Bài viết tiến hàng phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu được nhiệt độ cao, sinh trưởng trong dải pH rộng và có khả năng phân giải cellulose cao.
Công ngh sinh h c & Gi ng tr ng PHÂN L P, TUY N CH N CH NG VI KHU N CH U NHI T CAO, THÍCH NGHI D I pH R NG, CĨ HO T TÍNH CELLULASE CAO VÀ B C U NG D NG X LÝ N C TH I NHÀ MÁY GI Y V Th Dinh1, Phan Th Thu Nga2, Hồng Trung Dỗn3, Tr n Liên Hà4 2,3,4 i h c Khoa h c T nhiên Hà N i i h c Bách Khoa Hà N i TÓM T T N m 2016, theo th ng kê c a Hi p h i gi y b t gi y Vi t Nam, s n l ng gi y n c ta đ t kho ng 2.420.000 tri u t n S n xu t t n gi y c n dùng t 200 - 500 m3 n c, nhiên, nhi u công ty gi y x n c th i không x lý môi tr ng, gây ô nhi m tr m tr ng Hi n nay, ph ng pháp x lý sinh h c l a ch n hàng đ u tính an tồn khơng gây h i mơi tr ng Chính th , nghiên c u c a t p trung phân l p, n ch n ch ng vi khu n ch u nhi t đ cao, thích nghi d i pH r ng có ho t tính cellulase cao v i m c đích ng d ng x lý n c th i nhà máy gi y T m u n c th i nhà máy gi y, phân l p đ c 11 ch ng có ho t tính cellulase, đó, ch ng TD phân gi i cellulose t t nh t v i ho t l c cellulase lên t i 8,52 (U/ml) nh danh b ng ph ng pháp sinh hóa sinh h c phân t , ch ng TD t ng đ ng 99% v i ch ng Bacillus subtilis subsp inaquosorum BGSC3A288 Ch ng TD đ c g i tên Bacillus subtilis TD, có kh n ng phát tri n 30oC đ n 45oC, t t nh t 35oC thích nghi v i d i pH r ng t đ n 9, t t nh t pH = T khóa: Bacillus subtilis, n c th i nhà máy gi y, phân l p vi khu n, vi khu n phân gi i cellulose ch u nhi t TV N Theo s li u c a B Tài nguyên Môi tr ng, 43,3% khu cơng nghi p Vi t Nam có cơng trình x lý n c th i t p trung, nhiên s này, nhi u cơng trình ho t đ ng th c t r t (B Tài nguyên & Môi tr ng, 2010) N c th i c a ngành s n xu t gi y m t nh ng ngu n gây ô nhi m môi tr ng nghiêm tr ng N c th i nhà máy gi y ch a ch t r n l l ng, b t gi y, lignin, hóa ch t t y tr ng, ch t ph gia ch t h u c hòa tan nh ng h p ch t có đ c tính sinh thái cao, có nguy c gây ung th , r t khó phân h y mơi tr ng (Tr nh Lê Hùng, 2009) Các ch s v ch t l ng n c th i c a công nghi p s n xu t gi y cao h n gi i h n cho phép r t nhi u, c th : Trong giai đo n s n xu t b t gi y, hàm l ng TSS: 2000 mg/l, COD: 2500 mg/l, BOD5:1900 mg/l, pH: 6,4 - 7,5; giai đo n xeo gi y hàm l ng TSS: 3500 mg/l, COD: 2500 mg/l, BOD5: 2000 mg/l, pH: 7,5 – (Tr n Vi t Ba, 2012) Hi n nay, có nhi u ph ng pháp x lý n c th i nh : ph ng pháp v t lý, ph ng pháp c h c, ph ng pháp hóa h c, nhiên, ph ng pháp có chi phí cao ch a x lý I tri t đ ngu n ô nhi m X lý sinh h c ph ng pháp có nhi u u m thân thi n v i môi tr ng kh c ph c đ c h n ch c a ph ng pháp khác (Desalegn Amenu, 2014) N c th i nhà máy gi y có t l BOD5/COD ≥ 0,5, thích h p đ x lý sinh h c C s c a ph ng pháp x lý sinh h c d a ho t đ ng s ng c a vi sinh v t đ phân h y ch t h u c gây nhi m b n n c th i Các vi sinh v t s d ng ch t h u c m t s khoáng ch t làm ngu n dinh d ng n ng l ng Trong trình dinh d ng, vi sinh v t nh n ch t dinh d ng đ xây d ng t bào phát tri n nên sinh kh i c a chúng đ c t ng lên, sinh kh i d dàng lo i kh i môi tr ng n c th i, tách phân ly bùn ho t tính (Ngơ Th Nga, Tr n V n Nhân, 2002) c tính c a n c th i nhà máy gi y môi tr ng nghèo dinh d ng, nhi t đ bi n đ ng t 36oC lên t i 70oC, d i pH r ng kho ng t 10 (Tr n Vi t Ba, 2012) Do đó, báo đ c p đ n vi c phân l p n ch n ch ng vi khu n ch u đ c nhi t đ cao, sinh tr ng d i pH r ng có kh n ng phân gi i cellulose cao T P CHÍ KHOA H C VÀ CƠNG NGH LÂM NGHI P S 1-2018 Công ngh sinh h c & Gi ng tr ng II PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V t li u 2.1.1 M u n c th i m u n c th i l y t nhà máy gi y An Hòa thu c thơn An Hòa, xã V nh L i, huy n S n D ng, t nh Tuyên Quang c s s n xu t gi y t i c m công nghi p gi y Phú Lâm thu c thôn Tam T o, xã Phú Lâm, huy n Tiên Du, t nh B c Ninh M u b o qu n - 4oC q trình phân tích 2.1.2 Hóa ch t môi tr ng Môi tr ng dinh d ng NB (10g/l cao th t; 10g/l pepton; g/l NaCl); Môi tr ng th ch phân l p vi khu n phân gi i cellulose - Hans theo TCVN 6168:2002 (0,5 g/l K2HPO4; 0,5 g/l KH2PO4; 1,0 g/l (NH4)2SO4; 0,1 g/l MgSO4.7H2O; 0,1 g/l CaCl2 ; 6,0 g/l NaCl; 0,1 g/l Cao n m men; 10 g/l Cellulose; 15 g/l agar; Mơi tr ng th ho t tính cellulase (10 g/l Cellulose; 15 g/l agar) Các lo i môi tr ng đ c trùng 121oC 15 phút 2.2 Ph ng pháp nghiên c u 2.2.1 Phân l p vi khu n T m u n c th i, l y 50 ml cho vào bình tam giác 250 ml ch a 50 ml môi tr ng NB, chu n v pH = 5, nuôi l c 150 vòng/phút 35oC 48h X lý m u 70oC 20 phút, sau đ m u v nhi t đ phòng ti n hành pha lỗng m u th p phân dung d ch NaCl 0,85% đ n n ng đ 10-4 L y 0,1 ml m u đ pha lỗng c y lên mơi tr ng ch n l c Hans, m i đ pha loãng l p l i l n, sau ni m u 35oC/48h Sau th i gian nuôi, ch n, nh n d ng ch ng riêng bi t c y ria môi tr ng Hans đ n thu đ c ch ng thu n t (Nguy n Lân D ng c ng s , 2009) 2.2.2 Tuy n ch n vi khu n Xác đ nh ho t tính phân gi i cellulose theo ph ng pháp ch m m, đ c l th ch (Ganesh D Saratete c ng s , 2009): Ph ng pháp c y ch m m: C y ch m m ch ng môi tr ng th ho t tính ch a cellulose, ni 35oC/48h Sau th i gian ni, nhu m lugol đo kích th c vòng phân gi i, tính t s gi a đ ng kính vòng phân gi i (D1) đ ng kính khu n l c (d1) Ph ng pháp đ c l th ch: Các ch ng đ c ch n ti p t c t ng sinh môi tr ng NB b sung thêm cellulose 1%, nuôi 48 gi 35oC Sau th i gian nuôi, đem ly tâm v i t c đ 10.000 vòng/phút 15 phút, thu d ch phía Hút 100 µl d ch thu đ c sau ly tâm c a m i ch ng cho vào t ng gi ng (đ ng kính gi ng d2 = mm) mơi tr ng th ho t tính cellulase ngo i bào đ a o th ch 35 C vòng 48h Sau ti n hành nhu m lugol tính hi u s gi a vòng phân gi i D2 đ ng kính gi ng d2 Ph ng pháp đo ho t l c enzyme cellulase: c xác đ nh d a vào l ng đ ng kh t o thành sau ph n ng b ng ph ng pháp đo quang ph theo Miller (Miller, 1959) 2.2.3 Ph ng pháp đ nh danh vi khu n c tính sinh lý, sinh hóa: Kh n ng sinh bào t , nhu m Gram ph n ng hóa sinh mơi tr ng đ c hi u (Nguy n Lân D ng c ng s , 2009) Sau đó, nh n di n s b ch ng d a khóa phân lo i Bergay (Gibbons Buchanon, 1989) Ph ng pháp sinh h c phân t : D a phân tích trình t 16S rRNA c a ch ng vi khu n (Nguy n Lân D ng c ng s , 2009) Ph n ng PCR s d ng c p m i xi 27F v i trình t 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’, m i ng c 1492R v i trình t 3’TACGGYTACCTTGTTACGACTT5’ Chu trình nhi t c a ph n ng PCR v i giai đo n: Bi n tính chu k đ u 95oC phút Các chu k sau bi n tính 30 giây; B t c p m i 52oC phút; Kéo dài 72oC phút 30 giây; Th c hi n 35 chu k ; Chu k cu i 72oC phút; K t thúc ph n ng h nhi t đ xu ng 4oC (Richard T P CHÍ KHOA H C VÀ CƠNG NGH LÂM NGHI P S 1-2018 Cơng ngh sinh h c & Gi ng tr ng Devereux and Sherry S.Wilkinson, 2004) K t qu gi i trình t 16S rRNA c a vi khu n đ c phân tích so sánh v i trình t ngân hàng gen qu c t NCBI b ng ch ng trình BLAST đ đ nh danh lồi vi sinh v t 2.2.4 Kh o sát nh h ng c a u ki n ngo i c nh Chu n b ch ng: Nuôi ch ng TD môi tr ng NB 35oC 21 gi v i t c đ l c 150 vòng/phút Thu d ch sinh kh i, m i thí nghi m c p 5% d ch ni vào bình tam giác 250 mL ch a 100 mL môi tr ng NB Kh o sát: Nhi t đ : Môi tr ng NB đ c chu n v pH = Nuôi t nh bình l n l t nhi t đ 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC 50oC T c đ l c: Môi tr ng NB đ c chu n v pH = Các bình đ c ni 35oC v i t c đ l c l n l t 50 vòng/phút, 100 vòng/phút, 150 vòng/phút, 200 vòng/phút, 250 vòng/phút ni t nh Kh o sát pH: Môi tr ng NB đ c chu n v pH = 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 Nuôi B ng STT 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 M u Ch ng B vi sinh B cân b ng B l ng B l ng c m hình thái khu n l c ch ng phân l p TD1 Hình thái Khu n l c màu tr ng ngà, mép r ng c a, b m t nh n, vòng phân gi i l n Khu n l c màu h ng, mép r ng c a, nh n, vòng phân gi i v a TAD VS41 VS42 VS43 VS44 VS45 VS46 VS47 VS48 CB41 CB42 CB43 CB44 CB45 L141 L142 L241 L242 Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu Khu TD N c ngu n bình thí nghi m 35oC v i t c đ l c 150 vòng/phút M i thí nghi m l p l i l n Sau m i gi kéo dài t i 48 gi nuôi , hút mL d ch m u th i m đo m t đ quang h c 2.2.5 Kh o sát kh n ng x lý c a ch ng phân l p quy mơ bình tam giác 250 ml Ch ng TD đ c nuôi môi tr ng NB v i pH = 35oC 21 gi , v i t c đ l c 150 vòng/phút Sau th i gian ni c y, ki m tra m t đ t bào d ch thu đ c C p 5% d ch nuôi m t đ 10³, 104, 105, 106 CFU/mL t ng ng vào bình tam giác 250 mL ch a 100 mL n c th i S d ng thêm m t bình tam giác 250 mL ch a 100 mL n c th i không b sung ch ng làm m u ki m ch ng Nuôi m u 35oC v i t c đ l c 150 vòng/phút, sau m i 24 gi , kh o sát kh n ng tính hi u su t x lý n c th i c a ch ng TD m i m t đ c p gi ng qua xác đ nh ch s COD theo TCVN 6491:1999 III K T QU VÀ TH O LU N 3.1 Phân l p ch ng vi khu n nl nl nl nl nl nl nl nl nl nl nl nl nl nl nl nl nl nl c màu tr ng ngà, mép r ng c a, vòng phân gi i l n c nh , tròn, tr ng, vòng phân gi i v a c tròn, lan to h n lên m t th ch, vòng phân gi i nh c tròn tr ng, vòng phân gi i nh c tròn, lan to h n lên m t th ch, vòng phân gi i to c tròn, h n lên m t th ch, vòng phân gi i nh c tr ng b m t nh n, khơng có vòng phân gi i c tr ng, khơng có mép, vòng phân gi i nh c tròn nh , tr ng bóng, khơng có vòng phân gi i c tr ng, khơng có mép, vòng phân gi i l n c tròn lan b m t th ch, vòng phân gi i l n c tròn, vòng phân gi i nh c nh , tr ng có tâm, vòng phân gi i l n, b m t nh n c nh , tròn, tr ng, vòng phân gi i l n c đ c, mép r ng c a, khơng có vòng phân gi i c tr ng, có tâm tr ng s a, vòng phân gi i l n c tròn tr ng b m t nh n, vòng phân gi i v a c tròn, khơng có vòng phân gi i T P CHÍ KHOA H C VÀ CƠNG NGH LÂM NGHI P S 1-2018 D1/d1 6,03 1,07 5,77 1,38 / / 1,13 / / / / 4,53 5,83 / 6,25 1,08 / 3,27 3,39 / Công ngh sinh h c & Gi ng tr ng T m u n c th i, sau x lý pH = 48 gi nhi t đ 70oC 20 phút, nuôi c y môi tr ng Hans phân l p đ c 11 ch ng vi khu n có kh n ng phân gi i cellulose đ c th hi n b ng 3.2 Tuy n ch n ch ng vi khu n 11 ch ng phân l p trên, ti p t c ch n kh n ng phân gi i cellulose ph ng pháp c y ch m m, đ c l th xác đ nh ho t l c enzyme, k t qu thu đ th b ng B ng Kh n ng phân gi i cellulose c a ch ng qua ph ng pháp n ch n TD TD1 TAD VS41 VS44 CB41 CB42 CB44 CB45 L142 Ch ng 1,38 1,13 4,53 5,83 6,25 1,08 3,27 D1/d1 6,03 1,07 5,77 D2-d2 / 22,02 / / 22,3 20,39 23,37 / 22,11 24,91 (mm) Ho t l c / 7,06 / / 6,64 7,16 7,44 / 7,09 8,52 (U/ml) D1: ng kính vòng phân gi i cellulose ph ng pháp c y ch m m; d1: ng kính khu n l c; D2: ng kính vòng phân gi i cellulose ph ng pháp đ c l ; d2 = mm: ng kính gi ng Hình Kh n ng phân gi i cellulose c a ch ng TD K t qu thí nghi m cho th y, ch ng TD có kh n ng phân gi i cellulose m nh nh t: Ph ng pháp ch m m cho t l đ ng kính vòng phân gi i so v i đ ng kính khu n l c 6,03; hi u s đ ng kính vòng phân gi i qua D- Mannitol Glucose Lactose K t qu + + + + + + - L241 3,39 17,34 5,84 ph ng pháp đ c l 24,91 mm cao h n ch ng vi khu n PV41 (24,5 mm) (Nguy n Ng c Trúc Ngân Ph m Th Ng c Lan, 2014) ho t l c enzyme cellulase qua ph ng pháp xác đ nh ho t l c enzyme đ t 8,52 (U/ml) cao h n ch ng PTCX04 (5,73 (U/ml)) c a m t s nghiên c u tr c (Ph m Bích Hiên c ng s , 2011) 3.3 c tính sinh hóa c a ch ng đ c n ch n T ng sinh ch ng TD môi tr ng NB o 35 C 24 gi Sau đó, x lý nhi t d ch t ng sinh 70oC 20 phút nhu n Gram K t qu cho th y ch ng TD vi khu n Gram d ng, hình que, ng n có kh n ng sinh bào t Ti n hành th nghi m m t s tính ch t sinh hóa ch ng TD thu đ c k t qu b ng B ng Tính ch t sinh hóa c a ch ng TD Tính ch t sinh hóa Gram Catalase Di đ ng Phân gi i huy t D-Xylose Sucrose n b ng ch cc Tính ch t sinh hóa -Galactosidase Indol Sinh H2S Ph n ng Voges - Proskauer Citrat Lysine decarboxylase K t qu + + + Ornithine decacboxylase Arginine dihydrolase Ure T P CHÍ KHOA H C VÀ CƠNG NGH LÂM NGHI P S - 1-2018 Công ngh sinh h c & Gi ng tr ng Ch ng TD có nhi u tính ch t sinh hóa gi ng v i Bacillus spp nh : Catalase d ng tính, Voges - Proskauer d ng tính, Glucose d ng tính, D - Mannitol d ng tính, Citrat d ng tính, Arginine Dihydrolase âm tính, D - Xylose âm tính, Ure âm tính… (O’donnell c ng s , 1980) 3.4 K t qu đ nh danh b ng sinh h c phân t Hình S n ph m PCR c a ch ng TD -ve: N c - M u ki m soát âm; +ve: DNA ch ng E.coli - M u ki m sốt d ng Gi i trình t gen 16S rRNA c a ch ng TD v i kích th c 1492 bp Phân tích so sánh t ng quan v c u trúc, k t h p s d ng thu t toán x lý d li u BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/), nh n th y trình t 16S rRNA c a ch ng TD tu ng đ ng 99% v i ch ng Bacillus subtilis subsp inaquosorum BGSC3A288; Brevibaterium halotolerans DSM 8802; Bacillus subtilis DSM10; Bacillus subtilis IAM121188; Bacillus vallismortis DSM11031; Bacillus mojavensis IFO15718; Bacillus subtilis 168; Bacillus subtilis subsp spizizenii NBRC1012g39; Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42; Bacillus subtilis NBRC13719 g n g i nh t v i ch ng Bacillus subtilis subsp inaquosorum BGSC3A288 T k t qu phân tích đ c tính sinh h c c u trúc 16S rRNA nêu trên, ch ng vi khu n TD đ nh danh ch ng Bacillus subtilis TD 3.5 K t qu kh o sát nh h ng c a nhi t đ pH 3.5.1 nh h ng c a nhi t đ Kh o sát s phát tri n c a ch ng TD nhi t đ khác nhau, u ki n môi tr ng dinh d ng NB v i pH = 7, nuôi t nh K t qu cho th y ch ng TD, có kh n ng ch u nhi t Chúng có th phát tri n t t nhi t đ t 30oC đ n 45oC t t nh t 35oC v i m t đ t bào OD600nm = 0,88 OD 600nm 1.20 0.80 0.40 0.00 20 Hình nh h 25 30 35 40 Nhi t đ (oC) 45 50 ng c a nhi t đ đ n s phát tri n c a ch ng TD sau 24 gi 3.5.2 nh h ng c a t c đ l c Ch ng TD phát tri n t t nh t 35oC Ti n hành nuôi ch ng TD 35oC v i ch đ c p khí khác K t qu thu đ c cho th y, ch đ c p khí khác nhau, ch ng TD phát tri n v i t c đ khác phát tri n t t nh t nuôi l c 150 vòng/phút v i giá tr OD600nm = 1,79 T P CHÍ KHOA H C VÀ CƠNG NGH LÂM NGHI P S 1-2018 Công ngh sinh h c & Gi ng tr ng 2.00 OD 600nm 1.60 1.20 0.80 0.40 0.00 50 100 150 200 T c đ l c (Vòng/phút)) 250 Hình nh h ng c a t c đ l c đ n s phát tri n c a ch ng TD sau 24 gi v i giá tr OD600nm lên t i 2,10 Ch ng TD có 3.5.3 nh h ng c a pH Kh o sát s phát tri n c a ch ng TD kh n ng ch u axit đ n ki m thích nghi đ c pH khác cho th y, chúng phát tri n t t t v i ngu n n c th i có pH dao đ ng t - pH = cho đ n pH = t t nh t pH = 2.40 OD 600 nm OD 600nm 2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 0.00 10 11 pH Hình nh h ng c a pH đ n s phát tri n c a ch ng TD sau 24 gi 3.6 Kh o sát kh n ng x lý n 250 ml c th i nhà máy gi y c a ch ng TD quy mơ bình tam giác 1400 1200 COD (mg/L) 1000 800 600 400 200 0 10 Th i gian (ngày) 10³CFU/mL 10 CFU/mL 10 CFU/mL Hình Hi u qu x lý COD c a ch ng TD 10 CFU/mL KBS quy mơ bình tam giác 250 mL T P CHÍ KHOA H C VÀ CƠNG NGH LÂM NGHI P S 1-2018 Cơng ngh sinh h c & Gi ng tr ng K t qu hình cho th y, b sung ch ng TD vào m u n c th i, hàm l ng COD gi m đáng k Hàm l ng COD ban đ u 1309,1 (mg/L), sau ngày cho th y s khác bi t rõ r t gi a m u b sung thêm ch ng TD kho ng 793,0 - 918,3 mg/L v i m u khơng b sung ch có vi sinh v t n n (1051,7 mg/L) Sau ngày, hàm l ng COD m u b sung ch ng TD đ t 205,7 mg/L th p h n nhi u so v i m u ki m ch ng không b sung 548,6 mg/L M t đ b sung ch ng khác cho hi u qu x lý n c th i khác Trong đó, b sung m t đ 105 CFU/ml, kh n ng x lý n c th i t t nh t v i t c đ x lý nhanh h n hi u su t x lý ngày th đ t t i 84,3% IV K T LU N T m u n c th i nhà máy gi y phân l p đ c 11 ch ng có kh n ng phân gi i cellulose, ch ng TD có kh n ng ch u đ c nhi t đ cao, thích nghi v i d i pH t ng đ i r ng phân gi i cellulose t t nh t ã nghiên c u xác đ nh đ c m t s đ c tính sinh hóa trình t c u trúc gene 16S rRNA c a ch ng TD T ch ng TD đ c đ ngh đ nh danh loài Bacillus subtilis TD ã kh o sát đ c kh n ng phát tri n c a ch ng TD u ki n nhi t đ , t c đ l c pH khác nhau, k t qu cho th y ch ng TD có kh n ng ch u phát tri n nhi t đ cao lên t i 45oC, t l c p khí t t nh t 150 vòng/phút, d i pH t axit nh (pH = 5) đ n ki m (pH = 9) B c đ u s d ng ch ng TD x lý n c th i nhà máy gi y quy mô bình tam giác 250 mL v i ch đ c p khí l c 150 vòng/phút cho th y hi u qu cao, hi u su t COD đ t t i 84,3% sau ngày x lý TÀI LI U THAM KH O Tr nh Lê Hùng (2009) K thu t x lý n Nhà xu t b n Giáo d c c th i Ngô Th Nga, Tr n V n Nhân (2002) Giáo trình công ngh x lý n c th i Nhà xu t b n Khoa h c K thu t Nguy n Lân D ng, Ngơ ình Quy t, Ph m V n Ty (2009) Vi sinh v t h c Nhà xu t b n Giáo d c, Hà N i Nguy n Ng c Trúc Ngân, Ph m Th Ng c Lan (2014) Tìm hi u kh n ng phân gi i cellulose c a vi sinh v t phân l p t ch t th i r n c a nhà máy FOCOCEV Th a Thiên Hu T p chí Khoa h c Công ngh , Tr ng i h c Khoa h c Hu , t p 1, s Ph m Bích Hiên, V n Thơng, L ng H u Thành, V Thúy Nga (2011) Tuy n ch n ch ng vi sinh v t có kh n ng phân gi i xenluloza cao cho s n xu t ch ph m x lý ph th i ch n ni d ng r n T p chí Khoa h c Công ngh Nông nghi p Vi t Nam s 3(24) TCVN 6168: 2002 Ch ph m vi sinh v t phân gi i xenlulo/Microbial preparation for cellulose degradation TCVN 6491:1999 Ch t l ng n c - Xác đ nh nhu c u oxi hóa h c/Water quality - Determination of the chemical oxigen demand Tr n Vi t Ba (2012) Nghiên c u nâng cao hi u qu x lý c a b hi u khí b ng cách u ch nh dinh d ng thích h p cho vi khu n đ i v i h th ng x lý n c th i c a nhà máy gi y Bãi B ng B Tài nguyên & Môi tr ng (2010) Báo cáo Môi tr ng qu c gia n m 2009 Môi tr ng Khu công nghi p Vi t Nam 10 Ganesh D Saratete, Yung-Chung Lo, Wen-Ming Chen, Ming-Der Bai, Jo-Shu Chang (2009) Isolation of cellulose-hydrolytic and applications of the cellulotic enzymes for cellulosic biohydrogen production Enzyme and Microbial Technology, 44(417-425) 11 N E Gibbons R E Buchanon (1989) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology Vol.8: The Williams and Wilkins company, Baltimore 12 A G O’donnell, J R Norris, R C W Berkeley, D Claus, T Kaneko, N A Logan, R Nozaki (1980) Characterization of Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, and Bacillus amyloliquefaciens by Pyrolysis Gas-Liquid Chromatography, Deoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridization, Biochemical Tests, and API Systems International Journal of Systematic Bacteriology, pp 448-459 13 Miller (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar Analytical Chemistry, 31(3): 426-428 14 Richard Devereux, Sherry S Wilkinson (2004) Amplification of ribosomal RNA sequences Molecular Microbial Ecology Manual, Second Edition 3.01: 509-522 T P CHÍ KHOA H C VÀ CƠNG NGH LÂM NGHI P S 1-2018 Công ngh sinh h c & Gi ng tr ng ISOLATION AND SELECTION OF BACTERIA STRAINS ADAPTED TO HIGH TEMPERATURES, WIDE pH RANGE, HAVE HIGH CELLULASE ACTIVITY AND THE FIRST INITIAL APPLICATION TO WASTEWATER TREATMENT OF PAPER MILLS Vu Thi Dinh1, Phan Thi Thu Nga2, Hoang Trung Doan3, Tran Lien Ha4 VNU University of Science 2,3,4 Ha Noi University of Science and Technology SUMMARY In 2016, according to the Vietnam Pulp and Paper Association, the country's paper production reached 2,420,000 million tons Each ton of manufactured paper requires about 200 - 500 m3 of water, however, many paper mills are discharged into environment with out untreated wastewater, causing serious pollution At present, biological treatment method is the best choice because of its safety and not harmful to the environment Therefore, our research focused on the isolation and selection of bacteria strains adapting to high temperatures, wide pH range and having high cellulase activity for the purpose of wastewater treatment From wastewater samples of paper mill, 11 strains with cellulase activities have been isolated, among them, TD strain assimilate cellulose the best with activity of cellulase up to 8.52 (U/ml) Identified by biochemical and molecular biology, the TD strain is 99% similarity with Bacillus subtilis subsp inaquosorum BGSC3A288 strain The TD strain’s name is Bacillus subtilis TD, could grow at 30°C to 45°C, pH range of to but the best conditions are 35oC and pH of Keywords: Bacillus subtilis, isolated bacteria, thermotolerant bacteriaassimilate cellulose, wastewater of paper mill 10 Ngày nh n : 20/4/2017 Ngày ph n bi n Ngày quy t đ nh đ ng : 26/4/2017 : 02/5/2017 T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH LÂM NGHI P S 1-2018 ... t th ch, vòng ph n gi i nh c tr ng b m t nh n, vòng ph n gi i c tr ng, khơng có mép, vòng ph n gi i nh c tròn nh , tr ng bóng, khơng có vòng ph n gi i c tr ng, khơng có mép, vòng ph n gi i l n... vòng ph n gi i l n c tròn, vòng ph n gi i nh c nh , tr ng có tâm, vòng ph n gi i l n, b m t nh n c nh , tròn, tr ng, vòng ph n gi i l n c đ c, mép r ng c a, khơng có vòng ph n gi i c tr ng, có. .. sau x lý pH = 48 gi nhi t đ 70oC 20 ph t, nuôi c y môi tr ng Hans ph n l p đ c 11 ch ng vi khu n có kh n ng ph n gi i cellulose đ c th hi n b ng 3.2 Tuy n ch n ch ng vi khu n 11 ch ng ph n l