ XỬ LÝ NƢỚC THẢI NHÀ MÁY GIẤY Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 14005063 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TRẦN LIÊN HÀ GS.TS PHẠM VĂN TY HÀ NỘI - 2017 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Các kết luận văn đƣợc nhóm nghiên cứu chúng tơi thực dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Trần Liên Hà trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, sinh viên học tập làm việc phòng thí nghiệm mơn Vi sinh – Hóa sinh Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội Lab Vi sinh phòng Thử nghiệm 1, cơng ty cổ phần Chứng nhận Giám định VinaCert Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đƣợc đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo luận văn Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, Ngày tháng năm 2017 Tác giả Vũ Thị Dinh LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LỜI CẢM ƠN Bản luận văn thạc sỹ đƣợc thực hoàn thành Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội phòng Lab Vi sinh – Cơng ty cổ phần Chứng nhận Giám định VinaCert Để hoàn thành đƣợc luận văn cố gắng nỗ lực thân, nhận đƣợc nhiều giúp đỡ từ thầy cơ, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Trƣớc tiên tơi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà, công tác Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi tận tình, chu đáo suốt trình nghiên cứu thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.TS Phạm Văn Ty ngƣời hƣớng dẫn tơi q trình thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Bùi Thị Việt Hà thầy cô giáo môn Vi sinh vật – Khoa Sinhhọc – Trƣờng Đại học Khoa Học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập để hồn thành khóa học Tơi xin gửi lời cảm ơn tới em Phan Thị Thu Nga, Hồng Trung Dỗn thuộc phòng thí nghiệm Bộ mơn Vi sinh - Hóa sinh – Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, đồng nghiệp gia đình giúp đỡ suốt thời gian vừa qua Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày……Tháng… năm 2017 Tác giả Vũ Thị Dinh LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG - TỔNG QUAN .3 1.1 Tình hình phát triển ngành sản xuất giấy bột giấy 1.1.1 Sự phát triển công nghiệp giấy giới 1.1.2 Sự phát triển ngành giấy Việt Nam .4 1.2 Công nghệ sản xuất giấy - bột giấy đặc tính nƣớc thải .5 1.2.1 Công nghệ sản xuất bột giấy đặc tính nƣớc thải 1.2.2 Cơng nghệ sản xuất giấy (xeo giấy) đặc tính nƣớc thải 10 1.3 Công nghệ xử lý nƣớc thải nhà máy giấy 13 1.3.1 Tiền xử lý 14 1.3.2 Xử lý bậc 14 1.3.3 Xử lý bậc 15 1.3.4 Xử lý bậc 16 1.4 Các giải pháp công nghệ vi sinh ứng dụng xử lý nƣớc thải .16 1.4.1 Phƣơng pháp yếm khí 16 1.4.1.1 Nguyên tắc chung xử lý yếm khí 16 1.4.1.2 Q trình cơng nghệ xử lý yếm khí 17 1.4.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới hiệu suất cơng nghệ xử lý yếm khí 17 1.4.2 Phƣơng pháp xử lý sinh học hiếu khí 18 1.4.2.1 Nguyên tắc xử lý hiếu khí 18 1.4.2.2 Quy trình cơng nghệ xử lý hiếu khí .18 1.4.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới q trình xử lý hiếu khí .19 1.5 Vi sinh vật phân giải cellulose 20 1.5.1 Giới thiệu chung vi sinh vật phân giải cellulose 20 1.5.2 Đặc điểm loài Bacillus ứng dụng xử lý nƣớc thải .22 1.6 Chế phẩm vi sinh công nghệ xử lý nƣớc thải 23 CHƢƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .26 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất .26 2.2.1 Thiết bị dụng cụ 26 2.2.2 Hóa chất môi trƣờng .26 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phƣơng phân tích xác định thơng số chất lƣợng nƣớc thải 28 2.3.1.1 Xác định pH 28 2.3.1.2 Xác định COD 28 2.3.1.3 Hàm lƣợng chất rắn lơ lửng 29 2.3.1.4 Chỉ số thể tích bùn 29 2.3.2 Phƣơng pháp phân lập chủng vi khuẩn 29 2.3.3 Phƣơng pháp tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase .30 2.4 Định danh vi khuẩn 31 2.4.1 Phƣơng pháp định danh dựa đặc tính sinh lý, sinh hóa .31 2.4.2 Định danh phƣơng pháp sinh học phân tử 34 2.5 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng chủng 36 2.5.1 Chuẩn bị giống 36 2.5.2 Các yếu tố khảo sát 36 2.6 Phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn .36 2.7 Phƣơng pháp tạo chế phẩm 37 2.8 Thử nghiệm khả xử lý nƣớc thải nhà máy giấy 38 2.8.1 Thử nghiệm khả xử lý nƣớc thải nhà máy giấy quy mô 250 ml 38 2.8.2 Thử nghiệm khả xử lý nƣớc thải nhà máy giấy quy mô 5l .38 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Khảo sát tiêu chất lƣợng nƣớc thải nhà máy giấy 40 3.2 Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tínhcellulase 41 3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao 42 3.3.1 Tuyển chọn dựa phƣơng pháp cấy chấm điểm 42 3.3.2 Tuyển chọn dựa phƣơng pháp đục lỗ thạch 44 3.3.3 Tuyển chọn dựa phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase 45 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 3.4 Định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn .46 3.4.1 Đặc tính hình thái sinh lý – sinh hóa chủng TD 46 3.4.2 Định danh sinh học phân tử .47 3.5 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng tới sinh trƣởng chủngB subtilisTD 50 3.5.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng chủng B.subtilis TD .50 3.5.2 Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến sinh trƣởng chủng B subtilis TD 51 3.5.3 Ảnh hƣởng pH ban đầu đến sinh trƣởng chủng B subtilisTD 52 3.5.4 Ảnh hƣởng hàm lƣợng pepton đến sinh trƣởng B subtilisTD 54 3.5.5 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống đến sinh trƣởng chủng B subtilisTD 55 3.6 Chế phẩm BioTD .56 3.7 Thử nghiệm khả xử lý nƣớc thải chủng B subtilisTD .57 3.7.1 Thử nghiệm xử lý quy mô 250ml 57 3.7.2 Thử nghiệm xử lý nƣớc thải quy mơ bình l 59 3.7.3 Tốc độ lắng bùn sau xử lý 61 KẾT LUẬN .63 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC BẢNG 69 PHỤ LỤC HÌNH .77 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DANH MỤC VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích DNS Acid Dinitrosalicylic CFU Colony-Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) VSV Vi sinh vật BOD Nhu cầu oxy sinh học (Biochemical Oxygen Demand) COD Nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand ) TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam QCVN Quy chuẩn Việt Nam BTNVMT Bộ Tài nguyên Môi trƣờng TCHQ Tổng cục Hải quan TCCP Tiêu chuẩn cho phép TSS Hàm lƣợng chất rắn lơ lửng (Total Suspended Solid) SVI Chỉ số thể tích bùn (Sludge Volume Index) SS Bột giấy (Suspended solid) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Chất lƣợng nƣớc thải số nhà máy giấy bột giấy 10 Bảng 2: Một số vi sinh vật phân hủy cellulose 21 Bảng 1: Chất lƣợng nguồn nƣớc thải 40 Bảng 2: Các chủng phân lập đƣợc từ nƣớc thải nhà máy giấy .41 Bảng 3: Khả phân giải cellulose chủng chọn lọc thông qua phƣơng pháp cấy chấm điểm 43 Bảng 4: Khả phân giải cellulose chủng qua phƣơng pháp đục lỗ thạch 44 Bảng 5: Hoạt lực enzyme chủng tuyển chọn 45 Bảng 6: Đặc tính sinh lý - sinh hóa chủng TD 47 Bảng 7: So sánh chất lƣợng bảo quản chế phẩm điều kiện khác 56 Bảng 8: Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống đến hiệu suất xử lý quy mô 250 ml 58 Bảng 9: Hiệu suất xử lý COD chủng B subtilis TD quy mô l 60 Bảng 10: Tốc độ lắng nƣớc thải nhà máy giấy sau xử lý chế phẩm BioTD 62 Bảng PL 1: Nồng độ đƣờng glucose OD540nm tƣơng ứng xây dựng đƣờng chuẩn đo hoạt lực enxyme phân giải celluose .69 Bảng PL 2: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển chủng B subtilisTD .70 Bảng PL 3: Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến phát triển chủng B subtilisTD 71 Bảng PL 4: Ảnh hƣởng pH đến phát triển chủng B subtilisTD .72 Bảng PL 5: Ảnh hƣởng hàm lƣợng pepton đến phát triển chủng B subtilisTD 74 Bảng PL 6: Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống đến phát triển chủng B subtilisTD 75 Bảng PL 7: Khả xử lý nƣớc thải chủng B.subtilisTD quy mô 250 ml .76 Bảng PL 8: Khả xử lý nƣớc thải chủng B.subtilisTD quy mô l 76 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cơ cấu thị trƣờng xuất giấy sản phẩm giấy tháng 2016 Hình 2: Sơ đồ cơng nghệ Kraft, nguồn thải tác nhân gây nhiễm Hình 3: Sơ đồ cơng nghệ sản xuất bột hóa nhiệt Hình 4: Sơ đồ công nghệ sản xuất bột giấy từ giấy thải Hình 5: Sơ đồ công nghệ sản xuất giấy từ bột giấy 11 Hình 6: Sơ đồ hệ thống tuần hoàn nƣớc trình xeo giấy 12 Hình 1: Các mẫu nƣớc thải sở sản sử dụng cho q trình phân tích 40 Hình 2: Hoạt lực cellulase chủng vi khuẩn qua phƣơng pháp cấy chấm điểm 44 Hình 3: Hoạt lực cellulase chủng vi khuẩn qua phƣơng pháp đục lỗ thạch 45 Hình 4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng TD 46 Hình 5: Sản phẩm PCR chủng TD (Với: -ve: mẫu nƣớc; +ve: chủng E.coli) 48 Hình 6: Tƣơng quan cấu trúc 16S rRNA chủng TD với chủng khác .49 Hình 7: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng chủng B subtilisTD đo thời điểm 24 50 Hình 8: Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến sinh trƣởng chủng B subtilisTD đo thời điểm 24 .52 Hình 9: Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng chủng B subtilisTD đo thời điểm 24 53 Hình 10: Ảnh hƣởng hàm lƣợng peptone đến sinh trƣởng chủng B subtilisTD đo thời điểm 24 54 Hình 11: Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống đến sinh trƣởng chủng B subtilisTD đo thời điểm 24 55 Hình 12: Chế phẩm B subtilis TD 56 Hình 13: Khả xử lý nƣớc thải chủng B subtilisTD mật độ khác quy mô 250 ml 57 Hình 14: Khả xử lý nƣớc thải chế phẩm BioTD quy mô l 59 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thêm đặc tính nƣớc thải nhà máy giấy: hàm lƣợng cellulose, hàm lƣợng hemicellulose,… khảo sát tiếp khả sinh enzyme laccase, xylanase,… Xác định nồng độ oxy hòa tan nƣớc thải khảo sát ảnh hƣởng nồng độ oxy hòa tan đến sinh trƣởng khả xử lý nƣớc thải nhà máy giấy chủng TD; Điều kiện xử lý nƣớc thải phòng thí nghiệm so với trạm xử lý khác nhau, tiếp tục thử nghiệm khả xử lý nƣớc thải chế phẩm BioTD quy mô lớn hơn: quy mô pilot, quy mơ thực nghiệm; Hoạt hóa bùn trƣớc khảo sát khả xử lý nƣớc thải nhà máy giấy chủng B.subtilis TD kết hợp với chủng phân giải cellulose khác để rút ngắn thời gian xử lý VŨ THỊ DINH 64 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.Trần Việt Ba (2012),Nghiên cứu nâng cao hiệu xử lý bể hiếu khí cách điều chỉnh dinh dưỡng thích hợp cho vi khuẩn hệ thống xử lý nước thải nhà máy giấy Bãi Bằng, Luận án Thạc sĩ Khoa học, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Bộ Công Thƣơng (2016), Thị trường giấy tháng 5/2016 dự báo,Phòng Thơng tin Kinh tế Quốc tế - Trung tâm Thông tin Công nghiệp Thƣơng mại Bộ Giáo dục Đào tạo, Bộ Công thƣơng (2008),Tài liệu hướng dẫn sản xuất - Sản xuất Giấy Bột giấy Bộ Tài nguyên & Môi trƣờng (2010),“Báo cáo Môi trƣờng quốc gia năm 2009”, Môi trường Khu công nghiệp Việt Nam Nguyễn Lân Dũng, Ngơ Đình Quyết, Phạm Văn Ty(2009),Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Hà Nội Habubank Security (2009), Báo cáo tóm tắt ngành giấy Việt Nam Trần Liên Hà (2008),Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học vi sinh vật để xử lý nước hồ bị ô nhiễm, Báo cáo Khoa học, Mã số 01C-09/08-2006-2, Sở Khoa học Công nghệ Hà Nội Phạm Bích Hiên, Đào Văn Thơng, Lƣơng Hữu Thành, Vũ Thúy Nga (2011), “Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân giải xenluloza cao cho sản xuất chế phẩm xử lý phế thải chăn ni dạng rắn”,Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 3(24), tr.1-8 Trịnh Lê Hùng (2008), Nghiên cứu xử lý tái sử dụng nước thải nhà máy giấy công suất vừa nhỏ, Chuyên đề 4, Xử lý nước thải xeo giấy phương pháp sinh học hiếu khí,Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội 10 Trịnh Lê Hùng (2009), Kỹ thuật xử lý nước thải, Nhà xuất Giáo dục Hà Nội 11 Ngô Thị Nga, Trần Văn Nhân (2002), Giáo trình cơng nghệ xử lý nước thải, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật VŨ THỊ DINH 65 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 12 Võ Văn Nhân, Trƣơng Quang Bình (2010), Thử nghiệm xử lý nước thải nhà máy chế biến thủy sản vi sinh vật, Trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh 13 Trần Non Nƣớc, Võ Văn Son, Dƣơng Thị Hƣơng Giang, Trần Nhân Dũng (2012), “Tuyển chọn tối ƣu hóa vi khuẩn kỵ khí sinh tổng hợp enzyme cellulase chất bột giấy”,Tạp chí Khoa họcĐại học Cần Thơ, 22b, tr 43-53 14 Nguyễn Nhƣ Ngọc, Nguyễn Văn Cách, Phạm Thị Thùy Giang, Trần Liên Hà (2016), “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh xử lý nƣớc thải làng nghề chế biến tinh bột dong riềng từ chủng Bacillus địa”,Tạp chí KH & CN Lâm Nghiệp Đại học Lâm Nghiệp, 5,tr 3-9 15 Nguyễn Thị Lan Phƣơng, Đỗ Thu Hà (2014), “Xác định chủng vi khuẩn Bacillus sp phân giải protein thử nghiệm xử lý nƣớc thải thủy sản”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Đà Nẵng,11(84), tr 113 16 Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn (2009),“Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nƣớc thải”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 25, tr 101-106 17 Huỳnh Văn Tiền, Cao Ngọc Điệp Trƣơng Trọng Ngôn (2015), “Tối ƣu hóa khả tổng hợp chất kết tụ sinh học chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai KG12S thử nghiệm xử lý nƣớc thải sau biogas từ trại chăn ni heo”,Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 37(1),tr 32-41 18 Tổng cục Môi trƣờng (2011), Tài liệu Kỹ thuật – Hướng dẫn đánh giá phù hợp công nghệ xử lý nước thải giới thiệu số công nghệ xử lý nước thải ngành Chế biến thuỷ sản, Dệt may, Giấy bột giấy 19 Chế Thị Mai Trang (2016), Ngành Bao bì giấy - Ngành cơng nghiệp phụ trợ cần đánh thức Việt Nam hội nhập sâu rộng FTAs, BaoViet Securities 20 TCVN 6168:2002,Chế phẩm vi sinh vật phân giải Xenlulo 21 TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007),Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật VŨ THỊ DINH 66 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 22 TCVN 6491:1999,Chất lượng nước - Xác định nhu cầu oxi hóa học 23 TCVN 6492:2011,Chất lượng nước - Xác định pH 24 TCVN 6625:2000,Chất lượng nước - Xác định chất rắn lơ lửng cách lọc qua lọc sợi thủy tinh 25 Đào Thị Hồng Vân (2012), Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật địa nhằm xử lý nước thải sinh hoạt đô thị,Luận án Tiến sỹ Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội Tiếng Anh 26 Bahar K I., Zeynep C., Orhan I (2011),“Pollution Prevention in the Pulp and Paper Industries” Environmental management in Practice, 11, pp 223 – 246 27 BalasubramanianEr.N.,MuthukumarDr.M (2012),“Performance of HUASB reactor for treating paper & pulp wastewater using Effective Microoranism (EM)”, International Journal of Engineering Science and Technology (IJEST), 4(06), pp 2453 – 2461 28 Deng S.B., Bai R.B., Hu X.M., Luo Q.(2003), “Characteristics of a bioflocculant produced by Bacillus mucilaginosus and its use in starch wastewater treatment”, Appl Microbiol Biotechnol, 60(5), pp 588–593 29 Desalegn A (2014), “Characterization of Wastewater and Evaluation of the Effectiveness of the Wastewater Treatment Systems in Slaughterhouses”,Research Journal of Chemical and Environmental Sciences,2(6),pp 20-27 30 Ganesh D S., YungC L., WenM.C., MingD B., JoS C (2009),“Isolation of cellulose-hydrolytic and applications of the cellulotic enzymes for cellulosic biohydrogen production”, Enzyme and Microbial Technology, 44, pp 417-425 31 Key M., Thompson G., SwainJ., ForsterC.F (2001), “The treatment of pulp and paper mill effluent – a review”, Bioresource Technology,77, pp 275 – 286 32 LöwénM., PiirtolaL (2007), Characterization of activated sludge flocs Wat Res., 30(7), pp.1695 – 1701 33 Michael R (2015),“Paper Production Levels Off”, Vital Signs, January 20 VŨ THỊ DINH 67 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 34 MillerG.L (1959),“Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”,Analytical Chemistry, 31(3), pp 426-428 35 Qiaoyun H., Huayong W., Peng C., Jeremy B.F.,Wenli C (2015), “Atomic force microscopy measurements of bacterial adhesion and biofilm formation onto clay-sized particles”, Scientific report, pp 1-12 36 Richard D., Sherry S W (2004), “Amplification of ribosomal RNA sequences”, Molecular Microbial Ecology Manual, Second Edition,3(1), pp 509–522 37 Richard R (2009), “Bacteria in Wastewater - Common Microorganisms in Wastewater Treatment”, EzineArticles, pp 472 38 Rick S., Dan W (2010), “Activated Sludge Process Control Manual - State of Michigan Department of Environmental Quality”, Training manual for wastewater treatment plant operators,pp 21 39 Sagar A (2016), Biochemical test and identification of Bacillus subtilis, Microbiology info 40 Thirugnanasambandham K., Sivakumar V., “Analysis of Efficiency of Bacillus subtilis To Treat Bagasse Based Paper and Pulp Industry Wastewater”, A Novel Approach,58(2), pp 198 – 204 41 Zhineng H., Rong X., CaiP., DaiK., LiangW., ChenW., HuangQ (2012),“Initial adhesion of Bacillus subtilis on soil minerals as related to their surface properties”,European Journal of Soil Science, 63(4), pp 457-466 VŨ THỊ DINH 68 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHỤ LỤC BẢNG Bảng PL 1: Nồng độ đƣờng glucose OD540nmtƣơng ứng xây dựng đƣờng chuẩn đo hoạt lực enxyme phân giải celluose Glucose (mL) 100 200 300 400 500 600 Nƣớc (mL) 900 800 700 600 500 400 Nồng độ (mg/mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,141 0,457 0,795 1,134 1,513 1,767 OD540nm VŨ THỊ DINH 69 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bảng PL 2: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển chủng B subtilisTD Thời gian (giờ) 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 o 20 C 0,0327± 0,0008 0,0397± 0,0034 0,0560± 0,0024 0,0627± 0,0023 0,0826± 0,0040 0,1059± 0,0062 0,1223± 0,0013 0,1530± 0,0018 0,1747± 0,0016 0,1790± 0,0011 0,1812± 0,0013 0,1851± 0,0023 0,1854± 0,0064 0,1870± 0,0059 0,1854± 0,0058 0,1869± 0,0062 0,1871± 0,0054 VŨ THỊ DINH o 25 C 0,0324± 0,0036 0,0379± 0,0028 0,0632± 0,0019 0,0925± 0,0098 0,1126± 0,0025 0,1272± 0,0057 0,1705± 0,0084 0,1901± 0,0003 0,2039± 0,0034 0,2110± 0,0002 0,2092± 0,0050 0,2184± 0,0042 0,2151± 0,0088 0,2138± 0,0010 0,2152± 0,0016 0,2198± 0,0148 0,2125± 0,0011 o 30 C 0,0309± 0,0004 0,0405± 0,0009 0,0909± 0,0002 0,2400± 0,0065 0,3483± 0,0083 0,4191± 0,0123 0,4666± 0,0007 0,5052± 0,0211 0,5352± 0,0306 0,5699± 0,0006 0,6000± 0,0006 0,6084± 0,0055 0,6428± 0,0122 0,6898± 0,0009 0,6837± 0,0303 0,7032± 0,0408 0,6942± 0,0725 OD600nm 35oC 0,0302± 0,0004 0,0443± 0,0027 0,0862± 0,0042 0,3199± 0,0136 0,4564± 0,0069 0,5440± 0,0070 0,6428± 0,0278 0,7183± 0,0070 0,8795± 0,0153 0,9057± 0,0064 1,0025± 0,0057 1,1523± 0,0059 1,2656± 0,0353 1,2598± 0,0136 1,2716± 0,0158 1,2332± 0,0141 1,2291± 0,0125 70 40oC 0,0323± 0,0026 0,0575± 0,0041 0,0913± 0,0040 0,2872± 0,0054 0,4442± 0,0110 0,5270± 0,0088 0,6069± 0,0090 0,6886± 0,0116 0,7951± 0,0185 0,8334± 0,0185 0,8903± 0,0154 0,9633± 0,0097 0,9888± 0,0006 1,0556± 0,0612 0,9897± 0,0058 0,9823± 0,0113 1,0097± 0,0508 45oC 0,0321± 0,0003 0,0500± 0,0002 0,0977± 0,0064 0,2789± 0,0033 0,3975± 0,0042 0,5011± 0,0032 0,5888± 0,0063 0,6554± 0,0098 0,7110± 0,0259 0,7799± 0,0279 0,8498± 0,0221 0,9434± 0,0150 0,9547± 0,0313 0,9884± 0,0448 0,9654± 0,0184 0,9490± 0,0237 0,9612± 0,0756 50oC 0,0304± 0,0008 0,0333± 0,0012 0,0449± 0,0008 0,0543± 0,0031 0,0725± 0,0026 0,0792± 0,0073 0,0918± 0,0020 0,1019± 0,0021 0,2211± 0,0030 0,2350± 0,0068 0,2493± 0,0086 0,2632± 0,0016 0,2795± 0,0012 0,2865± 0,0001 0,2776± 0,0103 0,2816± 0,0010 0,2844± 0,0042 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bảng PL 3: Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến phát triển chủng B subtilisTD Thời gian (giờ) 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 vòng/phút 0,0342± 0,0032 0,0453± 0,0016 0,0811± 0,0006 0,3000± 0,0007 0,4614± 0,0144 0,5536± 0,0163 0,6328± 0,0316 0,7547± 0,0319 0,8763± 0,0081 0,9072± 0,0057 1,0212± 0,0155 1,1440±0,0027 1,2675± 0,0057 1,2685±0,0019 1,2082± 0,0113 1,2153± 0,0084 1,2051± 0,0099 VŨ THỊ DINH OD600nm 50 100 150 200 vòng/phút vòng/phút vòng/phút vòng/phút 0,0334± 0,0327± 0,0380± 0,0307± 0,0022 0,0021 0,0074 0,0008 0,0451± 0,0011 0,0812± 0,0009 0,3024± 0,0016 0,7632± 0,0125 1,0543± 0,0692 1,3725± 0,0056 1,4051± 0,0068 1,4139± 0,0107 1,4079± 0,0091 1,4166± 0,0064 1,4164± 0,0052 1,4118± 0,0021 1,4378± 0,0093 1,4062± 0,0084 1,4063± 0,0059 1,3963± 0,0074 0,0460± 0,0012 0,0799± 0,0011 0,3330± 0,0107 0,9631± 0,0344 1,3105± 0,0151 1,4526± 0,0219 1,5152± 0,0353 1,5352± 0,0306 1,5222± 0,0013 1,5280± 0,0060 1,5132± 0,0115 1,5218± 0,0151 1,5202± 0,0163 1,5045± 0,0221 1,5168± 0,0202 1,5073± 0,0097 0,0509± 0,0004 0,0819± 0,0003 0,3733± 0,0082 1,2481± 0,0424 1,6206± 0,0136 1,7103± 0,0133 1,7760± 0,0117 1,7898± 0,0134 1,7793± 0,0110 1,7706± 0,0010 1,7767± 0,0049 1,7850± 0,0075 1,7512± 0,0398 1,7364± 0,0180 1,7620± 0,0007 1,7524± 0,0156 71 0,0540± 0,0006 0,0907± 0,0049 0,3875± 0,0058 1,1257± 0,0381 1,5035± 0,0247 1,6600± 0,0096 1,6496± 0,0031 1,6442± 0,0057 1,6346± 0,0066 1,6369± 0,0076 1,6246± 0,0201 1,6422± 0,0001 1,6077± 0,0064 1,6269± 0,0083 1,6199± 0,0010 1,6182± 0,0028 250 vòng/phút 0,0331± 0,0013 0,0600± 0,0002 0,0982± 0,0057 0,3989± 0,0033 1,1998± 0,0005 1,4577± 0,0063 1,6054± 0,0043 1,6055± 0,0070 1,6000± 0,0018 1,6067± 0,0049 1,6032± 0,0055 1,5903± 0,0148 1,5960± 0,0047 1,5999± 0,0148 1,5960± 0,0188 1,6016± 0,0002 1,5925± 0,0045 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bảng PL 4: Ảnh hƣởng pH đến phát triển chủng B subtilisTD OD600nm Thời gian (giờ) pH = pH = pH = pH = pH = 0,0429± 0,0413± 0,0401± 0,0435± 0,0424± 0,0035 0,0074 0,0029 0,0021 0,0012 0,0425± 0,0451± 0,0456± 0,0528± 0,0559± 0,0006 0,0040 0,0000 0,0018 0,0003 0,0433± 0,0463± 0,0439± 0,0789± 0,0822± 0,0004 0,0010 0,0053 0,0008 0,0030 0,0458± 0,0474± 0,0429± 0,3037± 0,3902± 0,0005 0,0054 0,0014 0,0049 0,0035 0,0462± 0,0495± 0,0403± 1,1087± 1,4100± 0,0038 0,0016 0,0011 0,0076 0,0042 0,0481± 0,0512± 0,0423± 1,5007± 1,6063± 0,0085 0,0002 0,0025 0,0034 0,0071 0,0447± 0,0417± 0,0398± 1,6771± 1,8453± 0,0004 0,0045 0,0117 0,0016 0,0070 0,0474± 0,0432± 0,0459± 1,7198± 2,1564± 0,0025 0,0028 0,0001 0,0062 0,0008 0,0460± 0,0444± 0,0478± 1,7051± 2,1051± 0,0008 0,0032 0,0028 0,0040 0,0231 0,0432± 0,0429± 0,0432± 1,7218± 2,0878± 0,0010 0,0007 0,0018 0,0132 0,0626 0,0418± 0,0471± 0,0450± 1,7161± 2,1182± 0,0011 0,0021 0,0025 0,0182 0,0056 0,0443± 0,0419± 0,0453± 1,7106± 2,0622± 0,0016 0,0018 0,0021 0,0083 0,0706 0,0441± 0,0451± 0,0466± 1,7082± 2,0675± 0,0015 0,0054 0,0018 0,0030 0,0062 12 15 18 21 24 27 30 33 36 VŨ THỊ DINH 72 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN OD600nm Thời gian (giờ) pH = pH = pH = pH = 10 pH = 11 0,0380± 0,0436± 0,0420± 0,0147± 0,0139± 0,0074 0,0021 0,0025 0,0005 0,0008 0,0509± 0,0503± 0,0491± 0,0138± 0,0134± 0,0004 0,0013 0,0011 0,0001 0,0012 0,0819± 0,0681± 0,0730± 0,0147± 0,0124± 0,0003 0,0008 0,0006 0,0000 0,0006 0,3665± 0,3746± 0,0860± 0,0144± 0,0134± 0,0170 0,0059 0,0040 0,0015 0,0002 1,2073± 1,2692± 0,1138± 0,0140± 0,0135± 0,0088 0,0202 0,0132 0,0013 0,0012 1,6027± 1,5879± 0,1567± 0,0141± 0,0135± 0,0008 0,0038 0,0064 0,0000 0,0001 1,7823± 1,6408± 0,3767± 0,0141± 0,0126± 0,0033 0,0103 0,0393 0,0010 0,0005 1,7760± 1,6786± 0,9155± 0,0142± 0,0138± 0,0117 0,0151 0,0095 0,0013 0,0002 1,7823± 1,6795± 1,1930± 0,0144± 0,0128± 0,0141 0,0057 0,0077 0,0021 0,0008 1,7805± 1,6863± 1,1804± 0,0144± 0,0139± 0,0226 0,0059 0,0026 0,0001 0,0008 1,7675± 1,6923± 1,1761± 0,0131± 0,0127± 0,0101 0,0013 0,0059 0,0011 0,0008 1,7715± 1,6841± 1,1932± 0,0147± 0,0128± 0,0117 0,0083 0,0060 0,0003 0,0006 1,7760± 1,6890± 1,1909± 0,0140± 0,0128± 0,0202 0,0032 0,0147 0,0008 0,0004 12 15 18 21 24 27 30 33 36 VŨ THỊ DINH 73 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bảng PL 5: Ảnh hƣởng hàm lƣợng pepton đến phát triển chủng B subtilisTD OD600nm Thời gian (giờ) 0,1% 0,3% 0,5% 0,7% 1,0% 1,2% 0,0454± 0,0441± 0,0486± 0,0503± 0,0427± 0,0476± 0,0001 0,0035 0,0039 0,0001 0,0016 0,0062 0,0511± 0,0452± 0,0482± 0,0593± 0,0574± 0,0528± 0,0014 0,0042 0,0008 0,0007 0,0024 0,0024 0,0667± 0,0736± 0,0869± 0,0891± 0,0907± 0,0856± 0,0045 0,0029 0,0038 0,0006 0,0008 0,0055 0,3236± 0,3278± 0,3420± 0,3712± 0,4105± 0,3892± 0,0308 0,0061 0,0027 0,0085 0,0039 0,0151 0,7594± 0,9530± 1,1509± 1,2097± 1,3907± 1,3279± 0,0148 0,0175 0,0161 0,0090 0,0315 0,0204 1,0548± 1,2694± 1,4539± 1,5291± 1,6049± 1,5962± 0,0179 0,0202 0,0280 0,0057 0,0052 0,0083 1,0654± 1,3543± 1,5588± 1,6190± 1,8441± 1,7808± 0,0297 0,0132 0,0151 0,0122 0,0054 0,0054 1,3572± 1,4898± 1,6782± 1,8105± 2,1281± 1,9489± 0,0163 0,0024 0,0033 0,0069 0,0392 0,0501 1,4416± 1,5369± 1,6766± 1,8155± 2,1110± 1,9799± 0,0069 0,0138 0,0067 0,0187 0,0172 0,0109 1,4356± 1,5279± 1,6323± 1,8068± 2,0084± 1,9835± 0,0098 0,0361 0,0129 0,0079 0,0073 0,0184 1,4653± 1,4836± 1,6494± 1,8067± 2,0678± 1,9629± 0,0441 0,0034 0,0088 0,0049 0,0768 0,0036 1,4288± 1,5079± 1,6556± 1,8035± 2,0067± 1,9655± 0,0094 0,0168 0,0126 0,0114 0,0079 0,0202 1,4376± 1,5045± 1,6425± 1,8182± 2,0350± 1,9335± 0,0188 0,0045 0,0040 0,0029 0,0397 0,0045 12 15 18 21 24 27 30 33 36 VŨ THỊ DINH 74 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bảng PL 6: Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống đến phát triển chủng B subtilisTD OD600nm Thời gian (giờ) 12 15 18 21 24 27 30 33 36 VŨ THỊ DINH 1% 3% 5% 7% 10 % 0,0454± 0,0441± 0,0486± 0,0493± 0,0477± 0,0001 0,0035 0,0039 0,0016 0,0087 0,0511± 0,0452± 0,0482± 0,0590± 0,0574± 0,0014 0,0042 0,0008 0,0012 0,0024 0,0667± 0,0736± 0,0869± 0,0856± 0,0907± 0,0045 0,0029 0,0038 0,0044 0,0008 0,3036± 0,3178± 0,3620± 0,3692± 0,3955± 0,0025 0,0081 0,0256 0,0057 0,0173 0,9244± 0,9435± 1,3609± 1,1096± 1,1549± 0,0077 0,0310 0,0020 0,0091 0,0192 1,4286± 1,5018± 1,7232± 1,5529± 1,6460± 0,0191 0,0236 0,0013 0,0280 0,0209 1,4410± 1,5239± 1,8013± 1,6231± 1,7528± 0,0048 0,0014 0,0096 0,0064 0,0177 1,6022± 1,8753± 2,0432± 1,7623± 1,8781± 0,0049 0,0195 0,0886 0,0095 0,0033 1,6216± 1,9249± 2,0916± 1,7785± 1,8705± 0,0072 0,0110 0,0138 0,0144 0,0023 1,6156± 1,9379± 2,0768± 1,7563± 1,8614± 0,0098 0,0063 0,0231 0,0069 0,0026 1,6003± 1,9324± 2,0744± 1,7767± 1,8678± 0,0054 0,0124 0,0973 0,0049 0,0081 1,6088± 1,9257± 1,9906± 1,7545± 1,8466± 0,0094 0,0199 0,0086 0,0155 0,0064 1,6025± 1,9318± 2,0411± 1,7651± 1,8603± 0,0025 0,0148 0,0364 0,0127 0,0102 75 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bảng PL 7: Khả xử lý nƣớc thải chủng B.subtilisTD quy mô 250 ml COD (mg/l) Thời gian (ngày) 10³CFU/ml 104CFU/ml 105CFU/ml 106CFU/ml KBS 1309,10 1309,10 1309,10 1309,10 1309,10 1200,00 1167,30 1140,00 1189,10 1265,50 1096,80 1046,85 981,80 1025,45 1134,50 951,75 910,00 767,40 819,80 1051,70 716,85 670,65 608,80 623,66 916,60 710,00 624,15 576,05 617,45 804,80 560,00 523,60 451,85 538,15 741,80 505,75 481,45 361,45 470,00 685,70 361,45 451,80 267,90 401,90 625,11 320,00 365,70 205,70 411,40 548,60 10 354,30 400,00 271,10 445,70 502,90 Bảng PL 8: Khả xử lý nƣớc thải chủng B.subtilisTD quy mô l COD (mg/l) KC (Không cấp Ngày khí) 15l/phút 30l/phút 45l/phút 1221,80 1265,40 1221,80 1178,20 924,30 803,70 763,56 803,70 706,86 621,36 504,45 510,57 563,55 375,60 391,28 406,95 469,58 313,05 375,60 219,15 589,05 458,25 425,48 614,55 576,00 480,00 384,00 679,28 288,00 384,00 319,95 448,05 VŨ THỊ DINH 76 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHỤ LỤC HÌNH OD540nm 2.000 1.600 y = 3.324x - 0.195 R² = 0.998 1.200 0.800 OD540 Linear (OD540) 0.400 0.000 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ đƣờng glucose (mg/mL) Hình PL 1: Đƣờng chuẩn dựa hàm lƣợng đƣờng glucose Hình PL 2: Trình tự gen chủng TD Hình PL 3: 10 chủng có độ tƣơng đồng cao với chủng TD VŨ THỊ DINH 77 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Khẳ phân giải ure Khả sinh H2S Khả khử citrat Phản ứng VP Phản ứng β-galactosidase Lên men đƣờng sucrose Lên men đƣờng glucose Lên men đƣờng lactose Hình PL 4: Một số tính chất sinh hóa chủng TD VŨ THỊ DINH 78 Lên men xylose ... Ph n lập, tuyển chọn đặc tính chủng vi khuẩn có khả chịu nhiệt, chịu pH sinh tổng hợp cellulase để xử lý nước thải nhà máy giấy Mục tiêu đề tài: - Ph n lập tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có. .. VŨ THỊ DINH PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐẶC TÍNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG CHỊU NHIỆT, CHỊU pH VÀ SINH TỔNG HỢP CELLULASE ĐỂ XỬ LÝ NƢỚC THẢI NHÀ MÁY GIẤY Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số:... ứng dụng vi khuẩn xử lý nƣớc thải nhà máy giấy Đồi tƣợng ph m vi nghiên cứu: - Nƣớc thải nhà máy giấy An Hòa cụm cơng nghiệp giấy Ph Lâm - Vi khuẩn có khả xử lý nƣớc thải nhà máy giấy, sinh trƣởng