Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas.

Với hàm lượng nitơ và photpho cao như vậy nếu thải trực tiếp ra môi trường sẽ gây ô nhiễm nguồn nước tự nhiên, tạo điều kiện cho các vi sinh vật có hại phát triển, ảnh hưởng tới hệ sinh

NGUYỄN THỊ THU HOÀI

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NITRAT HÓA

CÓ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI

CHĂN NUÔI SAU BIOGAS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015

NGUYỄN THỊ THU HOÀI

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NITRAT HÓA

CÓ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI

CHĂN NUÔI SAU BIOGAS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn : 1 TS Lương Hữu Thành

2 ThS Nguyễn Thị Đoàn

Thái Nguyên, năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, cùng tất cả các thầy cô giáo đã tận tâm dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức khoa học và những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường

Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn TS.Lương Hữu Thành và cô giáo ThS Nguyễn Thị Đoàn đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn và giúp

đỡ em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Em xin cảm ơn các anh chị tại phòng thí nghiệm Sinh học môi trường - Viện môi trường Nông Nghiệp cùng gia đình và bạn bè đã hết lòng quan tâm

hỗ trợ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt khóa luận này

Dù đã cố gắng nhiều, xong bài khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế Kính mong nhận được sự chia sẻ và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô giáo và các bạn

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn tất cả !

Thái nguyên, tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hoài

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi, các

số liệu được điều tra thu thập khách quan và trung thực Kết quả nghiên cứu chưa được sử dụng công bố trên tài liệu nào khác Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm!

Thái Nguyên, ngày 16 tháng 6 năm 2015

1 TS Lương Hữu Thành

2 ThS Nguyễn Thị Đoàn Nguyễn Thị Thu Hoài

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN CHẤM PHẢN BIỆN

Xác nhận sinh viên đã sửa theo yêu cầu của Hội đồng chấm Khóa luận tốt nghiệp!

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1.Đặc điểm nước thải đầu ra của 9 hầm biogas ở thành phố Huế 7

Bảng 2.2 Một số đặc điểm chọn lọc của các đại diện điển hình thuộc nhóm vi khuẩn nitrit hóa tự dưỡng 11

Bảng 2.3 Một số đặc điểm của các vi khuẩn nitrat hóa tự dưỡng điển hình 12

Bảng 4.1 Hoạt tính oxy hóa amon thành nitrit của các chủng tuyển chọn 30

Bảng 4.2 Hoạt tính oxy hóa nitrit của các chủng tuyển chọn 31

Bảng 4.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghiên cứu 32

Bảng 4.4 Đặc điểm tế bào các chủng vi khuẩn nghiên cứu 33

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng C1 34

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng D3 35

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến chủng C1 36

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến chủng D3 37

Bảng 4.9 kết quả thử nghiệm xử lý gián đoạn 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Chu trình nitơ trong nước 15

Hình 4.1 Chủng vi khuẩn nitrat có hoạt tính trên môi trường Winogradsky 28 Hình 4.2 Chủng vi khuẩn nitrit hóa trên môi trường có chứa thuốc thử Griss 29

Hình 4.3 Chủng vi khuẩn nitrat hóa trên môi trường có chứa thuốc thử Griss 29

Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc chủng C1 và D3 32

Hình 4.5 Hình thái tế bào chủng C1 33

Hình 4.6 Hình thái tế bào chủng D3 33

Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng C1 35

Hình 4.8 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng D3 35

Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến chủng C1 37

Hình 4.10 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến chủng D3 37

Hình 4.11 Các bình nuôi tại thời điểm 0 ngày 39

Hình 4.12 Các bình nuôi cấy tại thời điểm 7 ngày 40

DANH MỤC VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam QCVN : Quy chuẩn Việt Nam

h : Đơn vị thời gian: giờ BOD : Nhu cầu oxy sinh hóa (biological oxygen demand) COD : Nhu cầu oxy hóa học (chemical oxygen demand)

SS : Chất rắn lơ lửng

NH4-N : Amoni TKN : Tổng nitơ Kjeldahl T-P : Tổng photpho VSS : Chất rắn dễ bay hơi VSV : Vi sinh vật

AMO : Amonmonoxygenaza HAO : Hydroxylaminoxydaza

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa trong khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cơ sở khoa học của đề tài 3

2.1.1.Tổng quan về nước thải chăn nuôi 3

2.1.2 Nước thải chăn nuôi sau mô hình khí sinh học biogas 6

2.1.3.Tính độc của các hợp chất chứa nitơ 8

2.1.4 Xử lý nước thải giàu hợp chất chứa nitơ ứng dụng vi khuẩn nitrat hóa 10

2.2.Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 18

2.2.1.Tình hình nghiên cứu trong nước 18

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 18

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1.Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 20

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 20

3.2.Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20

3.2.1.Địa điểm nghiên cứu 20

3.2.2.Thời gian nghiên cứu 20

3.3 Dụng cụ, môi trường 20

3.3.1 Dụng cụ thiết bị 20

3.3.2 Môi trường 21

3.4 Nội dung nghiên cứu 22

3.5 Phương pháp nghiên cứu 22

3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu 22

3.5.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa 22

3.5.3.Phương pháp nhuộm gram[13] 23

3.5.4.Phương pháp giữ giống 24

3.5.5.Phương pháp phân tích 25

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

4.1.Phân lập vi khuẩn nitrat hóa 28

4.2.Tuyển chọn chủng có hoạt tính nitrat hóa cao 28

4.2.1.Tuyển chọn chủng có hoạt tính oxy hóa amon thành nitrit 28

4.2.2 Tuyển chọn chủng có hoạt tính oxy hóa nitrit thành nitrat 29

4.2.3.Hoạt tính của các chủng tuyển chọn 30

4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn32 4.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 32

4.3.2 Đặc điểm, hình dạng tế bào 32

4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sinh trưởng của các chủng nitrit hóa 34

4.4.1 Ảnh hưởng của pH 34

4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 36

4.5 Khả năng sử dụng các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn vào xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas 38

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1.Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I Tài liệu Tiếng Việt

II Tài liệu Nước ngoài

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Chăn nuôi là hình thức phổ biến trong cả nước đặc biệt là khu vực nông thôn Nó có vai trò chính là cung cấp lượng protein động vật chủ yếu cho con người

Với truyền thống sản xuất xa xưa là các trang trại thường nằm bên cạnh các con sông hay nằm trong khu dân cư, vấn đề ô nhiễm môi trường xung quanh làm chất lượng môi trường các thành phần cũng bị suy thoái là một vấn nạn đòi hỏi cần giải quyết Ngày càng có nhiều sông, kênh rạch bị ô nhiễm trầm trọng do các chất hoạt động chăn nuôi thải ra kéo theo các thành phần như: không khí, nước ngầm, đất và vi sinh vật trong đó có con người cũng bị đe dọa

Để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong chăn nuôi đã có nhiều dự

án phương pháp được tiến hành trong đó có việc xây dựng hệ thống Biogas Sau thời gian hoạt động các công trình này góp phần tích cực trong công tác kiểm soát chất lượng dòng thải trước khi thải ra nguồn tiếp nhận, đồng thời thu được khí sinh học làm nhiên liệu phục vụ sinh hoạt, đặc biệt có ý nghĩa ở vùng nông thôn hiện nay

Tuy nhiên do quá trình vận hành chưa đúng các yếu tố kỹ thuật nên chất lượng nước thải sau khi xử lý bằng hầm Biogas chưa đáp ứng được yêu cầu xử

lý đảm bảo điều kiện xả thải, nồng độ chất ô nhiễm trong nước vẫn còn khá cao Hàm lượng các chất hữu cơ, hàm lượng chất rắn lơ lửng, hàm lượng nitơ, hàm lượng photpho rất cao so với tiêu chuẩn cho phép Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu “Đánh giá hiệu quả xử lý nước thải chăn nuôi lợn bằng hầm Biogas quy mô hộ gia đình tại Thừa Thiên Huế” Tạp chí khoa học, đại học Huế, tập 73, số 4, năm 2012, trang 83-91 cho kết quả: hàm lượng nito tổng số là 421-778mg/l, hàm lượng photpho tổng số là 131-512mg/l, khi so sánh

với TCN678-2006 và QCVN24:2009/BTNMT thì hàm lượng photpho tổng vượt gấp 20 lần tiêu chuẩn cho phép, hàm lượng nitơ vượt khoảng hơn 10 lần tiêu chuẩn cho phép Với hàm lượng nitơ và photpho cao như vậy nếu thải trực tiếp

ra môi trường sẽ gây ô nhiễm nguồn nước tự nhiên, tạo điều kiện cho các vi sinh vật có hại phát triển, ảnh hưởng tới hệ sinh thái, đặc biệt có thể gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe của con người Do đó cần có giải pháp tác động chuyển hóa các hợp chất hữu cơ đặc biệt là hợp chất chứa nitơ sang một dạng khác không nguy hại tới môi trường, tới hệ sinh thái Xuất phát từ thực tế đó, tôi đã chọn đề tài:

“Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu của đề tài

Tìm ra chủng vi khuẩn nitrat hóa có khả năng xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Thu thập mẫu và phân lập được chủng vi khuẩn có trong nước thải chăn nuôi sau Biogas

- Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn nitrat hóa

- Thử nghiệm được khả năng xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas trên quy mô phòng thí nghiệm

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa trong khoa học

Kết quả của đề tài là tài liệu tham khảo cho những nghiên cứu tiếp theo

về việc xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

Kết quả của đề tài góp phần nâng cao công tác quản lý và xử lý tốt hơn nguồn nước thải sau hầm Biogas

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học của đề tài

2.1.1 Tổng quan về nước thải chăn nuôi

Nguồn nước thải chăn nuôi là một trong những nguồn chất thải có chứa nhiều hợp chất hữu cơ, virus, vi trùng, trứng giun sán… Nguồn nước này có nguy cơ gây ô nhiễm các tầng nước mặt, nước ngầm và trở thành nguyên nhân trực tiếp phát sinh dịch bệnh cho đàn gia súc Đồng thời nó có thể lây lan một số bệnh cho con người và ảnh hưởng đến môi trường xung quanh vì

nước thải chăn nuôi còn chứa nhiều mầm bệnh như: Samonella, Leptospira,

Clostridium tetani,…nếu không xử lý kịp thời Bên cạnh đó còn có nhiều loại

khí được tạo ra bởi hoạt động của vi sinh vật như NH3, CO2, CH4, H2S, Các loại khí này có thể gây nhiễm độc không khí và nguồn nước ngầm ảnh hưởng đến đời sống con người và hệ sinh thái[15] Chính vì vậy mà việc thiết kế hệ thống xử lý nước thải cho các trại chăn nuôi là một hoạt động hết sức cần thiết

Đặc trưng ô nhiễm của nước thải chăn nuôi heo là: ô nhiễm hữu cơ; ô nhiễm N, P và chứa nhiều loại vi trùng, vi khuẩn gây bệnh

2.1.1.1 Ô nhiễm các chất hữu cơ và vô cơ

Những chất hữu cơ chưa được gia súc đồng hoá, hấp thụ sẽ bài tiết ra ngoài theo phân, nước tiểu cùng các sản phẩm trao đổi chất khác.Thức ăn dư thừa cũng là 1 nguồn gây ô nhiễm hữu cơ

Trong nước thải chăn nuôi, hợp chất hữu cơ chiếm 70-80 % gồm protit, acid amin, chất béo, hydratcarbon và các dẫn xuất của chúng Hầu hết là các chất hữu cơ dễ phân huỷ, giàu Nitơ, Photpho Các chất vô cơ chiếm 20-30% gồm cát, đất, muối, ure, amonium, muối chlorua, sulfate…[16]

Các hợp chất hoá học trong phân và nước thải dễ dàng bị phân huỷ Tùy điều kiện hiếu khí hay kị khí mà quá trình phân huỷ tạo thành các sản phẩm khác nhau như acid amin, acid béo, aldehide, CO2, H2O, NH3, H2S Nếu quá trình phân huỷ có mặt O2 sản phẩm tạo thành sẽ là CO2, H2O, NO2, NO3 Còn nếu quá trình phân hủy diễn ra trong điều kiện thiếu khí thì tạo thành các sản phẩm CH4, N2, NH3, H2S, Indol, Scatol… Các chất khí sinh ra do quá trình phân huỷ kị khí và thiếu khí như NH3, H2S…gây ra mùi hôi thối trong khu vực nuôi ảnh hưởng xấu tới môi trường không khí

2.1.1.2 Ô nhiễm Nitơ và Photpho:

Khả năng hấp thụ Nitơ và photpho của gia súc, gia cầm rất kém, nên khi ăn thức ăn có chứa Nitơ, Photpho vào thì chúng sẽ bị bài thiết theo phân và nước tiểu Trong nước thải chăn nuôi thường chứa hàm lượng Nitơ

và Photpho rất cao Hàm lượng Nitơ tổng trong nước thải của trại chăn nuôi đo được sau khi ra biogas từ 571 - 594 mg/l, Photpho từ 13.8-62 mg/l Theo Jongbloed và Lenis (1992), đối với heo trưởng thành khi ăn vào 100

g Nitơ thì: 30 g được giữ lại cơ thể, 50 g bài tiết ra ngoài theo nước tiểu dưới dạng ure, còn 20 g ở dạng phân Nitơ vi sinh khó phân huỷ và an toàn cho môi trường

Nitơ bài tiết ra ngoài theo nước tiểu và phân dưới dạng ure, sau đó ure nhanh chóng chuyển hoá thành NH3 theo phương trình sau:

(NH2)2CO + H2O → NH4 + OH- + CO2 ↔ NH3↑ + CO2 + H2O

Khi nước tiểu và phân bài tiết ra ngoài, vi sinh vật sẽ tiết ra enzime ureaza chuyển hoá ure thành NH3, NH3 phát tán vào không khí gây mùi hôi hoặc khuyếch tán vào nước làm ô nhiễm nguồn nước

Nồng độ NH3 trong nước thải phụ thuộc vào:

- Lượng ure trong nước tiểu

- pH của nước thải: khi pH tăng, NH4+ sẽ chuyển thành NH3 Ngược lại khi pH giảm, NH3 chuyển thành NH4

+

NH3 + H2O ↔ NH4+

+ OH

Điều kiện lưu trữ chất thải

Hàm lượng N-NH3 trong nước thải của trại sau khi ra biogas khá lớn, khoảng 304-471 mg/l, chiếm 75-85% hàm lượng N tổng

Nước thải chăn nuôi chứa hàm lượng lớn N, P Đây là nguyên nhân có thể gây hiện tượng phú dưỡng hoá cho các nguồn nước tiếp nhận, ảnh hưởng xấu đến chất lượng nguồn nước và các sinh vật sống trong nước [15]

2.1.1.3 Vi sinh vật gây bệnh:

Nước thải chăn nuôi chứa nhiều loại vi trùng, virus và trứng ấu trùng giun sán gây bệnh Do đó, loại nước thải này có nguy cơ trở thành nguyên nhân trực tiếp phát sinh dịch bệnh cho đàn gia súc, gia cầm đồng thời lây lan

1 số bệnh cho người nếu không được xử lý

Theo nghiên cứu của Nanxera đối với nước thải chăn nuôi: vi trùng gây

bệnh đóng dấu (Erisipelothris insidiosa) có thể tồn tại 92 ngày, Brucella từ 74-108 ngày, Samolnella từ 6-7 tháng, Leptospira 5-6 tháng, Microbacteria

tuberculosis 75-150 ngày, virus lở mồm long móng (FMD) sống trong nước

thải 100-120 ngày…, các loại vi trùng có nha bào như: Bacillus tetani 3-4

năm Trứng giun sán nhiều trong nước thải chăn nuôi với nhiều loại điển hình

như: Fasciolahepatica, Fasciola gigantica, Fasciolosis buski, Ascaris suum,

Oesophagostomum sp, Trichocephalus dentatus… có thể phát triển đến giai

đoạn gây nhiễm sau 6-28 ngày và tồn tại 5-6 tháng [15]

Theo A.Kigirop (1982), các loại vi trùng gây bệnh như: Samonella,

E.coli và nha bào Bacilus anthrasis có thể xâm nhập theo mạch nước

ngầm Samonella có thể thấm sâu xuống lớp đất bề mặt 30-40 cm, ở những

nơi thường xuyên tiếp nhận nước thải Trứng giun sán, vi trùng có thể lan truyền đi rất xa và nhanh khi bị nhiễm vào nước mặt gây dịch bệnh cho người và gia súc

Nghiên cứu của Bonde (1967) cho thấy: đa số các VSV gây bệnh không phát triển lâu dài trong nước thải, số lượng của chúng giảm nhanh trong những ngày đầu sau đó chậm dần Các loại vi trùng tồn tại lâu trong nước ở

vùng nhiệt đới Samonella typhi và Samonella paratyphi, E.coli, Shigella,

Vibrio comma gây dịch tả

Ngoài ra, G.Rhêinhinmer còn phân lập được nhiều loài nấm gây bệnh Đối với vi khuẩn và virus đường ruột, thì thời gian sống sót trong nước thải càng lâu thì số lượng cá thể của chúng càng nhỏ và ngược lại

Hệ vi sinh vật trong nước thải chăn nuôi rất phức tạp trong đó chủ yếu là

vi khuẩn gây thối có 3-16 triệu/ml, vi khuẩn phân huỷ đường mỡ, E.coli 10 x

104 - 10 x 107 tế bào/ml, vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn nitrat hoá Hệ vi sinh vật này có ảnh hưởng lớn đến tính chất và khả năng tự làm sạch của nguồn nước

Việc xử lý nước thải chăn nuôi nhằm giảm nồng độ các chất ô nhiễm trong nước thải đến một nồng độ cho phép có thể xả vào nguồn tiếp nhận Việc lựa chọn phương pháp làm sạch và lựa chọn quy trình xử lý nước phụ thuộc vào các yếu tố như :

 Các yêu cầu về công nghệ và vệ sinh nước

 Lưu lượng nước thải

 Các điều kiện của trại chăn nuôi

 Hiệu quả xử lý

2.1.2 Nước thải chăn nuôi sau mô hình khí sinh học Biogas

Về cảm quan nước thải sau hầm Biogas có màu đen hoặc xanh đen, ít có mùi hôi thối Theo tạp chí Khoa học, Đại học Huế, tập 73, số 4, năm 2012 thì chất lượng nước thải đầu ra được trình bày như sau:

Bảng 2.1: Đặc điểm nước thải đầu ra của 9 hầm biogas ở thành phố Huế

STT Thông

số Đơn vị Khoảng

giá trị TB±s

TCN 678-

2006

QCVN 24:2009/BT NMT

1,5×106 75×106 10,6×10

-6

(Nguồn: Tạp chí khoa học Đại học Huế, năm 2012)

Nhìn chung, nước thải đầu ra của hầm biogas có hàm lượng chất ô nhiễm cao

Các thông số cơ bản của nước thải sau hầm biogas vượt hoặc xấp xỉ vượt tiêu chuẩn cho phép nhiều lần, cụ thể như sau:

So với tiêu chuẩn TCN 678 - 2006:

+ Nồng độ chất hữu cơ vượt nhẹ

+ Nồng độ chất dinh dưỡng cao, vượt 52 lần (đối với NH4-N) và 16 lần (đối với tổng P)

So với Quy chuẩn QCVN 24:2009/BTMT:

+ Nồng độ chất hữu cơ vượt 5 lần (đối với BOD5) và 6 lần (đối với tổng P)

+ Các thông số khác (SS, VSS, TKN, Fecal coliform) không được quy định trong các tiêu chuẩn so sánh nhưng có nồng độ khá cao

Từ kết quả so sánh trên thì nước thải đầu ra của hầm biogas không đủ tiêu chuẩn thải vào môi trường Với nồng độ chất ô nhiễm cao thì nước thải này sẽ góp phần làm suy giảm chất lượng môi trường của nguồn tiếp nhận

2.1.3 Tính độc của các hợp chất chứa nitơ

Trong nước mặt cũng như trong nước ngầm nitơ tồn tại ở 3 dạng chính là ion amoni (NH4+), nitrit (NO2-) và nitrat (NO3-) Dưới tác động của nhiều yếu

tố hóa lý và do hoạt động của một số vi sinh vật các dạng nitơ này chuyển hóa lẫn nhau, tích tụ lại trong nước ăn và có độc tính đối với con người

Nếu có hàm lượng lớn NO3

- trong nước sẽ gây ra hiện tượng phù dưỡng, trước hết nó tương cường sự phát triển của tảo và vi sinh vật phù du làm giảm

độ xuyên của ánh sáng mặt trời, ngăn cản quá trình quang hợp trong các lớp nước phía dưới Mặt khác, sau khi tảo và các vi sinh vật phù du chết đi sẽ bị các vi sinh vật khác phân hủy và giải phóng NH4

+ Oxy hòa tan trong nước bị các vi sinh vật hiếu khí sử dụng gây nên quá trình phân hủy hiếu khí tạo ra các sản phẩm độc hại làm cho nước bị ô nhiễm trầm trọng Nước uống nhiễm

do vi khuẩn và sự xâm nhập sau đó của NO2

vào máu là nguyên nhân của sự tạo thành methahemoglobin Ở đây oxy của NO2-liên kết chặt không thuận nghịch với hemoglobin khiến cho hồng cầu mất khả năng vận chuyển oxy Các chủng vi khuẩn khử nitrat đi qua dạ dày bình thường chỉ đến ruột chúng mới khử nitrat, sinh trưởng và tích lũy NO2-

- Sự tạo thành methahemoglobin đặc biệt thấy rõ ở trẻ em Trẻ em mắc chứng bệnh này thường xanh xao và dễ bị đe dọa tới cuộc sống đặc biệt là trẻ em dưới 6 tháng tuổi Ở trẻ em lớn tuổi và người lớn vi khuẩn bị chết trong dịch vị có

pH axit, NO2

được hấp thụ lại trước khi bị khử trong ruột ở pH thích hợp

còn là chất độc gây bệnh ung vì nó tạo thành axit nitơ trong nước sau đó

kết hợp với các axit amin để tạo thành Nitrosamin là một trong các tác nhân

gây ung thư

Trong ao hồ, amoni xuất hiện như một sản phẩm do sự biến dưỡng của động vật trong nước cũng như từ sự phân hủy các chất hữu cơ với tác động của vi khuẩn Trong nước amoni được phân chia làm 2 nhóm là NH3 (khí hòa tan) và nhóm NH4

+ (ion hóa) Dạng khí hòa tan của amoni là gây độc cho ao hồ Dưới tác dụng của vi khuẩn, amoni sẽ bị biến đổi thành nitrit (NO2) (bởi vi khuẩn Nitrosomonas) rồi nitrat (NO3) (bởi vi khuẩn

Nitrobacter) [14] Hình thức nitrat thường vô hại, nồng độ nitrat cho phép

trong nước nuôi trồng thủy sản <10mg/l Khi môi trường nhiễm nitrat với hàm lượng cao>10mg/l sẽ làm rong tảo phát triển, dẫn đến hiện tượng phú dưỡng và làm giảm chất lượng nước Sự phát triển bùng nổ của tảo làm cho nước trở nên đục, tảo kết thành khối trôi nổi trên mặt nước, khi phân hủy phát sinh mùi và làm giảm lượng oxy hòa tan trong nước, ảnh hưởng trực tiếp tới đời sống của một số loài cá

Do tác hại của NO2- và NO3- đối với sức khỏe của con người và động vật nên chúng được coi là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng nước Theo tiêu chuẩn chất lượng nước Việt Nam, trong nước ống hàm lượng (tính theo N) NO3-

phải nhỏ hơn 10mg/l, hàm lượng NO2

phải nhỏ hơn 0,01mg/l và hàm lượng NH4+ phải nhỏ hơn 0,05mg/l

-Theo kết quả báo cáo chất lượng của Bộ xây dựng, Công ty tư vấn cấp thoát nước và môi trường Việt Nam thì chất lượng nước ngầm ngày cành bị suy giảm nghiêm trọng do bị nhiễm một hàm lượng NH4+ có lúc lên tới 60mg/l Nhà máy nước Tương Mai là 30mg/l Nhà máy nước Yên Phụ là

20 mg/l

Trước hiện trạng ô nhiễm nitơ liên kết trong nước và tác hại của chúng như vậy, việc loại bỏ chúng ra khỏi nguồn nước là vấn đề cấp bách cần được giải quyết

2.1.4 Xử lý nước thải giàu hợp chất chứa nitơ ứng dụng vi khuẩn nitrat hóa a) Các chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrat hóa

 Vi khuẩn tự dƣỡng oxy hóa amon

Vi khuẩn có khả năng oxy hóa amon thành nitrit hầu hết thuộc nhóm vi

khuẩn tự dưỡng hóa năng, hiếu khí bắt buộc Các vi khuẩn này không lấy năng lượng từ sự oxy hóa chất hữu cơ mà lấy năng lượng từ sự oxy hóa các hợp chất chứa nitơ vô cơ và đồng hóa CO2 trong chu trình calvin benson Chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử, tế bào hình cầu, hình que, hình xoắn

Một số đại diện đặc trưng cho nhóm này là giống Nitrosomonas,

Nitrococcus, Nitrozolobus, Nitrosospira[7] Trong số đó giống Nitrosomonas

mà đặc biệt là loài Nitrosomonas europaea được áp dụng nhiều nhất trong

quá trình nitrit hóa Đó là những vi khuẩn hình bầu dục, nhỏ bé kích thước từ 0,4 - 0,6 1 - 1,8 µm, không sinh bào tử,có thể có tiêu mao khá dài, có khả năng tích lũy nhiều chất nhầy quanh tế bào Điều kiện tối ưu cho sự phát triển

của Nitrosomonas là: nhiệt độ 28-30oC, pH=7,0-8,6 Cơ chất oxy hóa của

Nitrosomonas là amoniac, ure, guanin, , các cơ chất hữu cơ không được sử

dụng làm nguồn oxy hóa[7] Một số đặc điểm của các vi khuẩn nitrit hóa tự dưỡng điển hình được trình bày tóm tắt ở bảng sau:

Bảng 2.2 : Một số đặc điểm chọn lọc của các đại diện điển hình thuộc

nhóm vi khuẩn nitrit hóa tự dƣỡng

Loài vi khuẩn

Đặc điểm hình thái và hình thức chuyển động

1,0 Chuyển động đơn mao

- Phân đôi

- 4,75-5,1

5-10oC pH: 5,8-9,5

Đất, nước ngọt và biển

Nitrosococcus

oceanus

-Hình cầu -1,8-2,2µm -Chuyển động đơn mao

-Phân đôi -50,5-51

25-30oC pH: 7,5-8,0 Biển

Nitrosocuccus

nitrosus

-Hình cầu -1,8-2,2µm -Không chuyển động

-Phân đôi -Không rõ

20-30oC pH: 6,0-8,0

Đất

Nitrosococcus

mobilis

-Hình cầu -1,5-1,7µm -Chuyển động đơn mao hoặc chùm mao

-Phân đôi -Không rõ

15-30oC pH: 6,0-8,2 Nước lợ

Nitrosospira

Briensis

-Hình xoắn -0,3-0,4µm -Chuyển động chu

mao

-Phân đôi -54,1

5-40oC pH: 5,7-8,2 Đất

Nitrosolobus

Multiformic

-Xẻ thùy nhỏ -1,0-1,5µm -Chuyển động

-Phân đôi -53,6-55,1

20-30oC pH: 7,0-8,0 Đất

(Nguồn: Viện Đại học mở Hà Nội)

 Vi khuẩn nitrat hóa

Cũng như các loại vi khuẩn tự dưỡng khác,vi khuẩn nitrat hóa dùng năng lượng sinh ra để khử CO2 của không khí và tạo nên các chất hữu cơ cần thiết

cho cơ thể chúng Loại vi khuẩn nitrat hóa điển hình nhất là Nitrobacter

Chúng là những tế bào hình bầu dục, kích thước khoảng 0,8×1,0µm Gram

âm (-), không sinh bào tử Hai loài Nitrobacter chủ yếu là N Vinogradski( không di động) và N Agilic (di động) Cơ chất oxy hóa duy nhất của

Nitrobacter là nitrit[7][2] Nitrobacter cũng có thể sinh trưởng và phát triển

trên các môi trường có chứa chất hữu cơ, hoặc chất hữu cơ có kích thích sự sinh trưởng và phát triển cũng như hoạt tính chuyển hoá của chúng [2]

Nitrobacter rất nhạy cảm với điều kiện không thuận lợi của môi trường,

nồng độ NaNO2 0.5 g/l bắt đầu kìm hãm sự sinh trưởng của chúng Một số đặc điểm của các vi khuẩn nitrat hóa điển hình được tóm tắt ở bảng sau:

Bảng 2.3 : Một số đặc điểm của các vi khuẩn nitrat hóa

Nitrobacter

winogradski

Hình que, sinh sản bằng cách mọc chồi, kích thước 0,6-0,8 1,0- 2,0µm

61,7 20-30

o

C pH=7,0-8,0

Đất, nước ngọt, biển

Nitrobacter

vulgraris

Hình que, sinh sản bằng cách mọc chồi 59,4

Đất, nước ngọt, nước lợ

Nitrococcus

mobilus

Hình cầu, sinh sản bằng cách phân đôi 61,2

20-30oC pH=7,0-8,0 Biển

(Nguồn: Viện Đại học mở Hà Nội)

Năng lượng thu được từ quá trình oxy hóa NH4+

sẽ được các vi khuẩn sử dụng để sinh tổng hợp vật chất của tế bào từ CO32- Do chỉ nhận được rất ít năng lượng từ quá trình oxy hóa nên tốc độ phát triển của các vi khuẩn oxy hóa amon và oxy hóa nitrit tự dưỡng là hết sức chậm chạp Thời gian thế hệ là

0,4-2,5 ngày đối với Nitrosomonas và 0,3-1,5 ngày đối với Nitrobacter Sản lượng tế bào (g tế bào khô/ N oxy hóa) là 0,29 đối với Nitrosomonas và 0,08 đối với Nitrobacter [1][5][11]

 Các vi khuẩn dị dƣỡng tham gia vào quá trình nitrit hóa

Trong những năm gần đây, bên cạnh các vi khuẩn tự dưỡng bắt buộc người ta đã phát hiện ra một số vi khuẩn dị dưỡng có khả năng oxy hóa NH4+

và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ thành NO2

, NO3

như: Methylomonsa,

Methanica, Ethylosinus trichosprium, Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanicus, Thiosphaera pantotropha, Thibacillus novellus Cơ chế hóa sinh của

quá trình nitrat hóa do vi khuẩn dị dưỡng vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ Có lẽ

sự oxy hóa nitơ có thể xảy ra theo cả hai con đường vô cơ và hữu cơ

Quá trình nitrat hóa nhờ các vi khuẩn dị dưỡng có tầm quan trọng đặc biệt bởi nó dễ sinh trưởng và phát triển ở mọi môi trường, cả ở những nơi giàu hay nghèo chất hữu cơ Trong khi đó các vi khuẩn tự dưỡng thường có mặt ở những nơi có ít chất hữu cơ Mặc dù khả năng oxy hóa NH4

+, các vi khuẩn tự dưỡng nhỏ hơn từ 103-104 lần khả năng oxy hóa NH4

+ của các vi khuẩn tự dưỡng, nhưng bù lại đó chúng có khả năng phát triển nhanh hơn nhiều lần Hơn nữa ngoài khả năng oxy hóa NH4

+, các vi khuẩn tự dưỡng còn

có cả enzyme khử nitrat thành nitơ phân tử, ngay cả trong điều kiện có oxy bởi vậy chúng là những vi khuẩn lý tưởng trong xử lý các môi trường bị ô nhiễm bởi NH4+, NO2-, NO3-

b) Vai trò của vi khuẩn nitrat hóa trong xử lý nước thải

 Sơ lược về chu trình của nitơ trong môi trường nước tự nhiên

Trong môi trường nước, nitơ có thể tồn tại dưới dạng hợp chất vô cơ, hữu cơ hòa tan hay không hòa tan Các hợp chất vô cơ quan trọng của nitơ là

NH3, NH4+, NO2-, NO3

-Nitơ dạng khí có được chủ yếu là sự khuếch tán từ ngoài không khí vào hay còn có thể được hình thành trong quá trình phản nitrat hóa Các dạng hợp chất vô cơ hòa tan có được là do quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ, nitơ lắng đọng dưới dạng albumine và dưới tác dụng của vi sinh vật, đạm albumine sẽ tiếp tục phân hủy thành ammoniac (NH3) và sau đó ammoniac sẽ hòa tan vào nước tạo ra NH4

-động của vi khuẩn như Nitrosomonas, Nitrobacter [10] Thực vật có thể

hấp thu nhiều dạng đạm nói trên nhưng khả năng hấp thu NH4

+

và NO3

là tốt nhất, (mỗi loài thực vật ưa một dạng đạm khác nhau) Trong khi đó, một

số loài vi khuẩn và tảo lại có khả năng sử dụng nitơ phân tử nhờ quá trình

cố đinh nitơ

Hầu hết đạm NO3- được vi sinh vật, thực vật thủy sinh sử dụng cho các quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng, sau đó bị lắng tụ ở bùn đáy Đạm chứa trong tảo bị ăn bởi động vật phù du và các ấu trùng, động vật đáy khác Hai quá trình yếm khí là cố định nitơ và phản nitrat do tảo lam và vi khuẩn thực hiện, trong đó, quá trình phản nitrat hầu như xảy ra trong tầng đáy ở vùng cửa sông hay đất ngập nước

Các chất đạm hữu cơ trong môi trường nước hiện diện trong cơ thể thực vật, động vật, xác bã hữu cơ lơ lửng hoặc hòa tan

Hình 2.1 Chu trình nitơ trong nước

Quá trình amon hóa các hợp chất hữu cơ chứa nitơ trong môi trường nước diễn ra tương đối mạnh mẽ trong cả điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ được chuyển hóa hoàn toàn thành các hợp chất vô cơ, giúp làm sạch môi trường nước Trong điều kiện kỵ khí, các axit amin không được vô cơ hóa hoàn toàn, bên cạnh NH3 và CO2 còn tích lũy nhiều loại hợp chất hữu cơ khác như axit hữu cơ, rượu, H2S và các sản phẩm bốc mùi cho thủy vực

Quá trình amon hóa protein giữ vai trò quan trọng trong việc khép kín vòng tuần hoàn nitơ Nhờ quá trình này mà nitơ chuyển từ dạng hấp thụ sang

muối amon dễ dàng được thực vật sử dụng Nhờ quá trình này mà NH3 luôn luôn được phục hồi, cung cấp cho thực vật thủy sinh Có nhiều loại vi khuẩn

và nấm mốc tham gia vào quá trình này chủ yếu là các loài của giống Bacillus như: Bacillus mesentericus, Bacillus mycoide, Bacillus sustilis,…

 Quá trình nitrat hóa

Quá trình nitrat hóa là quá trình oxy hóa nitơ của các muối amon, đầu tiên tạo thành nitrit và sau đó tạo thành nitrat dưới tác động của các vi sinh vật hiếu khí trong điều kiện thích hợp

Quá trình nitrat hóa tự dưỡng bao gồm 2 giai đoạn chính: oxy hóa muối amon thành NO2

(nitrit hóa) và giai đoạn oxy hóa nitrit thành NO3

(nitrat hóa) [9]

-Ý nghĩa của quá trình nitrat hóa trong việc làm sạch nước: nó phản ánh mức độ khoáng hóa của các hợp chất hữu cơ có trong nước thải, quan trọng hơn qua quá trình này có thể tích lũy một lượng oxy dự trữ có thể ứng dụng

để oxy hóa các chất hữu cơ không chứa nitơ khi lượng oxy tự do (lượng oxy hòa tan) đã tiêu hao hoàn toàn trong quá trình đó Sự có mặt của nitrat trong nước thải phản ánh mức độ khoáng hóa hoàn toàn của các chất hữu cơ

Giai đoạn 1: Nitrit hóa

Nitrit hoá là quá trình oxy hóa amon thành nitrit nhờ enzym Amonmonoxygenaza (AMO) của vi khuẩn xúc tác trong điều kiện hiếu khí

NH4

+

+1,5 O2 → NO2 + 2H+ + 2H2O Đầu tiên amon bị oxy hóa thành hydroxylamin nhờ enzym AMO

NH3 +O2 +2e +2H+ → NH2OH +H2O

Quá trình này không giải phóng năng lượng ở dạng ATP, nhưng lại đòi hỏi nguồn điện từ để tạo ra hydroxylamin Nguồn điện từ có được do sinh ra khi oxy hóa NADH2 thành NAD+ và truyền qua cytochroen P460 Một phần nguồn điện từ trong quá trình oxy hóa amon thành hydroxylamin đi vào chuỗi

truyền điện trong màng nguyên sinh chất của vi khuẩn Nitrosomonas, phần

còn lại dùng để oxy hóa hydroxylamin thành nitrit Sự oxy hóa hydroxylamin thành nitrit trải qua 2 bước:

B1: Enzym + NH2OH → Enzym-NO+ + 3H+ + 4e B2: Enzym-NO- +H2O → Enzym + NO2- + 2H+ Tổng hợp toàn bộ qua trình oxy hóa hydroxylamin này có tạo ra sản phẩm trung gian NOH do enzym hydroxylamin oxydaza (HAO) xúc tác (NOH là một hợp chất kém bền vững) Hai điện tử giải phóng từ sự oxy hóa NOH thành NO2- được sử dụng để chuyển P460 trở lại thành dạng khử Dạng khử P460 lại oxy hóa các phần tử NH3 tiếp theo[12]

Điều đáng chú ý là trong quá trình nitrit hóa, cơ chất của Amon monoxyenaza là NH3 chứ không phải NH4

+, bởi vậy quá trình oxy hóa amon xảy ra mạnh nhất ở pH trung tính 7,5-8,5, hoặc kiềm khi amoniac ở dạng không ion hóa (NH3) nhiều hơn[1]

Giai đoạn 2: Nitrat hóa

Đó là giai đoạn oxy hóa nitrit thành nitrat do enzym nitritoxydaza và cytochrom oxydaza xúc tác

NO2- + 0,5H2O → NO3- + H++ 2e

-Mặt khác, một số điện tử sinh ra khi oxy hóa NO2- lại đi vào mạch truyền điện tử tới các cytochrom a, cytochroma c, đến cytochrom oxydaza (aa3) và kết hợp với oxy phân tử để tạo thành nước trong nguyên sinh chất

Vi khuẩn tham gia vào quá trình phản nitrat hóa bao gồm các loại kỵ khí

không bắt buộc như: Pseudomonas, Bacillus…Trong điều kiện hiếu khí,

chúng oxy hóa các chất hữu cơ bằng oxy của không khí, còn trong điều kiện

kỵ khí, chúng tiến hành oxy hóa các hợp chất hữu cơ bằng con đường khử hydro để chuyển hydro cho nitrat và nitrit Qúa trình này không có lợi vì nó làm mất nitơ trong thủy vực và tạo thành các chất độc đối với thủy sinh vật như NH3, NO2- Trong đa số sinh cảnh, vi sinh chỉ có thể khử nitrat thành

nitrit, chứ không có thể khử tiếp thành các dạng hợp chất khác Do đó, ở đâu

có quá trình phản nitrat hóa xảy ra mạnh thì ở đó có nhiều nitrit

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam theo danh mục các sản phẩm xử lí, cải tạo môi trường nuôi trồng thủy sản được phép lưu hành tại Việt Nam của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong số các sản phẩm sản xuất trong nước, có nhiều sản phẩm chứa các chủng vi sinh vật có lợi trong đó có một số sản phẩm chứa các

chủng vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas và Nitrobacter thường dùng cho các

ao nuôi tôm, cá giống Một số nghiên cứu của các trường Đại học Bách Khoa

Hà Nội như nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lí nước thải sinh hoạt đô thị Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học có nghiên cứu điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn nitrat hóa trong quá trình lên men…, nhưng các nghiên cứu này cũng chỉ mới bắt đầu và cũng chưa đáp ứng được nhu cầu thực tiễn

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2009, Manju và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra quy trình cố định

hệ vi khuẩn nitrat hóa lên bột gỗ của cây thân thảo Ailantus altissima (300 -

1500µm) nhằm chuyển hóa lượng amoni trong nước nuôi tôm sang nitrat Chế phẩm có tên thương mại là TANOX (Total Amoni Oxidizer), giống vi sinh được phân lập từ trong các bể nuôi tôm, được Achuthan và cộng sự tuyển chọn trong một công trình nghiên cứu vào năm 2006 Quá trình nuôi thu sinh khối các chủng vi khuẩn nitrat hóa trong cùng một thiết bị, sau đó tiến hành bẫy - hấp thụ với bột gỗ Thời gian cố định vi khuẩn theo phương pháp này là 72h thì chế phẩm có hoạt lực nitrat hóa cao nhất Kết quả đã cho thấy, với nồng độ ban đầu 105 tế bào/ml thì 1 gram chế phẩm sau cố định trong 3 ngày

sẽ có hoạt lực nitrat hóa cao nhất Ngoài việc gắn vi khuẩn lên bột gỗ thì tác