Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas. (Khóa luận tốt nghiệp)

Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau Biogas. (Khóa luận tốt nghiệp)

NGUY N TH THU HOÀI

PHÂN L P, TUY N CH N CH NG VI KHU N NITRAT HÓA

NGUY N TH THU HOÀI

PHÂN L P, TUY N CH N CH NG VI KHU N NITRAT HÓA

L I C

Nông Lâm Thái Nguyên, Ban ch nhi m khoa Công ngh Sinh h c - Công ngh Th c ph m, cùng t t c các th n tâm d y d , truy t

nh ng ki n th c khoa h c và nh ng kinh nghi m quý báu cho em trong su t

th i gian h c t p và rèn luy n t ng

c bi t em xin chân thành c u Thành và cô giáo

em trong su t quá trình th c t p t t nghi p

h tr ng viên t u ki n thu n l i cho em th c hi n t t khóa lu n này

g ng nhi u, xong bài khóa lu n không th tránh kh i nh ng thi u sót và h n ch Kính mong nh c s chia s và nh ng ý ki

góp quý báu c a th y cô giáo và các b n

DANH M C CÁC B NG

B ng 2.1. c th u ra c a 9 h m biogas thành ph Hu 7

B ng 2.2 M t s m ch n l c c i di n hình thu c nhóm vi khu n nitrit hóa t ng 11

B ng 2.3 M t s m c a các vi khu n nitrat hóa t ng i n hình 12

B ng 4.1 Ho t tính oxy hóa amon thành nitrit c a các ch ng tuy n ch n 30

B ng 4.2 Ho t tính oxy hóa nitrit c a các ch ng tuy n ch n 31

B ng 4.3 m hình thái khu n l c các ch ng vi khu n nghiên c u 32

B ng 4.4 m t bào các ch ng vi khu n nghiên c u 33

B ng 4.5. ng c n s phát tri n c a ch ng C1 34

B ng 4.6 ng c n s phát tri n c a ch ng D3 35

B ng 4.7 ng c a nhi ng nuôi c n ch ng C1 36

B ng 4.8 ng c a nhi ng nuôi c n ch ng D3 37

B ng 4.9 k t qu th nghi m x n 40

DANH M C CÁC HÌNH

Hình 2.1 c 15

Hình 4.1 Ch ng vi khu n nitrat có ho ng Winogradsky 28 Hình 4.2 Ch ng vi khu ng có ch a thu c th Griss 29

Hình 4.3 Ch ng vi khu ng có ch a thu c th Griss 29

Hình 4.4 Hình thái khu n l c ch ng C1 và D3 32

Hình 4.5 Hình thái t bào ch ng C1 33

Hình 4.6 Hình thái t bào ch ng D3 33

Hình 4.7 Bi ng c n s phát tri n c a ch ng C1 35

Hình 4.8 Bi ng c n s phát tri n c a ch ng D3 35

Hình 4.9 Bi ng c a nhi ng nuôi c n ch ng C1 37

Hình 4.10 Bi ng c a nhi ng nuôi c n ch ng D3 37

Hình 4.11 Các bình nuôi t i th m 0 ngày 39

Hình 4.12 Các bình nuôi c y t i th m 7 ngày 40

DANH M C VÀ KÍ HI U VI T T T

TCVN : Tiêu chu n Vi t Nam

QCVN : Quy chu n Vi t Nam

M C L C

PH N 1: M U 1

t v 1

1.2 M c tiêu và yêu c u c tài 2

1.2.1 M c tiêu c tài 2

1.2.2 Yêu c u c tài 2

tài 2

c 2

c ti n 2

PH N 2: T NG QUAN TÀI LI U 3

khoa h c c tài 3

2.1.1.T ng quan v c th 3

c th c biogas 6

c c a các h p ch t ch 8

2.1.4 X c th i giàu h p ch t ch ng d ng vi khu n nitrat hóa 10

2.2.Tình hình nghiên c c và trên th gi i 18

2.2.1.Tình hình nghiên c c 18

2.2.2 Tình hình nghiên c u trên th gi i 18

20

ng và ph m vi nghiên c u 20

3.1 ng nghiên c u 20

3.1.2 Ph m vi nghiên c u 20

m và th i gian ti n hành nghiên c u 20

m nghiên c u 20

3.2.2.Th i gian nghiên c u 20

3.3 D ng c ng 20

3.3.1 D ng c thi t b 20

ng 21

3.4 N i dung nghiên c u 22

u 22

p m u 22

p và tuy n ch n vi khu n nitrat hóa 22

3.5.3.Ph m gram[13] 23

gi ng 24

25

PH N 4: K T QU NGHIÊN C U 28

4.1.Phân l p vi khu n nitrat hóa 28

4.2.Tuy n ch n ch ng có ho t tính nitrat hóa cao 28

4.2.1.Tuy n ch n ch ng có ho t tính oxy hóa amon thành nitrit 28

4.2.2 Tuy n ch n ch ng có ho t tính oxy hóa nitrit thành nitrat 29

4.2.3.Ho t tính c a các ch ng tuy n ch n 30

4.3 Nghiên c m sinh h c c a các ch ng vi khu n ch n32 m hình thái khu n l c 32

m, hình d ng t bào 32

4.4 Nghiên c u ng c a m t s y u t ng c a các ch ng nitrit hóa 34

4.4.1 nh ng c a pH 34

4.4.2 ng c a nhi 36

4.5 Kh d ng các ch ng vi sinh v n ch n vào x c th 38

PH N 5: K T LU N VÀ KI N NGH 42

5.1.K t lu n 42

5.2 Ki n ngh 42

TÀI LI U THAM KH O

I Tài li u Ti ng Vi t

II Tài li c ngoài

P M

h th c ph bi n trong c c bi t là khu v c nông thôn Nó có vai trò chính là cung c ng v t ch y u

i

V i truy n th ng s n xu là các trang tr ng n m bên c nh

n i c n gi i quy t Ngày càng có nhi u sông, kênh r ch b ô nhi m tr m

tr ng do các ch t ho i ra kéo theo các thành ph

Sau th i gian ho ng các công trình này góp ph n tích c c trong công tác

ki m soát ch ng dòng th c khi th i ra ngu n ti p nh ng th i

c khí sinh h c làm nhiên li u ph c v sinh ho c bi

vùng nông thôn hi n nay

Tuy nhiên do quá trình v n hành u t k thu t nên ch t

c th i sau khi x lý b ng h m Biog c yêu c u x

h p ch t h c bi t là h p ch t ch sang m t d ng khác không nguy

h i t ng, t i h sinh thái Xu t phát t th c t tài:

Phân l p, tuy n ch n ch ng vi khu n nitrat hóa có kh ng d ng

- Phân l p và tuy n ch c các ch ng vi khu n nitrat hóa

quy mô phòng thí nghi m

2.1 C

2.1.1.

m các t c m c ng m và tr thành nguyên nhân tr c ti p phát sinh d ch b ng th i nó có th lây

n u không x lý k p th i Bên c u lo i

c t o ra b i ho ng c a vi sinh v 3, CO2, CH4, H2S, Các lo i khí này có th gây nhi c không khí và ngu c ng m nh

Các h p ch t hoá h c th i d dàng b phân hu Tùy

u ki n hi u khí hay k khí mà quá trình phân hu t o thành các s n ph m

min, acid béo, aldehide, CO2, H2O, NH3, H2S N u quá trình phân hu có m t O2 s n ph m t o thành s là CO2, H2O, NO2, NO3 Còn

n u quá trình phân h y di u ki n thi u khí thì t o thành các s n

ph m CH4, N2, NH3, H2 Các ch t khí sinh ra do quá trình

2.1.1.2 Ô nhi m

nhanh chóng chuy n hoá thành NH3

c ti u và phân bài ti t ra ngoài, vi sinh v t s ti t ra enzime ureaza chuy n hoá ure thành NH3, NH3 phát tán vào không khí gây mùi hôi

l i khi pH gi m, NH3chuy n thành NH4+

b u (Erisipelothris insidiosa) có th t n t i 92 ngày, Brucella t 74-108 ngày, Samolnella t 6-7 tháng, Leptospira 5-6 tháng, Microbacteria

Fasciolahepatica, Fasciola gigantica, Fasciolosis buski, Ascaris suum,

n gây nhi m sau 6-28 ngày và t n t i 5-6 tháng [15]

Theo A.Kigirop (1982), các lo i vi trùng gây b Samonella,

ng m Samonella có th th m sâu xu ng l t b m t 30-40 cm, nh ng

ng xuyên ti p nh c th i Tr ng giun sán, vi trùng có th lan truy t xa và nhanh khi b nhi c m t gây d ch b nh cho

i và gia súc

Nghiên c u c a Bonde (1967) cho th các VSV gây b nh không phát tri c th i, s ng c a chúng gi m nhanh trong

vùng nhi i Samonella typhi và Samonella paratyphi, E.coli, Shigella,

Vibrio comma gây d ch t

Ngoài ra, G.Rhêinhinmer còn phân l c nhi u loài n m gây b nh

i v i vi khu n và vir ng ru t, thì th i gian s c th i càng lâu thì s ng cá th c a chúng càng nh c l i

vi khu n gây th i có 3-16 tri u/ml, vi khu n phân hu ng m , E.coli 10 x

104 - 10 x 107 t bào/ml, vi khu nh, vi khu n nitrat hoá H vi sinh v t này có ng l n tính ch t và kh làm s ch c a

STT Thông

s

Kho ng giá tr TB±s

TCN 678- 2006

QCVN 24:2009/BT NMT

1,5×106 75×106 10,6×10

+ Các thông s c quy

này s góp ph n làm suy gi m ch ng c a ngu n ti p nh n

2.1.3.

ion amoni (NH4+), nitrit (NO2-) và nitrat (NO3- ng c a nhi u y u

t hóa lý và do ho ng c a m t s vi sinh v t các d ng ni này chuy n hóa

c h ng s phát tri n c a t o và vi sinh v t phù du làm gi m xuyên c a ánh sáng m t tr n quá trình quang h p trong các l p

i M t khác, sau khi t o và các vi sinh v t phù du ch bcác vi sinh v t khác phân h y và gi i phóng NH4+ c bcác vi sinh v t hi u khí s d ng gây nên quá trình phân h y hi u khí t o ra

NO3-có th ng t i s c kh e c i do s kh nitrat trong ru t

S kh NO3- thành NO2- do vi khu n và s xâm nh a NO2- vào máu là nguyên nhân c a s t o thành methahemoglobin a NO2-liên k t ch t không thu n ngh ch v i hemoglobin khi n cho h ng c u m t kh

n chuy n oxy Các ch ng vi khu n kh dày bình

t o thành methah c bi t th y rõ tr em Tr em m c ch ng b nh

ng xanh xao và d b a t i cu c s c bi t là tr i 6 tháng tu i tr em l n tu i l n vi khu n b ch t trong d ch v có

pH axit, NO2- c h p th l c khi b kh trong ru t pH thích h p

NO2-còn là ch c gây b nh ung vì nó t o thành axit ni

k t h p v t o thành Nitrosamin là m t trong các tác nhân

Trong ao h , amoni xu t hi t s n ph m do s bi ng c a

c a vi khu c phân chia làm 2 nhóm là NH3 (khí hòa tan) và nhóm NH4+ (ion hóa) D ng khí hòa tan c c cho ao h i tác d ng c a vi khu n, amoni s b bi i thành nitrit (NO2) (b i vi khu n Nitrosomonas) r i nitrat (NO3) (b i vi khu n

ng cao>10mg/l s làm rong t o phát tri n, d n hi ng phú

v c coi là m t trong nh ng ch tiêu quan tr

ng (tính theo N) NO3- ph i nh ng NO2

ng Vi t Nam thì ch c ng m ngày cành bsuy gi m nghiêm tr ng do b nhi m m ng NH4+ có lúc lên t i

c Yên Ph là

20 mg/l

c hi n tr ng ô nhi liên k c và tác h i c a chúng

y, vi c lo i b chúng ra kh i ngu c là v c p bách c c

gi i quy t

a) Các ch ng vi khu n tham gia vào quá trình nitrat hóa

Vi khu n t ng oxy hóa amon

khu n t u khí b t bu c Các vi khu n này không l y

h p ch t ch ng hóa CO2 trong chu trình calvin benson Chúng thu c nhóm vi khu n gram âm, không sinh bào t , t bào hình c u, hình que, hình xo n

M t s i di ng cho nhóm này là gi ng Nitrosomonas,

c bi t là loài Nitrosomonas europaea c áp d ng nhi u nh t trong

ng vi khu n hình b u d c, nh bé kích c t0,4 - 0,6 1 - 1,8 µm, không sinh bào t ,có th có tiêu mao khá dài, có kh

u ch t nh y quanh t u ki n t s phát tri n

c a Nitrosomonas là: nhi 28-30oC, pH=7,0- t oxy hóa c a

d ng làm ngu n oxy hóa[7] M t s m c a các vi khu n nitrit hóa t

c trình bày tóm t t b ng sau:

2.2

ng

Loài vi khu n

m hình thái và hình th c

1,0 Chuy ng

4,75 5,1

5-10oCpH: 5,8-9,5

-50,5-51

-25-30oCpH: 7,5-8,0 Bi n

Nitrosocuccus

nitrosus

-Hình c u-1,8-2,2µm-Không chuy n

ng

-Không rõ

-20-30oCpH: 6,0-8,0

t

Nitrosococcus

mobilis

-Hình c u-1,5-1,7µm-Chuy ng

c chùm mao

-Không rõ

-15-30oCpH: 6,0-8,2 c l

Nitrosospira

Briensis

-Hình xo n-0,3-0,4µm-Chuy ng chu

mao

-54,1

-5-40oCpH: 5,7-8,2 t

Nitrosolobus

Multiformic

-X thùy nh-1,0-1,5µm-Chuy ng

-53,6-55,1

-20-30oCpH: 7,0-8,0 t

Vi khu n nitrat hóa

i vi khu n t ng khác,vi khu n ni

kh CO2 c a không khí và t o nên các ch t h n thi t chúng Lo i vi khu n hình nh t là Nitrobacter

Chúng là nh ng t bào hình b u d c, c kho ng 0,8×1,0µm Gram

âm (-), không sinh bào t Hai loài Nitrobacter ch y u là N Vinogradski(

ng) và N Agilic t oxy hóa duy nh t c a

ng và phát tri n ho t tính chuy n hoá c a chúng [2]

c 0,6-0,8 2,0µm

1,0-61,7 20-30

oCpH=7,0-8,0

Nitrospina

gracilis Hình que 57,7 Bi nNitrospina

marina

Hình xo n, sinh s n b ng

Bi n

c t quá trình oxy hóa NH4+ s c các vi khu n s

d sinh t ng h p v t ch t c a t bào t CO32- Do ch nh c r t ít

ng t quá trình oxy hóa nên t phát tri n c a các vi khu n oxy hóa amon và oxy hóa nitrit t ng là h t s c ch m ch p Th i gian th h là 0,4- i v i Nitrosomonas và 0,3- i v i Nitrobacter S n

ng t bào (g t bào khô/ N oxy hóa) là 0,29 i v i Nitrosomonas và 0,08

Quá trình nitrat hóa nh các vi khu n d ng có t m quan tr c

b i v y chúng là nh ng vi khu ng trong x ng b ô nhi m b i NH4+, NO2-, NO3-

b) Vai trò c a vi khu n nitrat hóa trong x c th i

v m albumine s ti p t c phân h y thành ammoniac (NH3

NO2- 2- s chuy n hóa thành nitrat (NO3-) [8] nh ho t

ng c a vi khu Nitrosomonas, Nitrobacter [10] Th c v t có th

khác Hai quá trình y m khí là c nh ni và ph n nitrat do t o lam và vi

v ng v t, xác bã h ng ho c hòa tan

mu i amon d c th c v t s d ng Nh quá trình này mà NH3 luôn

c ph c h i, cung c p cho th c v t th y sinh Có nhi u lo i vi khu n

và n m m c tham gia vào quá trình này ch y u là các loài c a gi ng Bacillus

Bacillus mesentericus, Bacillus mycoide, Bacillus sustilis

Quá trình nitrat hóa

Quá trình nitrat hóa là quá trình oxy hóa ni c a các mu u

Quá trình nitrat hóa t ng bao g n chính: oxy hóa mu i amon thành NO2- n oxy hóa nitrit thành NO3-(nitrat hóa) [9]

a quá trình nitrat hóa trong vi c làm s c: nó ph n ánh

m khoáng hóa c a các h p ch t h c th i, quan tr ng

u tiên amon b oxy hóa thành hydroxylamin nh enzym AMO

h i ngu n t t o ra hydroxylamin Ngu n t c do sinh ra khi oxy hóa NADH2 thành NAD+ và truy n qua cytochroen P460 M t ph n

truy n trong màng nguyên sinh ch t c a vi khu n Nitrosomonas, ph n

còn l oxy hóa hydroxylamin thành nitrit S oxy hóa hydroxylamin thành nitrit tr c:

T ng h p toàn b qua trình oxy hóa hydroxylamin này có t o ra s n

ph m trung gian NOH do enzym hydroxylamin oxydaza (HAO) xúc tác (NOH là m t h p ch t kém b n v n t gi i phóng t s oxy hóa NOH thành NO2- c s d chuy n P460 tr l i thành d ng kh D ng

kh P460 l i oxy hóa các ph n t NH3 ti p theo[12]

t c a Amon monoxyenaza là NH3 ch không ph i NH4+, b i v y quá trình oxy hóa amon

x y ra m nh nh t pH trung tính 7,5-8,5, ho c ki m khi amoniac d ng không ion hóa (NH3) nhi ]

n 2: Nitrat hóa

n oxy hóa nitrit thành nitrat do enzym nitritoxydaza và cytochrom oxydaza xúc tác

NO2- + 0,5H2O NO3- + H++ 2e

-M t khác, m t s n t sinh ra khi oxy hóa NO2-l ch truy n

k t h p v i oxy phân t t c trong nguyên sinh ch t

Vi khu n tham gia vào quá trình ph n nitrat hóa bao g m các lo i k khí không b t bu Pseudomonas, Bacillus u ki n hi u khí,

nitrit, ch không có th kh ti p thành các d ng h p ch

có quá trình ph n nitrat hóa x y ra m nh thì u nitrit

2.2.

2.2.1.

T i Vi t Nam theo danh m c các s n ph m x lí, c i t ng nuôi

tri n Nông thôn, trong s các s n ph m s n xu c, có nhi u s n

ph m ch a các ch ng vi sinh v t có l t s s n ph m ch a các

ch ng vi khu n thu c chi Nitrosomonas và Nitrobacter ng dùng cho các

ao nuôi tôm, cá gi ng M t s nghiên c u c i h c Bách Khoa

ho i h c Qu c gia Hà N i, Vi n Vi sinh v t và Công nghSinh h c có nghiên c u ki n thích h ng c a vi khu n nitrat

c nhu c u th c ti n

2.2.2.

h vi khu n nitrat hóa lên b t g c a cây thân th o Ailantus altissima (300

Ch ph i là TANOX (Total Amoni Oxidizer), gi ng vi

c phân l p t trong các b c Achuthan và c ng s tuy n

ch n trong m t công trình nghiên c Quá trình nuôi thu sinh

kh i các ch ng vi khu n nitrat hóa trong cùng m t thi t b n hành

b y - h p th v i b t g Th i gian c nh vi khu

72h thì ch ph m có ho t l c nitrat hóa cao nh t K t qu y, v i

n u 105 t bào/ml thì 1 gram ch ph m sau c nh trong 3 ngày

s có ho t l c nitrat hóa cao nh t Ngoài vi c g n vi khu n lên b t g thì tác

gi Shan và Obbard (2001) nghiên c u quy trình b y vi khu n nitrat hóa vào

t sét nh m t o ch ph m có ho t l c phân gi i amoni cao Gi ng vi khu n

c phân l p t h vi sinh v t b a có s n trong bùn các b nuôi tôm và

tr i qua m t s quy trình ho t hóa, do v y ho t l c phân gi i r n

200 mg/l Giá th b y h p ph là các h t sét, có nhi u l x p, di n tích

1g Theo k t qu c, ch c n 1g h t có th x c th i ( t

l 1:1000) v i hi u qu phân gi (kho ng 3,2 mg NH4+/l.ngày)

- N i h p

- D ng c

3.3.2.

- N i dung 1: Thu th p m u vi sinh v c th i

- N i dung 2: Phân l p và tuy n ch n các ch ng vi khu n nitrat hóa

- N i dung 3: Nghiên c u ng c a pH, nhi n kh

c th c pha loãng v c c t kh n n 10-6 V i các

n pha loãng khác nhau ta dùng pipet vô trùng hút 100µl d ch pha loãng

u lên kh p b m t th ch trung t m nhi 300C trong vòng 5-7 ngày

m khu n l ng và tính theo công th c:

N(CFU/g hay CFU/ml)=