Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn nitritnitrat hóa để ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi lợn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÀ TĨNH KHOA SƢ PHẠM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN NITRIT/NITRAT HÓA ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƢỚC THẢI CHĂN NUÔI LỢN Chủ nhiệm đề tài : ThS Nguyễn Hữu Đồng Đơn vị chủ trì đề tài: Khoa Sƣ phạm HÀ TĨNH, 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới trƣờng Đại học Hà Tĩnh, quan tạo điều kiện mặt thời gian kinh phí để tơi hồn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Hòa Duân, ngƣời thầy định hƣớng khoa học, hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện tốt suốt trình nghiên cứu, hồn thành để tài Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Huế tạo điều kiện cho tơi thực thí nghiệm phịng Cơng nghệ vi sinh Tơi xin gửi lời cảm ơn tập thể cán phịng Cơng nghệ vi sinh, Trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Huế hỗ trợ, hƣớng dẫn chia sẻ khúc mắc gặp phải q trình thực đề tài Để hồn thành đề tài không nhắc tới hỗ trợ khuyến khích tinh thần đồng nghiệp, ngƣời thân bạn bè Hà Tĩnh, ngày 17 tháng năm 2019 Chủ trì đề tài Nguyễn Hữu Đồng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiển đề tài Cách tiếp cận nghiên cứu 10 CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 11 1.1 Điều kiện môi trƣờng sinh trƣởng phát triển vi sinh vật 11 1.1.1 pH 11 1.1.2 Nhiệt độ 11 1.1.3 Nồng độ oxygen 13 1.2 Cơ sở lý thuyết trình sinh học xử lý nitơ mơi trƣờng nƣớc 14 1.2.1 Quá trình xử lý nitơ theo phƣơng pháp sinh học truyền thống 14 1.2.1.1 Quá trình nitrat hố 15 1.2.1.2 Q trình khử nitrat hố 18 1.2.2 Quá trình sinh học (ANAMMOX; SHARON) xử lý nitơ 21 1.2.2.1 Quá trình ANAMMOX (Anaerobic Ammonium Oxidation) 21 1.2.2.2 Quá trình SHARON (Single reactor High activity Ammonium Removal Over Nitrite) 23 1.3 Một số nghiến cứu khả xử lý nitơ môi trƣờng nƣớc vi sinh vật 23 1.3.1 Ở Việt Nam 23 1.3.2 Trên giới 26 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ 28 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tƣợng nội dung nghiên cứu 28 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Phƣơng pháp thu bảo quản mẫu vi sinh 28 2.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy, làm giàu phân lập chủng vi khuẩn hiếu khí có mẫu 28 2.2.3 Phƣơng pháp nhuộm Gram 29 2.2.4 Phƣơng pháp định danh vi sinh vật 30 2.2.5 Xác định điều kiện ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển hoạt động chuyển hóa amoni/nitrit chủng vi khuẩn 31 2.2.6 Phƣơng pháp xác định tiêu nghiên cứu 31 2.2.7 Phƣơng pháp tính tốn xử lý số liệu 32 2.3 Tổ chức thực đề tài 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân lập định danh vi khuẩn 34 3.2 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng, phát triển khả chuyển hóa amoni nitrit chủng P aeruginosa HT1 P stuzeri HT2 36 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ oxy hòa tan (DO) nhiệt độ đến sinh trƣởng, phát triển khả chuyển hóa amoni chủng P aeruginosa HT1 nitrit chủng P stuzeri HT2 40 3.5 Khảo sát khả chuyển hóa nitrit chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 khả chuyển hóa nitrat chủng P stuzeri HT2 44 3.6 Thảo luận 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 Kết luận 47 Kiến nghị 47 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ANAMMOX Anaerobic Ammonium Oxidation Quá trình oxy hóa amoni yếm khí BLAST Basic Local Alignment Search Tool Cơng cụ tìm kiếm trình tự BOD Biochemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa sinh hóa COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa hóa học DO Dissolved Oxygen Oxy hòa tan NCBI National Center for Biotechnology Trung tâm Thông tin Công nghệ Information sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ) PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen SHARON Single Reactor High Activity Bể đơn xử lý amoni hoạt tính cao TSS Turbidity Suspendid Solids Tổng hàm lƣợng chất rắn lơ lửng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phạm vi nhiệt độ sinh trƣởng số vi khuẩn 12 Bảng 2.1 Các cán bộ/giảng viên chuyên gia tham gia thực đề tài 33 Bảng 2.2 Các đơn vị phối hợp thực đề tài 33 DANH MỤC HÌNH Hình Kết hình thành khuẩn lạc ống nghiệm nhuộm Gram chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 34 Hình Kết so sánh trình tự 16S rDNA chủng vi khuẩn phân lập đƣợc với sở liệu NCBI 35 Hình 3 Kết hình thành khuẩn lạc ống nghiệm nhuộm Gram chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 35 Hình Kết so sánh trình tự 16S rDNA chủng vi khuẩn phân lập đƣợc với sở liệu NCBI 36 Hình Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng phát triển chủng vi khuẩn 37 Hình Sự chuyển hóa amoni chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 mơi trƣờng có bổ sung amoni với hàm lƣợng 50 mg/L (A) 545mg/L (B) 38 Hình Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng phát triển chủng vi khuẩn 39 Hình Sự chuyển hóa nitrit chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 môi trƣờng có thay đổi pH 39 Hình Sự chuyển hóa nitrit chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 môi trƣờng bổ sung nitrit với nồng độ 700 mg/L 40 Hình 10 Ảnh hƣởng nồng độ oxy (DO) (A) nhiệt độ (B) đến chuyển hóa amoni chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 41 Hình 11 Ảnh hƣởng nồng độ oxy (DO) (A) nhiệt độ (B) đến chuyển hóa amoni chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 42 Hình 12 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả nitrit hóa chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 43 Hình 13 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả nitrit hóa chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 43 Hình 14 Sự chuyển hóa nitrit chủng P aeruginosa HT1 (A) chuyển hóa nitrit/nitrat P stuzeri HT2 (B) 44 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cùng với xu hƣớng phát triển ngành chăn nuôi giới, ngành chăn nuôi nƣớc phát triển mạnh mẽ thập niên trở lại với chuyển dịch từ chăn nuôi nhỏ lẻ hộ gia đình sang hình thức chăn ni tập trung, chăn ni trang trại có quy hoạch Sự chuyển đổi hình thức chăn ni khơng đáp ứng nhu cầu thực phẩm ngƣời dân nƣớc mà xuất số lƣợng lớn, với xu hƣớng ngày tăng Trong đó, chăn ni lợn đóng góp tỷ trọng lớn cấu ngành chăn nuôi từ quy mô, số lƣợng đến giá trị thực phẩm giá trị kinh tế đem lại Tuy nhiên, mặt trái phát triển mạnh ngành chăn nuôi gây ô nhiễm môi trƣờng trầm trọng với lƣợng khổng lồ chất thải chăn ni đƣợc thải mơi trƣờng Theo ƣớc tính, hàng năm có hàng trăm tỷ chất thải chăn ni đƣợc thải môi trƣờng khắp nơi giới Ở Việt Nam, phát triển nhanh ngành chăn nuôi dẫn đến lƣợng chất thải chăn nuôi khổng lồ đƣợc đƣa vào môi trƣờng với khoảng 85-90 triệu tấn/năm Tuy nhiên, có khoảng 40% lƣợng phân đƣợc xử lý, gây nên ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng Việt Nam Trong nƣớc thải chăn ni nitơ tổng số thơng số đáng quan tâm ảnh hƣởng mặt môi trƣờng lẫn sức khỏe ngƣời Khi hàm lƣợng nitơ lớn 500 µg/l với hàm lƣợng photpho lớn 20 µg/l nƣớc thải gây tƣợng phú dƣỡng Ngoài ra, việc xử lý đƣợc thông số nitơ tổng số chắn làm giảm hai thông số quan trọng khác nƣớc thải BOD COD Theo lý thuyết để chuyển hóa hồn tồn đơn vị amoni thành nitrat phải cần 4.1 đơn vị oxy Đối với thông số nitơ tổng số nƣớc thải chăn nuôi hàm lƣợng amoni chiếm tỷ lệ cao Q trình nitrit hóa nitrat hóa chuyển hóa amoni thành nitrit nitrat, hợp chất chuyển hóa thành tiền chất ung thƣ nitroso thể ngƣời Ngoài ra, nitrit chiếm oxy máu xâm nhập vào thể ngƣời nên gây nên tƣợng ngạt thở, xanh xao, ốm yếu, thiếu máu ngƣời, đặc biệt trẻ em Q trình xử lý amoni mơi trƣờng nƣớc trải qua nhiều bƣớc để chuyển amoni thành nitơ tự Mỗi bƣớc q trình chuyển hóa nhóm vi khuẩn chịu trách nhiệm Đã có nhiều chủng vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas, Nitrobacter đƣợc phân lập, định danh khẳng định vai trò chúng q trình nitrit nitrat hóa Tuy nhiên, nhóm vi khuẩn tham gia vào trình chuyển hóa nitrit nitrat vi khuẩn có lực sinh trƣởng yếu, nhạy cảm với điều kiện với môi trƣờng chịu cạnh tranh gay gắt từ nhóm vi sinh vật khác Điều vơ bất lợi cho việc ứng dụng nhóm vi khuẩn vào thực tế xử lý nƣớc thải Vì vậy, việc phân lập chủng vi khuẩn tham gia vào q trình chuyển hóa amoni thành nitrit nitrat cơng việc có ý nghĩa lớn mặt khoa học thực tiễn việc xử lý nƣớc thải nói chung nƣớc thải chăn ni nói riêng Xuất phát từ sở khoa học vai trị quan trọng nhóm vi khuẩn nitrit nitrat hóa xử lý nƣớc thải chăn ni, việc thực đề tài “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn định danh số chủng vi khuẩn nitrit/nitrat hóa để ứng dụng xử lý nước thải chăn nuôi lợn” cần thiết Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn định danh đƣợc số chủng vi khuẩn nitrit/nitrat hóa đƣợc phân lập từ nƣớc thải lị mổ nƣớc thải chăn ni sau biogas có hoạt tính cao để ứng dụng xử lý nƣớc thải chăn nuôi lợn Ý nghĩa khoa học thực tiển đề tài - Ý nghĩa khoa học: Kết đề tài cung cấp thêm luận khoa học số chủng vi sinh có khả xử lý nitơ nƣớc thải, từ làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng vào thực tế - Ý nghĩa thực tiễn: Ứng dụng dòng vi khuẩn khả chuyển hóa nitrite/nitrate đƣợc phân lập tuyển chọn vào việc xử lý nƣớc thải đầu hầm biogas, góp phần giảm thiểu nguy ô nhiễm môi trƣờng Cách tiếp cận nghiên cứu - Tiếp cận lý thuyết: Đề tài chủ yếu sử dụng chế xử lý nitơ theo chu trình nitơ tự nhiên, trình chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng sang dạng khác đƣợc tiến hành nhóm vi sinh vật khác với mục đích lấy lƣợng để tích tụ nitơ thành dạng cần thiết cho phát triển chúng Các dạng nitơ hữu từ nguồn động thực vật sau chết đƣợc vi khuẩn amoni hóa chuyển hóa thành dạng NH4+; sau NH4+ đƣợc chuyển hóa thành NO2- nhờ vi khuẩn nitrite hóa; NO2- sinh đƣợc nhóm sinh vật nitrate hóa chuyển hóa thành NO3-, cuối nitrate đƣợc nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ trình khử nitrate - Tiếp cận thực tiễn: Việc ứng dụng vi sinh vật xử lý nƣớc thải phổ biến, mang lại hiệu cao, vi sinh vật đóng góp quan trọng vấn đề giải thông số môi trƣờng nhƣ BOD, COD, pH, nitơ tổng số, phốtpho, tổng chất rắn lơ lửng (TSS) thông số cảm quan nhƣ màu sắc, mùi nhiều loại nƣớc thải khác Trong nƣớc thải chăn ni nitơ tổng số thơng số đáng quan tâm ảnh hƣởng mặt môi trƣờng lẫn sức khỏe ngƣời Khi hàm lƣợng nitơ cao với hàm lƣợng photpho nƣớc thải gây tƣợng phú dƣỡng Vì vậy, việc phân lập chủng vi khuẩn tham gia vào q trình chuyển hóa amoni thành nitrit nitrat cơng việc có ý nghĩa lớn mặt thực tiễn việc xử lý nƣớc thải nói chung nƣớc thải chăn ni nói riêng 10 800 Nồng độ nitrite (mg/L) 700 ĐC1 600 500 ĐC2 400 300 200 P.stuzeri HT2 100 0 Thời gian (Ngày) Hình Sự chuyển hóa nitrit chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 môi trƣờng bổ sung nitrit với nồng độ 700 mg/L 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ oxy hòa tan (DO) nhiệt độ đến sinh trƣởng, phát triển khả chuyển hóa amoni chủng P aeruginosa HT1 nitrit chủng P stuzeri HT2 Ba mức nồng độ oxy hòa tan 0,1; 4,5 7,0 mg/L đƣợc khảo sát cho khả sinh trƣởng chuyển hóa amoni chủng vi khuẩn P.aeruginosa HT1 môi trƣờng có pH=7,5, mức pH đƣợc chứng minh có sinh trƣởng chuyển hóa amoni tốt chủng vi khuẩn Kết thử nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn P.aeruginosa HT1 có khả sinh trƣởng, phát triển oxy hóa amoni tốt mơi trƣờng có mức oxy thử nghiệm Đặc biệt chủng vi khuẩn P.aeruginosa HT1 có khả sinh trƣởng, phát triển oxy hóa amoni điều kiện oxy thấp 0.1 mg/L Điều chứng tỏ chủng vi khuẩn P.aeruginosa HT1 đóng vai trị quan trọng q trình oxy hóa amoni diễn tự nhiên, đặc biệt hồ xử lý sinh học, nơi thƣờng có mức oxy thấp phân bố P aeruginosa môi trƣờng đa dạng phổ biến (Hình 3.10 A) Ngoài ra, 05 mức nhiệt độ 50C; 300C; 370C; 450C 500C đƣợc thử nghiệm để khảo sát khả sinh trƣởng chuyển hóa amoni chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 Kết chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 chủng vi khuẩn ƣa ấm (mesophile) với khoảng nhiệt độ phát triển ƣa thích 30-370C (Hình 3.10 B) 40 A Ảnh hưởng nồng độ oxy đến khả chuyển hóa ammonia P.aeruginosa HT1 60 Nồng độ ammonia (mg/L) ĐC1 50 ĐC2 40 0.1% 30 4.5% 20 7% 10 0 Thời gian (Ngày) B Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chuyển hóa ammonia P.aeruginosa HT1 Nồng độ ammonia (mg/L) 60 ĐC1 50 ĐC2 30 40 37 30 45 20 50 10 0 Thời gian (Ngày) Hình 10 Ảnh hƣởng nồng độ oxy (DO) (A) nhiệt độ (B) đến chuyển hóa amoni chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 Tƣơng tự, 03 mức nồng độ oxy hòa tan (0,1; 4,5 7,0 mg/L) đƣợc áp dụng cho việc khảo sát ảnh hƣởng nồng độ oxy hòa tan khả sinh trƣởng chuyển hóa nitrit chủng vi khuẩn P.stuzeri HT2 Kết chúng tỏ vi khuẩn P.stuzeri HT2 có khả sinh trƣởng oxi hóa nitrit với tất mức oxi hòa tan thử nghiệm khơng có khác biệt tốc độ chuyển hóa nitrit q trình ni cấy có mức oxy hịa tan thử nghiệm (Hình 3.11 A) Đối với thử nghiệm ảnh hƣởng nhiệt độ, chủng P.stuzeri HT2 thuộc nhóm vi khuẩn ƣa ấm phát triển tốt với hai mốc nhiệt độ thử nghiệm 300C 370C (Hình 3.11 B) 41 A Ảnh hưởng nồng độ oxy đến khả chuyển hóa nitrit P.stuzeri HT2 70 Nồng độ nitrit (mg/L) ĐC1 60 50 ĐC2 40 0.1% 30 4.5% 20 7% 10 0 Thời gian (Ngày) B Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chuyển hóa nitrit P.stuzeri HT2 Nồng độ nitrit (mg/L) 70 ĐC1 60 ĐC2 50 30 40 37 30 45 20 50 10 0 Thời gian (Ngày) Hình 11 Ảnh hƣởng nồng độ oxy (DO) (A) nhiệt độ (B) đến chuyển hóa amoni chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến sinh trƣởng, phát triển khả chuyển hóa amoni P aeruginosa HT1 nitrit chủng P stuzeri HT2 Thí nghiệm đƣợc tiến hành mơi trƣờng khống có pH=7,5 đƣợc bổ sung thêm muối NaCl với nồng độ 1,0; 3,0 5,0% Kết cho thấy q trình chuyển hóa amoni diễn mơi trƣờng có bổ sung muối đến 3,0% khả oxi hóa amoni chủng vi khuẩn bị môi trƣờng bổ sung NaCl 5,0% (Hình 3.12) 42 Kết thử nghiệm khả chịu muối mặn chủng vi khuẩn P.aeruginosa HT1 cho thấy chủng vi khuẩn có khả sinh trƣởng, phát triển chuyển hóa amoni mơi trƣờng có nồng độ muối dao động lớn từ nƣớc nƣớc biển (3,0% tƣơng đƣơng với nồng độ muối nƣớc biển) Điều lần khẳng định vai trò quan trọng chủng vi khuẩn chu trình nitơ tự nhiên chúng oxy hóa amoni mơi trƣờng nƣớc ngọt, nƣớc lợ môi trƣờng nƣớc biển Nồng độ amoni (mg/L) 60 ĐC1 50 ĐC2 40 1% 30 20 3% 10 5% 0 Thời gian (Ngày) Hình 12 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả nitrit hóa chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 Kết thử nghiệm ảnh hƣởng nồng độ muối đến sinh trƣởng chuyển hóa nitrit chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 cho thấy chủng vi khuẩn có mức chịu đựng muối với nồng độ tối đa 3,0% (Hình 3.13) Nồng độ nitrit (mg/L) 60 50 ĐC1 40 ĐC2 30 1% 20 3% 10 5% 0 Thời gian (Ngày) Hình 13 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả nitrit hóa chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 43 3.5 Khảo sát khả chuyển hóa nitrit chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 khả chuyển hóa nitrat chủng P stuzeri HT2 Chủng P aeruginosa HT1 đƣợc thử nghiệm nuôi cấy mơi trƣờng có bổ sung 50 mg/L nitrit mà khơng có có mặt amoni mơi trƣờng dịch cấy chuyển đƣợc lấy từ mẫu nuôi cấy chủng P aeruginosa HT1 mơi trƣờng chuyển hóa hịa tồn amoni Tƣơng tự, chủng P stuzeri HT2 đƣợc thử nghiệm mơi trƣờng có bổ sung 50 mg/L nitrat mà khơng có có mặt nitrit môi trƣờng dịch cấy chuyển đƣợc lấy từ mẫu nuôi cấy chủng P stuzeri HT2 môi trƣờng chuyển hóa hịa tồn nitrit Kết thử nghiệm cho thấy nồng độ nitrit môi trƣờng nuôi cấy chủng P aeruginosa HT1 biến hoàn toàn sau 03 ngày nuôi cấy nồng độ nitrat mẫu ni cấy có sựu dao động hồn tồn khơng đƣợc phát sau 03 ngày nuôi cấy Khi thử nghiệm đƣợc tiến hành ống nghiệm chứa môi trƣờng đặc thạch có độ nóng chảy thấp (low temperature melting agar) có bọt khí xuất ống nghiệm bề mặt thạch đặc Điều chứng tỏ chủng P aeruginosa HT1 chuyển hóa nitrit thành N2 N2O thơng qua trung gian nitrat (Hình 3.14 A) Đối với thử nghiệm với chủng P stuzeri HT2, nồng độ nitrat biến sau 03 ngày nuôi cấy Thử nghiệm nuôi cấy P stuzeri HT2 ống nghiệm chứa môi trƣờng nitrit nitrat riêng rẽ phát bọt khí xuất ống nghiệm ni cấy Từ khẳng định q trình phản nitrat đƣợc thực chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 (Hình 3.14 B) Hình 14 Sự chuyển hóa nitrit chủng P aeruginosa HT1 (A) chuyển hóa nitrit/nitrat P stuzeri HT2 (B) 44 3.6 Thảo luận P aeruginose đƣợc biết đến trực khuẩn mủ xanh thƣờng gây bệnh cho ngƣời động vật Với khả chuyển hóa amoni P aeruginosa HT1 chứng tỏ vi sinh vật tồn tự nhiên bên cạnh mặt hại chúng có vai trị định mơi trƣờng Hơn nữa, P aeruginosa trƣớc chứng minh có khả chuyển hóa NO2- NO3- [6, 7, 8, 13] Điều lần khẳng định vai trò vi khuẩn P aeruginosa môi trƣờng Hiện nay, số nhóm vi khuẩn khác đƣợc chứng minh tham gia vào q trình oxy hóa amoni [12, 13, 40] Tuy nhiên, đa dạng loại vi khuẩn có khả oxy hóa amoni cịn hạn chế khiến cho vi khuẩn Nitrosomonas đƣợc biết đến nhƣ vi khuẩn có vai trị quan trọng phổ biến q trình chuyển hóa amoni tự nhiên nhƣ cơng trình xử lý nƣớc thải Do đó, chuyển hóa amoni P aeruginosa HT1 có ý nghĩa lớn việc làm tăng thêm đa dạng nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni mơi trƣờng Thêm vào đó, cơng trình nghiên cứu cịn có ý nghĩa cơng bố khả oxy hóa amoni chủng vi khuẩn P aeruginosa giới nhƣ Việt Nam Kết thử nghiệm đối chứng âm gồm bình mơi trƣờng có chứa amoni nhƣng khơng đƣợc bổ sung dịch vi khuẩn P aeruginosa HT1 hay đối chứng chứa môi trƣờng có bổ sung dịch chế phẩm đƣợc hấp khử trùng hồn tồn khơng cho thấy dấu hiệu oxy hóa amoni Điều chứng tỏ oxy hóa amoni bình ni cấy thử nghiệm chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 dịch nuôi cấy bổ sung chịu trách nhiệm Thử nghiệm mức độ hiếu khí (nồng độ oxi hịa tan-DO) cho thấy chủng vi khuẩn có khả sinh trƣởng, phát triển oxy hóa amoni điều kiện oxy thấp 0.1 mg/L Điều chứng tỏ chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 có vai trị quan trọng q trình oxy hóa amoni diễn tự nhiên, đặc biệt hồ xử lý sinh học nơi thƣờng có mức oxy thấp phân bố P aeruginosa môi trƣờng đa dạng phổ biến Tƣơng tự, kết thử nghiệm khả 45 chịu muối mặn chủng vi khuẩn cho thấy chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 có khả sinh trƣởng, phát triển chuyển hóa amoni mơi trƣờng có nồng độ muối dao động lớn từ nƣớc nƣớc biển (3,0% tƣơng đƣơng với nồng độ muối nƣớc biển) Điều lần khẳng định vai trò quan trọng chủng vi khuẩn chu trình nitơ tự nhiên chúng oxy hóa amoni mơi trƣờng nƣớc ngọt, nƣớc lợ mơi trƣờng nƣớc biển Lồi vi khuẩn P stuzeri đƣợc biết đến lồi vi khuẩn có khả khử nitrat [37, 38] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu gần chứng minh chúng có khả chuyển hóa nitrit [4] chủng thuộc lồi P stuzeri đƣợc ứng dụng rộng rãi việc xử lý thông số nitơ ao nuôi thủy sản Do đó, việc ứng dụng lồi vi khuẩn xử lý nƣớc thải nông nghiệp, công nghiệp nƣớc thải sinh hoạt giàu nguồn Nitơ mở rộng tiềm ứng dụng loài vi khuẩn Ngoài ra, loài vi khuẩn P stuzeri đƣợc cho an toàn sinh học môi trƣờng sinh thái động vật thủy sinh nhƣ ngƣời nên việc ứng dụng chủng vi khuẩn công nghệ xử lý nƣớc thải lựa chọn tối ƣu mặt công nghệ môi trƣờng 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Phân lập đƣợc 01 chủng vi khuẩn khiết từ mẫu nƣớc thải sau biogas trang trại chăn ni lợn tập trung có khả oxi hóa đƣợc amoni kết giải trình tự gen 16s DNA cho thấy chủng thuộc loài P aeruginosa đƣợc định danh P aeruginosa HT1 Phân lập đƣợc 01 chủng vi khuẩn từ mẫu nƣớc thải lị mổ gia súc có khả chuyển hóa nitrit thuộc lồi P stuzeri đƣợc định danh P stuzeri HT2 Cả hai chủng vi khuẩn Gram âm, ƣa ấm (30-370C) phát triển tốt pH= 7,0 - 7.5 chúng tồn khoảng pH từ 6,0 đến 8,0 Ngoải ra, hai chủng sinh trƣởng chuyển hóa amoni/nitrit điều kiện oxy thấp (0,1 mg/L) chúng vi khuẩn hiếu khí hai chủng tồn điều kiện muối mặn lên đến 3,0% Chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 chuyển hóa amoni với nồng độ lên đến 545 mg/L khoảng thời gian ngày chủng vi khuẩn P stuzeri HT2 chuyển hóa hồn tồn nitrit lên đến 700 mg/L vòng 03 ngày Cả hai chủng vi khuẩn P aeruginosa HT1 P stuzeri HT2 có khả chuyển hóa nitrit thành N2 N2O thơng qua q trình phản nitrat Cả hai chủng cho thấy tiềm to lớn ứng dụng xử lý thông số nitơ nƣớc thải môi trƣờng nƣớc nƣớc nƣớc mặn Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu điều kiện ảnh hƣởng khác đến sinh trƣởng phát triển khả chuyển hóa chủng vi khuẩn nhƣ chất kháng sinh chất tẩy rữa, chất thƣờng có mặt nƣớc thải sinh hoạt, nƣớc thải công nghiệp nƣớc thải chăn nuôi Tiếp tục thực thí nghiệm mơ tả thêm đặc tính sinh học hai chủng phân lập đƣợc 47 Tiếp tục khảo khả oxi hóa amoni chủng vi khuẩn P.stuzeri HT2 khảo sát khả khử nitrat chủng P.aeruginosa HT1 Làm sáng tỏ khí sinh q trình phản nitrat N2 hay N2O điều có ý nghĩa quan trọng việc góp phần gây hiệu ứng nhà kính 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Alleman, J.E (1985), Elevated Nitrite Occurrence in Biological Wastewater Treatment Systems, Water Sci Technol, 17, 409; [2] Bernet, N., Delgenes, N., Akunna, J C., Delgenes, J P., Moletta, R (2000), Combined anaerobic- aerobic SBR for the treatment of piggery wastewater, Water Research, 34(2), 611- 619; [3] Bock E, Koops H-P and Harm H (1986), Cell biology of nitrifying bacteria In: Nitrification, JI Prosser (ed) IRL Press pp 17 - 38; [4] Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ phốtpho, Nhà xuất khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội; [5] Lê Văn Cát, Trịnh Xuân Đức (2015), Hệ thống tổ hợp tương hỗ kỹ thuật xử lý nước thải, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội; [6] Chen F, Xia Q, Ju LK (2003), Aerobic denitrification of Pseudomonas aeruginosa monitored by online NAD(P)H fluorescence, Applied and Environmental Microbiology, 69(11), 6715 - 6722; [7] Chen F, Xia Q, Ju LK (2005), Competition between oxygen and nitrate respirations in continuous culture of Pseudomonas aeruginosa performing aerobic denitrification, Biotechnology and Bioengineering, 93(6), 1069-1078; [8] Davies KJP, Lloyd D, Boddy L (1989), The Effect of Oxygen on Denitrification in Paracoccus denitrzfians and Pseudomonas aeruginosa, Journal of General Microbiology, 135, 2445 - 2451; [9] Cao Ngọc Diệp, Nguyễn Thị Hoàng Nam (2012), Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Acinetobcter loại bỏ amoni nước thải từ rác hữu cơ, Tạp chí Khoa học, số 22b: 1- 8; [10] Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H., Stackebrandt, E (2006), The prokaryotes: vol 4: bacteria: firmicutes, cyanobacteria, Springer Science & Business Media; [11] Vũ Minh Đức (2011), Hóa học nước vi sinh vật học, NXB Xây dựng, Trƣờng đại học Kiến Trúc Hà Nội; [12] Ehrich S, Behrens D, Lebedeva E, Ludwig W, Bock E (1995), A new obligately chemolithoautotrophic, nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp nov., and its phylogenetic relationship, Archives of Microbiology, 164, 16 - 23; [13] Fewson CA, Nicholas DJD (1960), Nitrate reductase from Pseudomonas aeruginosa, Biochimica et Biophysica Acta, 49, 335 - 349; 49 [14] Ford, D.L., et al (1980), Comprehensive Analysis of Nitrification of Chemical Processing Wastewater, J Water Pollut Control Fed., 52, 2726 6; [15] Furukawa, (2002), Anaerobic ammonium oxidation (anammox) in continuos flow treament with non-woven biomass carrier, Kyoto, Japan; [16] Grady, C.P.L, Jr., and H.C Lim (1980), Biological Waste Water Treatment Marcel Dekker, NY; [17] Ikeda-Ohtsubo, W., Miyahara, M., Kim, S.-W., Yamada, T., Matsuoka, M., Watanabe, A., … Miyauchi, K (2013), Bioaugmentation of a wastewater bioreactor system with the nitrous oxide-reducing denitrifier Pseudomonas stutzeri strain TR2, Journal of Bioscience and Bioengineering, 115(1), 37 - 42; [18] J Lee, (2002), Selective photocatalytic oxidation of NH3 to N2 on platinized TiO2 in water, Environ Sci Technol Vol 36, pp 5462 - 5468; [19] J W Mulder, M C M Hellinga (2001), Full scale application of the SHARON process for treatment of rejection water of digested sludge dewatering, Wa Sci Technol Vol 43, No 11, 127 - 134; [20] Kenji Furukawa, Pham Khac Lieu, Hiroyuk Tokitoh, Ritsuko Hatozaki, Takao Fujii.,(2005), Anammox and Partial Nitritation as Novel Nitrogen Removal Processes, Furukawa Lab; [21] Kümmel A, Harms H (1982), Effect of organic matter on growth and cell yield of ammonia-oxidizing bacteria, Archives of Microbiology, 133, 50 - 54; [22] Mulder, (1995), Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidezed bed reator, FEMS Microbiol Ecol; [23] M Henze, P Harremoes Wastewater treatment (1996), Biological and chemical process ed, Springer, Germany; [24] Trần Văn Nhân, Ngơ Thị Nga (2002), Giáo trình Cơng nghệ xử lý nước thải, NXB Khoa học Kỹ thuật; [25] R Crites, G Tchobanoglous(1998), Small and decentralized wastewater management systems, WCB/Mc Graw Hill; [26] Rostron, W M., Stuckey, D C., & Young, A A (2001), Nitrification of high strength ammonia wastewaters: comparative study of immobilisation media, Water Research, 35(5), 1169 - 1178; [27 ]Sarioglu, M (2005), Biological phosphorus removal in a sequencing batch reactor by using pure cultures, Process Biochemistry, 40(5), 1599 - 1603; [28] Skadsen, J and Larry Sanford (1996), The Effectiveness of High pH for Control of Nitrification and the Impact of Ozone on Nitrification Control, In Proc AWWA Water Quality Technology Conference Boston, Mass.: AWWA; 50 [29] Su, J., Liu, B., Lin, J., Yang, C (2001), Isolation of an aerobic denitrifying bacterial strain NS‐ from the activated sludge of piggery wastewater treatment systems in Taiwan possessing denitrification under 92% oxygen atmosphere, Journal of Applied Microbiology, 91(5), 853 - 860; [30] Takaya, N., Catalan-Sakairi, M A B., Sakaguchi, Y., Kato, I., Zhou, Z., Shoun, H (2003), Aerobic denitrifying bacteria that produce low levels of nitrous oxide, Applied and Environmental Microbiology, 69(6), 3152 - 3157; [31] Hoàng Văn Trình (2016), Phân lập tối ưu số điều kiện sinh trưởng vi khuẩn phản nitrate hóa mẫu nước thải trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Luận văn tốt nghiệp, đại học Nông Lâm Thái Nguyên; [32] Trịnh Quang Tuyên, Nguyễn Quế Côi, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Tiến Thơng Đàm Tuấn Tú (2010), Thực trạng ô nhiễm môi trường xử lý chất thải chăn ni lợn trang trại tập trung, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi, số 23/2010: 55 - 62; [33] Nguyễn Thị Tuyền, Nguyễn Minh Giảng, Vũ Hoàng Giang, Đinh Thúy Hằng (2009), Đa dạng vi khuẩn khử nitrate số môi trường sinh thái Việt Nam chủng đại diện, Tạp chí khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Số 25: 265 - 273; [34] Turk O., Mavinic, D.S (1986), Preliminary Assessment of a Shortcut in Nitrogen Removal from Wastewater, Can J Civ Eng., 13, 600; [35] U Van Dongen, M S M Jotten (2001), The SHARON – Anammox process for treatment of ammonium rich wastewater, Wat Sci Technol, Vol 44, No 1, 145 - 152; [36] US EPA (1993a), Nitrogen control manual, Washington, DC; [37] Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Diệp (2011), Phân lập nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ chất thải trại ni bị sữa, chất thải sữa ứng dụng xử lý nƣớc thải nhà máy sản xuất sữa, Tạp chí Khoa học, số 18a: 194 - 200; [38] Trịnh Hoài Vũ (2009), Phân lập vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri nước thải trại chăn nuôi nuôi trồng thủy sản tỉnh Sóc Trăng, Luận văn thạc sĩ khoa học, trƣờng Đại học Cần Thơ; [39] Trịnh Hoài Vũ (2014), Phân lập xác định khả khử đạm vi khuẩn Pseudomonas stutzeri nước thải ao ni cá tra, Tạp chí Khoa học trƣờng Đại học An Giang, 2(1): 16 - 25; [40] Zheng M, Liu YC, Xin J, Zuo H, Wang CW, Wu WM (2016), Ultrasonic treatment enhancement ammonia-oxidizing bacterial (AOB) activity of nitritation process Environmental Science Technology, 50 (2), 864 - 871 51 CÁC PHỤ LỤC 52 Phụ lục 1: Kết giải trình tự gen 16s DNA 53 Phụ lục 2: Bài báo Khoa học 54 ... cứu phân lập, tuyển chọn định danh số chủng vi khuẩn nitrit/nitrat hóa để ứng dụng xử lý nước thải chăn nuôi lợn? ?? cần thiết Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn định danh đƣợc số chủng vi khuẩn. .. nghiên cứu: Một số chủng vi khuẩn nitrit hóa/ nitrat hóa từ nƣớc thải lò mổ nƣớc thải sau biogas trang trại chăn nuôi tập trung Hà Tĩnh - Nội dung nghiên cứu: (1) Phân lập định danh số chủng vi khuẩn. .. dòng vi khuẩn đƣợc phân lập nƣớc thải [37] Năm 2012, Ngô Thị Kim Tuyền nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật ứng dụng xử lý nƣớc thải giàu nitơ, photpho, phân lập đƣợc 65 chủng vi sinh