Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas

NGUYỄN ĐÌNH TRÁNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN NITRAT HÓA CÓ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI SAU BIOGAS LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh

NGUYỄN ĐÌNH TRÁNG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN NITRAT HÓA CÓ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG

XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI SAU BIOGAS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Hà Nội – năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN ĐÌNH TRÁNG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN NITRAT HÓA CÓ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG

XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI SAU BIOGAS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Lương Hữu Thành

2 PGS.TS Nguyễn Lan Hương

Hà Nội – năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả

nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng

dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được

cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày… tháng…năm…

Tác giả luận văn

NGUYỄN ĐÌNH TRÁNG

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc thầy TS Lương Hữu Thành và

PGS.TS Nguyễn Lan Hương đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá

trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ công tác tại Viện Công

nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Viện Đào tạo sau đại học – Trường Đại học

Bách khoa Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình

học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Bộ môn Sinh học Môi

trường – Viện Môi trường Nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá

trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè,

đồng nghiệp trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện bản luận văn này!

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 20

Học viên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hiện trạng chăn nuôi và quản lý chất thải chăn nuôi 3

1.2 Công nghệ Biogas 6

1.2.1 Giới thiệu về biogas 6

1.2.2 Lợi ích của biogas 8

1.2.3 Hiện trạng xây dựng, lắp đặt hệ thống biogas tại Việt Nam 9

1.2.4 Chất lượng nước thải chăn nuôi sau biogas 15

1.3 Các phương pháp xử lý ô nhiễm nước thải có chứa hợp chất nitơ 16

1.3.1 Xử lý các hợp chất chứa nitơ bằng phương pháp hóa học 16

1.3.2 Phương pháp sinh học 17

1.4 Vai trò của vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ và vi khuẩn nitrat hóa trong loại bỏ nitơ sinh học trong nước thải 18

1.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa trên thế giới và tại Việt Nam trong thời gian gần đây 23

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 23

1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa tại Việt Nam trong thời gian gần đây 23

CHƯƠNG 2 VÂT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Thời gian nghiên cứu 25

2.3 Đối tượng nghiên cứu 25

2.4 Dụng cụ và hóa chất 25

2.5 Phương pháp nghiên cứu 26

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 26

2.5.2 Phương pháp phân tích và xác định tính chất nước thải 27

2.5.3 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn có khả năng nitrat 29

2.5.4 Nghiên cứu, xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và một số đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn được phân lập 31

2.5.5 phương pháp định danh và đánh giá độ an toàn sinh học của chủng tuyển chọn 33

2.5.6 Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển đối với chủngvi khuẩn được tuyển chọn 35

2.5.7 Khảo sát khả năng ứng dụng chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 trong xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Khảo sát chất lượng nước thải chăn nuôi sau biogas 37

3.2 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng nitrit và nitrat hóa 38

3.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng nitrit hóa 38

3.2.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng ôxy hóa amoni (nitrit hóa) 39

3.2.3 Phân lập vi khuẩn có khả năng oxy hóa nitrit thành nitrat 42

3.2.4 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa nitrit thành nitrat 44

3.3 Định danh và xác định độ an toàn của chủng vi khuẩn được tuyển chọn 46

3.3.1 Định danh chủng tuyển chọn 46

3.3.2 Đánh giá mức độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 52

3.4 Khảo sát ảnh hưởng một số điều kiện nuôi cấy tới sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 53

3.4.1 Thời gian nuôi cấy 53

3.4.2 Nhiệt độ nuôi cấy 54

3.4.3 pH nuôi cấy 55

3.5 Bước đầu khảo sát khả năng ứng dụng chủng vi sinh vật trong xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas 56

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 70

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

N Ni tơ

N ts Ni tơ tổng số QCVN Quy chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TSS Total solid suspended VFAs Volatile fatty acids AOB Vi khuẩn oxi hóa amon (ammonia-oxidizing bacteria)

BOD5 Nhu cầu oxy sinh hóa COD Nhu cầu oxy hóa học MLVSS Hàm lượngchất rắn lơ lửng dễ bay hơi NOB Vi khuẩn oxi hóa nitrit (nitrite-oxidizing bacteria)

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Số lượng gia súc, gia cầm giai đoạn 2000 – 2015 3

Bảng 1.2 Giá trị sản phẩm chăn nuôi giai đoạn 2000 - 2013 4

Bảng 1.3 Số lượng trang trại chăn nuôi tính đến cuối năm 2015 5

Bảng 1.4 Một số đặc tính cơ lý và cấu trúc cơ bản của Nitrosomonas và Nitrobacter 19

Bảng 1.5 Đặc điểm của một số vi sinh vật dị dưỡng có khả năng nitrat hóa 22

Bảng 2.1 Số mẫu; địa diểm lấy mẫu và đặc tính hầm khí sinh học khi lấy mẫu nước thải 26

Bảng 2.2 Trình tự mồi 27F và 1492R (Innis và cộng sự, 1990) 34

Bảng 3.1 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý trong nước thải chăn nuôi sau biogas 37

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn được phân lập 38

Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của 3 chủng vi khuẩn được phân lập 43

Bảng 3.4 Mức độ tương đồng và thông tin định danh chủng vi khuẩn N4 48

Bảng 3.5 Đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn N4 49

Bảng 3.6 Mức độ tương đồng và định danh chủng vi khuẩn N7 50

Bảng 3.7 Một số đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn N7 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình tạo biogas bởi phân giải kị khí 6

Hình 1.2 Mẫu biogas kiểu KT01 11

Hình 1.3 Mẫu biogas kiểu KT02 11

Hình 1.4 Mẫu hầm khí sinh học kiểu compozit 13

Hình 1.5 Chu trình chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ trong tự nhiên 18

Hình 3.1 Hiệu suất chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn N1; N2; N3; N4 40

Hình 3.2 Sự thay đổi hàm lượng amoni và hàm lượng nitrit trong môi trường nuôi cấy chủng N1; N2; N3; N4 41

Hình 3.3 Sự thay đổi hàm lượng nitrit và hàm lượng nitrat trong môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn N5; N6; N7 44

Hình 3.4 Sự thay đổi hàm lượng amoni và nitrit trong nuôi cấy chủng vi khuẩn N7 45

Hình 3.5 So sánh mức tương đồng với chủng vi sinh vật khác dựa trên phần mềm blast 48

Hình 3.6 So sánh mức tương đồng với chủng vi sinh vật khác dựa trên phần mềm blast 51

Hình 3.7 Sự phát triển chủng vi khuẩn N4 theo thời gian nuôi cấy, 53

Hình 3.8 Sự phát triển của chủng N7 theo thời gian nuôi cấy 53

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn N4 54

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn N7 55

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của 55

chủng vi khuẩn N4 55

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn N7 56

Hình 3.13 Hiệu suất chuyển hóa amoni của chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 trong nước thải chăn nuôi sau biogas 57

Hình 3.14 Sự thay đổi hàm lượng nitrit và nitrat trong nước thải chăn nuôi

biogas với thí nghiệm có bổ sung chủng vi khuẩn N4; N7 và không bổ sung

chủng vi khuẩn N4; N7 58

Hình 3.15 Sự thay đổi hàm lượng amoni trong nước thải khi bổ sung chủng vi

khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 59

Hình 3.16 Sự thay đổi hàm lượng nitrit và hàm lượng nitrat trong mẫu nước thải

khi bổ sung chủng vi khuẩn N4 và chủng vi khuẩn N7 60

LỜI MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi tại Việt Nam đang phát triển

rất tích cực, tăng về quy mô sản xuất, số lượng cá thể, chất lượng và giá trị sản

phẩm [10] Đây là kết quả đáng ghi nhận, với việc góp phần giải quyết nhu cầu

thực phẩm ngày càng tăng của xã hội Tuy nhiên, vấn đề xử lý chất thải chăn

nuôi là rất cấp bách Theo thống kê, mỗi năm ngành chăn nuôi nước ta sản sinh

một lượng chất thải bao gồm hơn 80 triệu tấn thải rắn, 25-30 triệu mét khối nước

thải Hiện tại, công nghệ biogas là một giải pháp thích hợp được lựa chọn để xử

lý nguồn chất thải này Dẫu vậy, một số nghiên cứu và điều tra thực tế đã chỉ ra

rằng chất lượng nước thải sau biogas chưa đủ tiêu chuẩn để xả thải theo Quy

chuẩn Việt Nam QCVN 62-MT:2016/BTNMT, đặc biệt là hàm lượng nitơ trong

nước thải vẫn cao hơn hàng chục lần cho phép [13] Hàm lượng nitơ trong nguồn

nước thải này tồn tại ở nhiều dạng khác nhau, chủ yếu là: amoni (NH4+), nitrit

(NO2-) và nitrat (NO3-) Hàm lượng nitơ trong nước cao gây ra tác động tiêu cực

đối với môi trường, ví dụ như: cạn kiệt nguồn oxy hòa tan trong nước gây độc

cho động - thực vật thủy sinh, ảnh hưởng xấu đến con người [55] Do vậy, nước

thải sau biogas cần tiếp tục được xử lý để đảm bảo chất lượng môi trường Việc

lựa chọn một giải pháp xử lý phù hợp để đảm bảo chất lượng nước thải sau

biogas là vô cùng cần thiết Sử dụng biện pháp sinh học để xử lý nước thải chăn

nuôi sau biogas nhận được nhiều sự quan tâm, do đây là phương pháp an toàn,

thân thiện với môi trường, chi phí thấp mà vẫn đem lại hiệu quả cao

Quy trình loại bỏ nitơ trong nước thải bao gồm: quá trình nitrat hóa và quá

trình phản nitrat hóa Quá trình nitrat hóa xảy ra theo 2 bước là giai đoạn nitrit và

giai đoạn nitrat hóa Bước đầu tiên là giai đoạn nitrit hóa: amoni được oxi hóa

thành nitrit nhờ các vi khuẩn oxi hóa amoni (AOB) Bước thứ 2 là giai đoạn

nitrat hóa: nitrit được oxi hóa thành nitrat nhờ các vi khuẩn oxi hóa nitrit (NOB)

Với mong muốn thúc đẩy nhanh quá trình xử lý nitơ trong nước thải chăn nuôi sau

biogas, luận văn tiến hành “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa có khả

năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas”

Mục tiêu nghiên cứu:

Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa

amoni, chuyển hóa nitrit nhằm ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

sau biogas

Nội dung nghiên cứu:

1 Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa

amoni trong nước thải

2 Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitrit

trong nước thải

3 Định danh và xác định độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn được tuyển

chọn

4 Khảo sát khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ trong nước thải của

chủng vi khuẩn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hiện trạng chăn nuôi và quản lý chất thải chăn nuôi

Chăn nuôi chiếm một tỷ phần quan trọng trong hệ thống sản xuất nông

nghiệp Trong 6 năm gần đây, ngành chăn nuôi ở Việt Nam đã phát triển theo

định hướng cụ thể, coi trọng việc sản xuất sản phẩm gia súc, gia cầm nhằm đáp

ứng tiêu dùng trong nước và xuất khẩu Giá trị sản xuất của ngành chăn nuôi đạt

mức tăng trưởng vào khoảng 5,4% bình quân hàng năm, trong khi đó tổng giá trị

sản xuất của toàn ngành nông nghiệp chỉ đạt mức tăng trưởng bình quân 4,5%

hàng năm [2]

Bảng 1.1 Số lượng gia súc, gia cầm giai đoạn 2000 – 2015

Năm Loại vật nuôi (1000 con)

Trâu Bò Lợn Dê, cừu Gia cầm

Bảng số liệu 1.1 cho thấy đàn gia súc, gia cầm của nước ta tăng liên tục theo các

năm với mức cao Giá trị sản phẩm chăn nuôi giai đoạn 2000-2015 được trình

Nguồn: Cục Chăn nuôi, 2016

Trong giai đoạn hiện nay, ngành chăn nuôi nước ta đã và đang phát triển

theo hướng trang trại quy mô tập trung, hàng trăm nhà máy chế biến thức ăn, xí

nghiệp giết mổ đã được thành lập, tạo công ăn việc làm cho nhiều người lao

động, đóng góp một phần đáng kể cho ngân sách quốc gia Có thể nói phát triển

chăn nuôi theo quy mô trang trại là hình thức chăn nuôi tập trung số lượng lớn

vật nuôi có áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật và các biện pháp quản lý kinh tế

chăn nuôi nhằm tìm kiếm một hệ thống sản xuất cho phép thu được lợi nhuận cao

nhất một cách lâu dài Sử dụng hoàn toàn thức ăn công nghiệp trong các trang

trại chăn nuôi là giải pháp hiệu quả, tiết kiệm chi phí, sức lao động lại cung cấp

đầy đủ cân đối dinh dưỡng và hợp vệ sinh cho vật nuôi sinh trưởng phát triển

Bảng 1.3 Số lượng trang trại chăn nuôi tính đến cuối năm 2015

Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung 1390

Tính đến cuối năm 2015, số lượng trang trại chăn nuôi của nước ta là

mười lăm nghìn không trăm sáu mươi tám trang trại [10] Phân bố trang trại

bao gồm: ở vùng Đồng bằng sông Hồng và vùng Đông Nam Bộ là 2 khu vực

có lượng trang trại chăn nuôi lớn nhất cả nước, số trang trại chăn nuôi còn lại

phân bố đều ở Trung du và miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Duyên hải

miền Trung, Đồng bằng sông Cửu Long và lượng trang trại ít nhất tại khu vực

Tây Nguyên Đối với chăn nuôi lợn nái và lợn thịt, quy mô trang trại chăn

nuôi tương đối nhỏ, số trang trại chăn nuôi lợn nái và trang trại chăn nuôi lợn

thịt đa số có quy mô dưới 100 con Như vậy, với quy mô chăn nuôi trang trại

như hiện nay có thể đáp ứng được đủ nguyên liệu cho biogas

Đối với chăn nuôi trang trại bò, trên 80% trang trại chăn nuôi bò có quy

mô dưới 100 con Tuy nhiên, vấn đề chăn nuôi bò ở nước ta vẫn chủ yếu là chăn

nuôi phân tán, việc thu gom phân trâu bò nhất là tại các tỉnh trung du, miền núi

còn gặp nhiều khó khăn và khó có thể triển khai được

Đối với chăn nuôi trâu, dê, ngựa quy mô chăn nuôi trang trại cũng tương tự,

gần 90% trang trại nuôi dưới 50 con Số hộ chăn nuôi nhỏ lẻ là rất phổ biến vì bình

quân mỗi nông hộ không quá một con trâu, bò Việc chăn nuôi phân tán gây khó

khăn cho công tác thu gom, quy hoạch và phát triển hệ thống kỹ thuật biogas

1.2 Công nghệ Biogas

1.2.1 Giới thiệu về biogas

Biogas là sản phẩm của quá trình phân giải các chất hữu cơ dưới tác động

của vi sinh vật trong điều kiện không có oxy Sản phẩm chính của quá trình là

khí sinh học (biogas) và các sản phẩm phân giải Biogas là khí dễ cháy, thành

phần chủ yếu là metan và cacbonic Sản phẩm phân giải là các chất đã bị phân

hủy sinh học được tạo thành từ quá trình sinh biogas [49]

Trong quá trình phân giải kị khí, rất ít nhiệt được tạo ra điều này trái

ngược với quá trình phân giải hiếu khí Năng lượng tạo ra từ các phản ứng hóa

học phân giải cơ chất chủ yếu chuyển hóa thành biogas dưới dạng khí metan

Trong hệ thống biogas diễn ra 4 quá trình chính [49]

Hình 1.1 Quá trình tạo biogas bởi phân giải kị khí

 Thủy phân

Thủy phân là giai đoạn đầu tiên trong quá trình phân hủy kị khí, trong giai

đoạn này các phân tử hữu cơ phức tạp sẽ bị phân cắt thành các thành phần nhỏ

hơn Trong giai đoạn thủy phân, các mạch polymer như carbonhydrate, lipid,

nucleic acids và protein được chuyển hóa thành glucose, glycerol, purines và

pyridines Các vi sinh vật thủy phân tiết các enzyme thủy phân các polymer sinh

học thành các hợp chất đơn giản và hòa tan như sơ đồ dưới đây

Lipid (lipase)  các axit béo, glycerol

Polysaccharide (cellulose, cellobiase, xylanase, amulase)  monosaccharide

Protein (protease)  amino axit

Quá trình thủy phân được thực hiện bởi các enzyme ngoại bào được tạo ra

từ nhiều vi sinh vật khác nhau thuộc 2 chi Streptococus và Enterobacterium [49]

Sản phẩm của quá trình thủy phân tiếp tục sẽ bị phân giải bởi các vi sinh vật liên

quan và được sử dụng cho các quá trình trao đổi chất của chính các vi sinh vật

này

 Axit hóa

Trong quá trình axit hóa, các sản phẩm từ quá trình thủy phân sẽ được

chuyển hóa thành các cơ chất có khả năng tạo metan từ các vi khuẩn lên men

Đường, amino axit và axit béo được chuyển hóa thành acetate, carbon dioxit và

hidro (chiếm tỉ lệ 70%), cũng như thành các axit béo dễ bay hơi (VFAs) và

alcohols (chiếm tỷ lệ 30%) [49] Trong giai đoạn này những vi khuẩn thuộc nhóm

kị khí tùy tiện sẽ sử dụng oxy xâm nhập vào trong hệ thống để tạo điều kiện tốt

nhất cho sự phát triển của các vi khuẩn kị khí bắt buộc khác thuộc các chi:

Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Micrococcus, Flavobacterium [44]

 Acetate hóa

Sản phẩm từ quá trình axit hóa không thể chuyển hóa một cách trực tiếp

thành metan bởi các vi khuẩn sinh metan sẽ được chuyển hóa thành các cơ chất

có khả năng sinh metan trong giai đoạn axeton hóa VFA với chuỗi carbon dài

hơn 2 đơn vị và alcohols với mạch carbon hơn một đơn vị sẽ bị oxy hóa thành

acetate và hidro Việc tạo ra hidro có thể làm tăng áp suất và được coi là sản

phẩm thừa của quá trình sinh aceton và ức chế sự trao đổi chất của các vi khuẩn

sinh acetone Trong suốt giai đoạn sinh metan, hydro sẽ được chuyển hóa thành

metan Quá trình sinh acetone và metan thường diễn ra song song như là sự công

sinh giữa 2 nhóm vi khuẩn này Hoạt động chủ yếu trong giai đoạn này là các vi

khuẩn thuộc chi Syntrophomonas, Syntrophobacter, vi khuẩn Methanobacterium

suboxydans và vi khuẩn Methanobacterium propionicum [44]

 Sinh metan

Metan và carbon dioxit được tạo ra bởi các vi khuẩn sinh metan 70%

metan được tạo thành có nguồn gốc từ acetate, 30% còn lại được tạo thành từ sự

chuyển hóa của hydro và carbon dioxit, theo phương trình sau:

Acetic acid  metan + carbon dioxit

Hydro + carbon dioxit  metan + nước

Sinh metan là bước rất quan trọng trong toàn bộ quá trình phân giải kị khí,

do nó là phản ứng hóa sinh diễn ra chậm nhất trong quá trình Quá trình sinh metan

bị ảnh hưởng nhiều bởi điều kiện vận hành Thành phần chất thải, tốc độ nạp liệu,

nhiệt độ, pH, sự hòa trộn của oxy là những yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng

hoạt động và hiệu quả của các quá trình phân giải kị khí [49]

1.2.2 Lợi ích của biogas

Việc sản xuất và sử dụng biogas từ các công trình phân giải kị khí mang

đến nhiều lợi ích to lớn đối với môi trường và xã hội Một trong những lợi ích

lớn nhất của biogas là khả năng biến đổi phế thải thành nguồn có giá trị Nhiều

quốc gia đang phải đối mặt với những vấn đề ô nhiễm môi trường nghiêm trọng

liên quan đến việc sản xuất và tạo ra quá nhiều chất thải hữu cơ từ các ngành

công nghiệp, nông nghiệp và sinh hoạt Biogas là phương pháp tuyệt vời để lưu

trữ và xử lý các nguồn ô nhiễm này

Sử dụng nhiện liệu hóa thạch như than, dầu thô, khí tự nhiên đã chuyển

hóa nguồn carbon được lưu giữ hàng triệu năm trong lớp vỏ trái đất và giải

phóng nó dưới dạng khí carbon dioxit vào khí quyển Sự gia tăng nồng độ khí

CO2 trong khí quyển gây ra hiện tượng ấm lên toàn cầu do CO2 là một loại khí

nhà kính (GHG) Việc đốt biogas cũng giải phóng CO2 Tuy nhiên, sự khác biệt

chính khi so sánh với nhiên liệu hóa thạch là carbon trong biogas được cố định từ

khí quyển bởi hoạt động quang hợp của thực vật Do vậy, chu trình carbon của

biogas là chu trình kín trong một vòng thời gian rất ngắn (từ một đến vài năm)

Biogas cũng làm giảm sự phát thải metan và nito oxit (N2O) từ quá trình lưu trữ

và sử dụng trực tiếp chất thải động vật làm phân bón Khả năng gây hiện tượng

khí nhà kính của CH4 và N2O lần lượt cao hơn 23 và 296 lần so với CO2 Khi

biogas thay thế được nhiên liệu hóa thạch sẽ góp phần giảm thiểu hiện tượng

nóng lên toàn cầu

Nhiên liệu hóa thạch là nguồn năng lượng có hạn và chỉ tập trung ở một số

khu vực nhất định trên thế giới Các quốc gia nằm ngoài khu vực này phụ thuộc

vào nhập khẩu năng lượng Hầu hết các nước châu Âu phải nhập khẩu năng

lượng hóa thạch từ các khu vực giàu nguồn tài nguyên hóa thạch như Nga và

Trung Đông Phát triển và triển khai các hệ thống năng lượng tái tạo như khí sinh

học từ các hệ thống phân giải kị khí dựa trên nguồn sinh khối của quốc gia sẽ

tăng cường an ninh năng lượng và giảm bớt sự phụ thuộc vào nhiên liệu nhập

khẩu

Việc biến nguồn phế thải thành nguồn năng lượng tái tạo mang lại nhiều

lợi ích về kinh tế cho người nông dân Năng lượng tạo thành từ quá trình có thể

sử dụng làm nhiên liệu đun nấu, làm năng lượng để chạy máy phát điện… thay

cho chi phí mua khí đốt tự nhiên và sử dụng điện Sản phẩm sau quá trình phân

giải có thể sử dụng làm nguồn phân bón cho cây trồng

1.2.3 Hiện trạng xây dựng, lắp đặt hệ thống biogas tại Việt Nam

a, đặc điểm của một số mẫu biogas

 Mẫu Biogas kiểu KT1 và KT2 [13]

Đây là 2 mẫu công trình KSH được thiết kế bởi Viện Năng lượng - Bộ

NN&PTNT KT1 và KT2 được phát triển dựa trên Tiêu chuẩn ngành 10 TCN

492:499-2002 và Tiêu chuẩn ngành 10TCN 97:102-2006 do Bộ NN&PTNT Ban

hành Hai thiết kế này được giới thiệu và phát triển trong khá nhiều dự án do Bộ

NN&PTNT quản lý Chương trình KSH Quốc gia; Dự án LEAFSAP; Dự án

LCAPS,… Trong đó, KT1 được giới thiệu áp dụng cho những khu vực có mực

nước ngầm thấp; KT2 được giới thiệu áp dụng cho những khu vực có mực nước

ngầm cao.Có thể nói, đến nay 2 mẫu thiết kết này đang đƣợc áp dụng phổ biến

nhất ở Việt Nam Theo thống kê chưa đầy đủ, trên cả nước có khoảng trên

150.000 công trình KSH đã đƣợc xây dựng áp dụng 2 mẫu thiết kế này

Thiết kế của 2 kiểu công trình này bao gồm 6 bộ phận chính: (i) Bể phối trộn; (ii)

Bể phân huỷ; (iii) Bể điều áp; iv Đầu vào; v Đầu ra và (vi) Ống dẫn khí Bể

phối trộn, bể phân huỷ và bể điều áp được xây bằng gạch Bể phân huỷ có hình

dạng mái vòm, đáy được làm bằng bê tông và tường xây bằng gạch Bể phối trộn

có hình dạng chữ nhật, không bắt buộc về cấu trúc và thể tích tuỳ theo địa điểm

xây dựng Bể điều áp có thể xây hình chữ nhật hoặc hình vòm cuốn và có thể tích

theo thiết kế phù hợp với thể tích của bể phân huỷ Ống đầu vào và ống đầu ra có

thể sử dụng vật liệu bê tông hoặc nhựa PE Cả 3 bể này được kết nối với nhau

bằng ống đầu vào và ống đầu ra Hệ thống ống dẫn khí được bố trí gắn ở vị trí

cao nhất của bể phân huỷ để dẫn khí đến các thiết bị sử dụng

- Nguyên lý hoạt động

Cả 2 mẫu KT1 và KT2 có nguyên lý hoạt động giống nhau Theo đó :

Nguyên liệu phân động vật, các loại vật chất hữu cơ được đưa vào bể phối

trộn và đi vào bể phân huỷ theo ống đầu vào cho đến khi đạt phương thức 0 Tại

thời điểm này, áp suất khí trong phần chứa khí bằng 0 (P=0) Nguyên liệu trong

bể phân huỷ sẽ được phân huỷ, tạo ra khí gas Khí gas được sinh ra được chứa ở

phần vòm chứa khí sẽ tạo áp lực đẩy dịch phân huỷ lên bể điểu áp qua đường ống

đầu ra Dịch phân huỷ trong bể điều áp tăng dần lên theo tỉ lệ khí gas được sinh

ra đến mức xả tràn sẽ tràn qua bể chứa bùn và thoát ra kênh thoát nước theo ống

xả tràn Khí được tạo ra trong bể phân huỷ theo đường ống dẫn khí đến các thiết

bị sử dụng Khi khí được sử dụng, áp suất khí trong phần chứa khí giảm xuống,

dịch phân huỷ từ bể điều áp theo đường quay trở lại bể phân huỷ Khi khí được

sử dụng hết, áp suất khí trong phần chứa khí trở lại bằng 0

Trong quá trình hoạt động của các mẫu thiết kế này, bề mặt của dung dịch

trong bể phân huỷ luôn luôn di chuyển lên và xuống với tiết diện thu hẹp khi lên

và mở rộng khi xuống (do thiết kế hình vòm cầu của bể phân huỷ) sẽ làm hạn chế

việc hình thành váng trong bể phân huỷ

Hình 1.2 Mẫu biogas kiểu KT01

Nguồn: Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, dự án khí sinh học, 2006

Hình 1.3 Mẫu biogas kiểu KT02

Nguồn: Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, dự án khí sinh học, 2006

 Ưu điểm của mẫu biogas kiểu KT01 và KT02: Vật liệu xây dựng có s n ở

hầu hết các vùng nông thôn của Việt Nam (chủ yếu là gạch, cát, đá, xi

măng,…Thiết kế của bể phân huỷ và bể điều áp hình vòm cầu nên khả năng chịu

lực cao, đồng thời tiết kiệm được vật liệu xây dựng Dễ vận hành và bảo dưỡng,

đảm bảo an toàn cho người sử dụng Hệ thống xây dựng dưới lòng đất nên tiết

kiệm diện tích đất phù hợp với những hộ gia đình có diện tích nhỏ (có thể tận

dụng diện tích phía trên để làm chuồng trại,… Mẫu thiết kế được giới thiệu và

áp dụng rộng rãi trên cả nước thông qua các dự án lớn nên đã thiết lập và đào tạo

được đội ngũ thợ xây lành nghề, thuận lợi cho việc nhân rộng tại các hộ chăn

nuôi Nếu được xây dựng đúng kỹ thuật với vật liệu có chất lượng tốt, bể phân

huỷ sẽ có tuổi thọ cao Giá thành xây dựng phù hợp với điều kiện kinh tế của đa

số hộ dân chăn nuôi Có thể lựa chọn thể tích bể phù hợp với quy mô chăn nuôi

 Nhược điểm của thiết bị khí sinh học KT1 và KT2: Thiết kế phức tạp, đòi

hỏi độ chính xác cao nên yêu cầu đội ngũ thợ xây phải được đào tạo và có kỹ

thuật tốt Khó khăn trong việc phát hiện hư hỏng và sửa chữa vì bể nằm chìm ở

dưới đất Thời gian xây dựng và lắp đặt lâu hơn so với bể làm bằng composite

Không phù hợp với những khu vực có mực nước ngầm cao và nền đất yếu

 Mẫu Biogas kiểu Compozit:

Thiết bị khí sinh học bằng vật liệu composite có nguồn gốc từ Trung Quốc Từ

khoảng những năm 2005 - 2006, mô hình này đã du nhập vào Việt Nam và đã

được sản xuất và phát triển bởi một số các doanh nghiệp hoạt động trong lĩnh vực

Việt Nam Mặc dù mới áp dụng ở Việt Nam trong thời gian ngắn trên dưới 10

năm , nhưng hiện nay hầm Biogas composite đã tương đối phổ biến ở nhiều địa

phương Số lượng hầm biogas composite đã lắp đặt đến nay khoảng gần 100.000

công trình, chỉ đứng sau hầm KT1, KT2 Đến nay, đã có nhiều thiết kế khác nhau

của hầm biogas bằng vật liệu composite, nhưng nhìn chung các thiết kế này đều

giữ nguyên lý hoạt động, vận hành giống nhau Thiết bị KSH bằng vật liệu

composite được thiết kế với 3 bộ phận chính: (i) Bể phân hủy, (ii) Bể

đầu vào và (iii) Bể đầu ra Bể phân hủy là bộ phận chính quan trọng nhất được

thiết kế dạng hình cầu, phần dưới chứa dịch và nguyên liệu phân hủy, phần trên

khối cầu là nơi chứa khí Bể đầu vào và bể đầu ra vừa là nơi đưa phân vào và đưa

dịch phận hủy ra ngoài vừa có vai trò làm bể điều áp Tùy theo mỗi loại hình

thiết kế mà bể đầu vào và bể đầu ra có thể tích bằng nhau hoặc thể tích bể đầu

vào nhỏ hơn thể tích bể đầu ra Ba bộ phận chính của hầm Biogas composite

được thiết kế trong một khối và được đặt ngầm dưới lòng đất

Hình 1.4 Mẫu hầm khí sinh học kiểu compozit

Nguồn: ngân hàng phát triển châu Á, dự án LCAPS, 2016

- Nguyên lý hoạt động:

Bể biogas compozit có nguyên lý hoạt động tương tự mẫu KT1, KT2 Nguyên

liệu phân động vật, các loại vật chất hữu cơ được đưa vào bể phân huỷ qua bể

đầu vào cho đến khi đạt phương thức 0 Tại thời điểm này, áp suất khí trong phần

chứa khí bằng 0 (P=0) Nguyên liệu trong bể phân huỷ sẽ đƣợc phân huỷ, tạo ra

khí gas Khí gas được sinh ra được chứa ở phần vòm chứa khí sẽ tạo áp lực đẩy

dịch phân huỷ lên bể điểu áp (bề đầu vào và bể đầu ra) Dịch phân huỷ trong bể

điều áp tăng dần lên theo tỉ lệ khí gas được sinh ra đến mức xả tràn sẽ tràn qua bể

chứa bùn và thoát ra kênh thoát nước theo ống xả tràn Khí được tạo ra trong bể

phân huỷ theo đường ống dẫn khí đến các thiết bị sử dụng Khi khí được sử dụng,

áp suất khí trong phần chứa khí giảm xuống, dịch phân huỷ từ bể điều áp theo

đường quay trở lại bể phân huỷ Khi khí được sử dụng hết, áp suất khí trong phần

chứa khí trở lại bằng 0 Trong quá trình hoạt động, bề mặt của dung dịch trong bể

phân huỷ luôn luôn di chuyển lên và xuống với tiết diện thu hẹp khi lên và mở

rộng khi xuống (do thiết kế hình vòm cầu của bể phân huỷ) sẽ làm hạn chế việc

hình thành váng trong bể phân huỷ

- Ưu điểm của thiết bị khí sinh học bằng vật liệu compozit:

Được làm bằng vật liệu compsite nên có độ bền rất cao Có độ kín khí, kín nước

gần như tuyệt đối Thời gian lắp đặt nhanh Lắp đặt dễ dàng, không yêu cầu đào

tạo thợ xây vì quá trình lắp đặt được thực hiện bởi các kỹ thuật viên của nhà cung

cấp dịch vụ Thích hợp với khu vực có nền đất yếu và khu vực có mực nước

ngầm cao.Vận hành và bảo dưỡng đơn giản; dễ dàng trong việc phát hiện hư

hỏng và sửa chữa Có thể di chuyển đến vị trí khác khi cần thiết

- Nhược điểm của thiết bị KSH bằng vật liệu compozit:

Chi phí đầu tư trên một đơn vị diện tích cao hơn so với các mẫu hầm khác Phải

sản xuất tập trung, vận chuyển cồng kềnh Thể tích hầm giới hạn, không thích

hợp với quy mô chăn nuôi vừa và lớn Đối với một số thiết kế cũ, khi khí gas sử

dụng hoàn toàn, dịch phân hủy trong bể phân hủy có thể tràn lên đường ống dẫn

khí gây hiện tượng tắc, khí gas không tới được thiết bị sử dụng

b, hiện trạng xây dựng, lắp đặt hệ thống biogas tại Việt Nam

Hầm khí sinh học (biogas) ở nước ta đang phát triển một cách nhanh chóng từ

những nỗ lực của chính phủ nhằm giải quyết ô nhiễm môi trường và ứng phó với

biến đổi khí hậu Trong thời gian gần đây có 2 dự án lớn đã và đang được triển

khai:

- Dự án Chương trình Khí sinh học cho Ngành Chăn nuôi Việt Nam do

Cục Chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn và Tổ chức hợp tác

phát triển Hà Lan thực hiện được chia làm 3 giai đoạn, triển khai từ năm 2003 –

2015, tính hết năm 2014 dự án đã hỗ trợ xây dựng được trên 145,000 công trình

khí sinh học tại 58 tỉnh thành trên cả nước

- Dự án Hỗ trợ Nông nghiệp các bon thấp được tài trợ từ Ngân hàng Phát triển

Châu Á, do Ban Quản lý các Dự án Nông nghiệp thực hiện từ năm 2013 – 2018 tại 10

tỉnh trên cả nước Tính đến hết năm 2015, dự án đã xây dựng và lắp đặt được 26,645

công trình quy mô nhỏ [13]

- Bên cạnh đó việc triển khai nhân rộng mô hình biogas trên khắp cả nước

còn được hỗ trợ từ chương trình Quốc gia về nước sạch và vệ sinh môi trường

Ngoài các dự án quy mô lớn trên, tại các tỉnh cũng đã và đang triển khai các dự

án nhỏ hỗ trợ xây hầm biogas cho các hộ chăn nuôi trên địa bàn tỉnh như Hưng

Yên, Vĩnh Phúc, Nam Định, Bến Tre…

1.2.4 Chất lượng nước thải chăn nuôi sau biogas

Hiện nay, hầu hết các nước trên thế giới đều sử dụng các Tiêu chuẩn nước

mặt để kiểm soát nước thải chăn nuôi sau biogas Các mẫu hầm khí sinh học nói

chung và mẫu hầm khí sinh học cỡ nhỏ (dưới 10 m3) nói riêng được thiết kế theo

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 492:4992002 và Tiêu chuẩn ngành 10TCN 97:102

-2006, do Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn ban hành Trong điều kiện lý

tưởng bao gồm: thiết kế, vận hành đúng theo Tiêu chuẩn ví dụ như cách nạp liệu,

thời gian lưu của nguyên liệu, thì chất lượng nước thải đầu ra đáp ứng được so

với quy chuẩn Việt Nam về nước thải chăn nuôi QCVN 62: BMT – 2016 và quy

chuẩn Việt Nam về nước mặt QCVN 40: BMT – 2011 Trên thực tế, việc thiết

kế, vận hành công trình khí sinh học là hầu hết chưa theo Tiêu chuẩn, do đó chất

lượng nước thải chăn nuôi sau biogas chưa đủ điều kiện xả thải

Theo báo cáo của dự án “Điều tra về hiện trạng xây dựng, lắp đặt và chất

lượng môi trường công trình khí sinh học (biogas) quy mô nhỏ, vừa và lớn – Đề

xuất giải pháp quản lý toàn diện chất thải chăn nuôi tại Việt Nam” do ngân hàng

phát triển châu Á chủ trì, phối hợp với Viện Môi trường Nông nghiệp, điều tra

trên 10 tỉnh thành Kết quả điều tra cho thấy chất lượng nước thải sau biogas vẫn

chứa hàm lượng lớn các chất gây ô nhiễm Qua thu thập và phân tích mẫu về các

chỉ tiêu COD, BOD5, TSS, Nts, Pts, coliform tổng số cho thấy đều vượt ngưỡng

xả thải loại B theo quy chuẩn Việt Nam về nước thải chăn nuôi QCVN

62:2016/BTNMT từ vài lần cho đến hàng chục lần Nồng độ nitơ tổng số (Nts)

trong nước thải sau biogas qua phân tích dao động từ 200 – 675,11 mg/l, cao

hơn quy chuẩn cho phép hơn 2 - 7 lần [13]

 Nitơ và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường nước

Sự có mặt của chất thải chứa nitơ hoặc chứa hàm lượng đạm trong dòng

thải có thể có tác động xấu hoặc gây ô nhiễm chất lượng nguồn nước tiếp nhận

Tác nhân gây ô nhiễm chính cho nguồn nước tiếp nhận là ion amoni (NH4+), ion

nitrit (NO2-), và ion nitrat (NO3-) Mối quan tâm đáng kể liên quan tới sự hiện

diện của chất thải chứa nitơ bao gồm sự cạn kiệt ôxi hòa tan, gây độc, sự phú

dưỡng và sự xuất hiện methomoglobin [55]

1.3 Các phương pháp xử lý ô nhiễm nước thải có chứa hợp chất nitơ

Hiện nay có nhiều phương pháp xử lý nước thải được áp dụng như

phương pháp cơ học, phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp

sinh học Tất cả các phương pháp xử lý hiện nay đều có những ưu, nhược điểm

Trong thực tế, quá trình xử lý nước thải cần có sự kết hợp của nhiều phương

pháp nhằm nâng cao hiệu quả và giảm thời gian xử lý

1.3.1 Xử lý các hợp chất chứa nitơ bằng phương pháp hóa học

Quá trình xử lý nước thải chứa nitơ dựa trên nguyên tắc hóa học, nước

thải được đưa đến pH trong khoảng từ 10 đến 11 bằng cách thêm vào canxi

hidroxit Ca(OH)2 để tạo thành amoni hidroxit NH4OH, khi đó amoni chuyển từ

trạng thái lỏng sang khí và sau đó được đưa ra ngoài không khí qua các tháp làm

lạnh Cheung và cộng sự đã sử dụng Ca(OH)2 với nồng độ là 10 g/l, sau thời gian

xử lý là 24 giờ và ở nhiệt độ từ 20 đến 23oC Kết quả cho thấy, đã xử lý 65 –

75% hàm lượng amoni NH4+ (khử amoni từ hàm lượng 5618mg/l xuống còn

1404,5 mg/l khi lưu lượng không khí bằng với môi trường, và 86 – 93% hàm

lượng amoni NH4+ khi lưu lượng không khí là 5l/ phút [17] Ozturk và cộng sự

đã áp dụng phương pháp này, sau 2 giờ, đã xử lý được 72 – 85% lượng amoni

trong nước thải rỉ rác khi bổ sung Ca(OH)2 với hàm lượng là 8 g/l và lưu lượng

không khí là 7,6 l/phút Tuy nhiên phương pháp này có chi phí xử lý cao vì đòi

hỏi lượng không khí lớn và lượng Ca(OH)2 sau đó phải được xử lý với axit

sunphuric H2SO4 trước khi thải ra môi trường Li và cộng sự đã thử nghiệm một

phương pháp để loại bỏ amoni trong nước thải thông qua việc kết tủa amoni dưới

dạng (NH4)MgPO4.6H2O khi thêm MgCl2 và Na2HPO4 trong quá trình xử lý

Bằng phương pháp này, với tỷ lệ Mg:NH4:PO4=1:1:1 và pH trong nước từ 8,5

đến 9, nồng độ amoni trong nước thải rỉ rác giảm từ 5.600 mg/l xuống chỉ còn

110 mg/l trong 15 phút Phương pháp này cũng đã được Yangin và cộng sự áp

dụng đối với nước thải sinh hoạt, kết quả đã loại bỏ được 66% lượng amoni trong

nước thải và phương pháp này còn có thể ứng dụng cho việc loại bỏ hợp chất

chứa photpho trong nước thải [35] Một phương pháp để xử lý nitơ khác là bổ

sung thêm clo vào nước thải trong quá trình xử lý Khi cho clo vào nước thải,

NH3 sẽ phản ứng với clo dưới dạng HOCl để tạo ra các sản phẩm trung gian là

NH2Cl, NHCl2, NCl3 Quá trình xử lý sẽ diễn ra liên tục khi thêm HOCl vào phản

ứng để tạo ra sản phẩm cuối cùng là nitơ phân tử Quá trình này diễn ra phụ

thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, pH, thời gian xử lý và tỷ lệ HOCl/NH3 Với tỷ lệ

HOCl/NH3 được tính theo mol bằng 1 tại pH trong khoảng từ 7 đến 8 tất cả NH3

đều chuyển hóa thành NH2Cl Với tỉ lệ HOCl/NH3 bằng 2 sản phẩm chủ yếu là

NHCl2, khi tỉ lệ trên bằng 3 thì sản phẩm xử lý tạo ra chủ yếu là NCl3 [37]

1.3.2 Phương pháp sinh học

Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni

(NH4+), nitrate (NO3-), ít hơn ở dạng nitrite (NO2-) và trong một số hợp chất hữu

cơ khác Thành phần được xem là bền đối với trường và không gây hiệu quả xấu

cho môi trường là khí nitơ (N2) Nitơ hữu cơ có thể tồn tại trong các sinh vật

sống hoặc các sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy các vật chất hữu cơ

[43] Xử lý nước thải có chứa hợp chất nitơ dựa trên các vi sinh vật có khả năng

chuyển hóa thành các chất không độc như khí N2, trả lại môi trường không khí

Phương pháp sinh học có những ưu điểm so với các phương pháp vật lý hóa học

như: hiệu suất khử nitơ cao, sự ổn định và tương đối dễ vận hành, quản lý, chi

phí đầu tư hợp lý và quan trọng cho sự phát triển bền vững, bảo vệ môi trường và

hệ sinh thái

Để xử lý nước thải chứa nitơ theo phương pháp sinh học, các nghiên cứu

dựa trên cơ sở là trong tự nhiên luôn tồn tại các vi sinh vật có khả năng chuyển

hóa hợp chất nitơ Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên được trình bày ở

hình 1.5

Các quá trình trong chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng này sang dạng khác

đều được tiến hành bởi các nhóm vi sinh vật khác nhau với mục đích lấy năng lượng

hoặc để tích tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sự phát triển của chúng.Các dạng nitơ

hữu cơ từ nguồn động thực vật sau khi chết được các vi khuẩn amoni hóa chuyển hóa

thành dạng ion amoni NH4+ ; sau đó amoni NH4+ được chuyển hóa thành nitrit NO2

-nhờ vi khuẩn nitrite hóa; NO2- sinh ra được nhóm sinh vật nitrate hóa chuyển hóa thành

NO3

-; cuối cùng nitrate được nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ

quá trình khử nitrate [43] (Hình 1.5)

Hình 1.5 Chu trình chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ trong tự nhiên

1.4 Vai trò của vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ và vi

khuẩn nitrat hóa trong loại bỏ nitơ sinh học trong nước thải

Trong nước thải có nhiều thành phần khác nhau, bao gồm các hợp chất

hữu cơ và vô cơ Trong đó các hợp chất chứa nitơ và photpho chiếm tỷ lệ lớn

Nitrate hóa là quá trình oxi hóa amoni (NH4+) thành nitrat (NO3-), quá trình này

cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt động Quá trình oxi hóa này xảy ra

cùng với quá trình đồng hóa cacbonic (CO2) Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng

hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có khả năng thực hiện quá trình

này Nitrate hóa qua 2 giai đoạn:

Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa amoni (NH4+) thành nitrite (NO2-) bởi một số

đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrite hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis,

Nitrosococcus, Nitrosolobus Tất cả chúng khá giống nhau về mặt sinh lý, sinh

hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào Các đại diện của chi

Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục Trên môi

trường lỏng, quá trình phát triển của vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas trải qua

một số giai đoạn và phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường [29]

Giai đoạn 2 của quá trình nitrate hóa oxi hóa nitrite (NO2-) thành nitrate

Tế bào đặc trưng của nhóm vi khuẩn Nitrobacter trong dịch nuôi là dạng

hình que tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động

Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể liên kết với nhau thành tập đoàn

Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, thỉnh thoảng có dạng hình

cầu, không di động, và có đặc trưng là liên kết tạo thành tập đoàn Nitrococcus

mobilis thì có dạng hình tròn, có tiêm mao [29]

Bảng 1.4 Một số đặc tính cơ lý và cấu trúc cơ bản của Nitrosomonas và

Nhu cầu oxy Hiếu khí bắt buộc Hiếu khí bắt buộc

Dải pH cho sự phát triển 5,8 – 8,5 6,5 – 8,5

Thời gian thế hệ 8 – 36 giờ 12 – 60 giờ

Nhiệt độ phát triển 5 - 40oC 5 - 40oC

Nguồn: Sharma B and Ahlert R.C 1977

Giá trị pH thích hợp cho nhóm vi khuẩn Nitrosomonas là từ 7,8 đến 8,

Nitrobacter là từ 7,3 đến 7,5 Nitrobacter sẽ tăng trưởng chậm hơn ở các mức pH

cao đặc trưng cho các thủy vực nước mặn Nitrosomonas sống ở những nơi giàu

NH3 và các muối vô cơ như trong bùn đáy ao, nước cống, nước ngọt, các thủy

vực bị ô nhiễm chứa nhiều hợp chất nitơ nhằm tránh ánh sáng Nitrobacter không

có khả năng di động và cần phải bám vào bề mặt giá thể như đá, cát, hoặc một

giá thể sinh học

Nitrobacter không thể sống trong môi trường khô Trong môi trường

nước, chúng có thể tồn tại trong khoảng thời gian ngắn ở các điều kiện bất lợi

nhờ vào việc sử dụng các chất dự trữ bên trong tế bào

Oxy hóa amoni bao gồm hai phản ứng kế tiếp nhau nên tốc độ oxy hóa của quá

trình bị khống chế bởi giai đoạn có tốc độ thấp hơn Tốc độ phát triển của

Nitrosomonas chậm hơn Nitrobacter do đó nồng độ NO2- thấp hơn trong giai

đoạn ổn định Vì vậy trong quá trình động học người ta chỉ sử dụng các thông số

liên quan đến vi khuẩn Nitrosomonas để đặc trưng cho quá trình oxy hóa amoni

[29] Quá trình chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ không chỉ diễn ra do các chi vi

khuẩn nói trên mà trong tự nhiên còn nhiều nhóm vi sinh vật khác cũng có khả

năng chuyển hóa như vậy Nghiên cứu khả năng chuyển hóa amoni, nitrite,

nitrate, Zhang và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn Pseudomonas

stutzeri không chỉ có khả năng chuyển hóa nitrite mà còn có khả năng chuyển

hóa amoni Sau thời gian 18 giờ, chủng vi khuẩn này đã chuyển hóa được amoni

hoàn toàn thành dạng khí N2 với hiệu suất là 39% [46] Một nghiên cứu khác của

Zhang và cộng sự (2015) đã phân lập được vi khuẩn Microbacterium

esteraromaticum SFA13 trong xử lý nitơ cho thấy trong môi trường ở điều kiện

pH từ 7 đến 8 và nhiệt độ là 30oC, chủng Microbacterium esteraromaticum

SFA13 có khả năng tách amoni đạt giá trị 2.33 ± 0.21 mg NH4+ L−1 h−1 [19]

Ngoài ra, quá trình nitrat hóa còn được thực hiện bởi một số vi khuẩn dị

dưỡng

 Sinh hóa và Sinh lý học liên quan vi khuẩn nitrat hóa dị dưỡng

Vi khuẩn oxy hoá amoni (AOB) sử dụng amoni monooxygenase (AMO)

và hydroxylamin oxidoreductase có chứa nhiều nhóm heme (HAO) để oxy hóa

amoni đến nitrit như nguồn năng lượng duy nhất Hầu hết, nhưng không phải tất

cả, các loài vi khuẩn dị dưỡng mêtan, các vi sinh vật có tính tương đồng về chức

năng và cấu trúc với AOB, cũng oxy hóa ammonia với nitrit bằng cách sử dụng

enzym tương tự với AOB, nhưng thực hiện qua sự đồng trao đổi chất [29]

Các vi khuẩn nitrat hóa dị dưỡng, đặc biệt là Paracoccus pantotrophus

GB17 (trước đây là Paracoccus denitrificans GB17 và Thiosphaera pantotropha)

có thể có cùng enzyme với AOB; Một enzyme có cấu trúc và chức năng tương

đồng với AMO [32] và một hydroxylamin oxidase không có nhóm heme [31]

Tuy nhiên, hiện tại chưa có trình tự bộ gen hoàn chỉnh cho sinh vật này và kiểm

tra sinh hóa tiếp theo, chi tiết về cấu trúc, chức năng và tiến hóa của các enzym

này vẫn còn chưa xác định Các enzyme oxy hoá hydroxylamine đã được phân

lập từ nhiều vi khuẩn nitrat hóa dị dưỡng, nhưng cho đến nay chỉ có enzyme

được đặc trưng bởi quá trình oxy hoá amoniac kỵ khí (anammox) đã được tìm

thấy có các đặc tính tương tự với HAO tinh khiết từ AOB N europaea [39] Hai

loại enzyme oxy hóa hydroxylamine khác biệt ngoài HAO và cytochrome P460

đã được phân lập từ các vi khuẩn nitrat hóa dị dưỡng, loại phổ biến nhất là

enzyme nhỏ (khoảng 20 kDa), monomeric, không có nhóm heme Một loại hoàn

toàn khác của enzyme oxy hóa hydroxylamine giả định đã được phân lập từ

Pseudomonas sp chủng PB16 nhưng chưa được xác định trong các dòng phân

lập khác Cùng với, các enzyme oxy hóa hydroxylamin phân biệt thành bốn lớp

riêng biệt, nhưng chỉ có HAO và cytochrome P460 có đặc tính hoá sinh học, di

truyền [24]

 Sự đa dạng của vi khuẩn dị dưỡng nitrat hóa

Một số vi khuẩn và sinh vật nhân chuẩn (chủ yếu là nấm) có khả năng

nitrat hóa dị dưỡng đã được phân lập từ một số môi trường Như đã thảo luận ở

trên, enzyme và các gen để nitrat hóa dị dưỡng là đa dạng và vẫn còn bí ẩn Sự

duy trì trong thời gian dài của kiểu vi khuẩn nitrat hóa dị dưỡng Pantotrophus

GB17, gây ra một sự mất dần dần hoạt động nitrat hóa dị dưỡng của nó [47] Do

đó, điều kiện môi trường cụ thể rõ ràng là cần thiết để duy trì hoạt động này

Bảng 1.5 Đặc điểm của một số vi sinh vật dị dưỡng có khả năng nitrat hóa

Sinh vật Cơ chất Denitrit

hiếu khí

Enzyme được nhận diện

Môi trường sống Gammaproteobacteria

Pseudomonas chlororaphis

ATCC 1385

NH2OH, pyruvic oxim

Có Chưa rõ Bùn sông

P putida DSMZ-1088-

260

Amoni, NH 2 OH, nitrite

Nguồn: Lisa Y Stein, 2011

1.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa trên thế giới và tại Việt Nam

trong thời gian gần đây

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Vi sinh vật oxy hóa amoni là các vi sinh vật tạo ra năng lượng chỉ bằng quá

trình oxy hóa amoni thành nitrit Bước này tạo ra một lượng nhỏ năng lượng dẫn

đến tỷ lệ phát triển chậm và sinh khối thấp của các vi sinh vật này, tạo nên sự

khhos khăn để phân lập Các vi khuẩn oxy hóa amoni đầu tiên (AOB) được phát

hiện vào cuối thế kỷ XIX bởi Winogradsky [53; 54] Trong nửa sau của thế kỷ

hai mươi, một số nhóm bắt đầu nuôi cấy và phân lập AOB từ môi trường đa dạng

như là môi trường như nước biển, các hệ thống cửa sông, đất, và các hệ thống xử

lý nước thải Với sự phát triển của phương pháp phân tử, dựa trên DNA, AOB

được nghiên cứu sự phát sinh đặc trưng loài Hầu hết các vi sinh được phân lập

thuộc về nhóm Betaproteobacteria Tuy nhiên, một số AOB sống ở biển thuộc về

Gammaproteobacteria Các phương pháp phân tử nhắm mục tiêu đến 16S RNA

hoặc gen amoA, gen mã hoá tiểu đơn vị alpha của amoni monooxygenase,

enzyme đầu tiên trong Oxy hóa ammonia của AOB cũng được sử dụng để có

được một cái nhìn sâu sắc vào sự phân bố môi trường của AOB khác nhau Đầu

thế kỷ 21, phân tích metagenomic của đất và các mẫu vi sinh vật biển cho thấy sự

hiện diện của gen amoA không đơn giản giới hạn trong phạm vi của vi khuẩn

Gen amoA cũng được tìm thấy trong Cổ khuẩn, dẫn tới việc phát hiện ra vi

khuẩn cổ amoniac oxy hoá (AOA) AOA Nitrosopumilus maritimus đầu tiên

được phân lập úy từ nước biển trong hồ Seattle

1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa tại Việt Nam trong thời gian

gần đây

Năm 2013, tác giả Đỗ Mạnh Hào đã nghiên cứu giải pháp nâng cao khả

năng tự làm sạch chất ô nhiễm nitơ của vi khuẩn nitrat hóa và phản nitrat hóa bản

địa trong đầm nuôi thủy sản nước lợ ven biển phía Bắc Việt Nam Đã phân lập và

tuyển chọn được 34 chủng vi khuẩn có hoạt tính nitrate hóa và phản nitrate hóa

từ khu vực ven biển Hải Phòng Các chủng này được phân loại thành 4 giống là

Nitrosococcus (2 chủng), Nitrosomonas (4 chủng), Nitrobacter (4 chủng) và

Bacillus (4 chủng) Tốc độ nitrate hóa và khử nitrate hóa trong khu vực nghiên

cứu dao động từ 1,5 – 8,6 mgN/g -language:AR-SA'>g đất ướt/giờ và từ 11 – 58

mgN/g -language:AR-SA'>g đất ướt/giờ tương ứng [3]

Năm 2012, tác giả Hoàng Phương Hà và cộng sự, thực hiện nghiên cứu

phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn nitrat hoá từ nước lợ nuôi tôm tại

Quảng Bình và Hà Tĩnh với mục đích tuyển chọn một số chủng điển hình có khả

năng sử dụng để xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản, từ các ao nuôi tôm nước

lợ tại Quảng Bình và Hà Tĩnh, trên môi trường Winogradsky I và II cải tiến, đã

phân lập được 17 chủng vi khuẩn nitrat hoá (10 chủng vi khuẩn oxy hoá amoni

và 7 chủng vi khuẩn oxy hoá nitrit), trong đó đã tuyển chọn 6 chủng vi khuẩn

nitrat hoá có khả năng ứng dụng trong thực tiễn là HT1-2; HT2-2; TS10; HT1-3;

TS2; CP10, các chủng được được ứng dụng trong xử lý nước ao tôm hiệu quả

Bùi Thế Vinh và cộng sự (2012), từ 13 mẫu chất thải từ trại nuôi sữa, chất trạm

thu mua sữa bò, nhà máy sữa, phân lập được 47 dòng vi khuẩn Trong đó, dòng vi

khuẩn Arthrobacter mysorens, Arthrobacter protophormiae, Arthrobacter mysorens và

Arthrobacter sp WBF35 Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter sp SH-94B,

Acinetobacter calcoaceticus, có khả năng oxy hóa ammonium và khử nitrat tốt

nhất ở nồng độ 700 mM Ứng dụng vào trong xử lý nước thải nhà máy sữa,

chúng làm giảm ammonium từ nồng độ ban đầu 20 mg/l xuống dưới 5 mg/l và tỉ

lệ loại bỏ COD, NO3

lần lượt là 27,63% và 99,90%, sau 2 ngày Năm 2014, Cao Ngọc Điệp và Đoàn Tấn Lực đã phân lập, tuyển chọn và

ứng dụng vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ bãi rác để xử lý nitơ trong nước rỉ rác Kết

quả đã phân lập được bốn mươi lăm dòng vi khuẩn chuyển hoá nitơ từ nước rỉ

rác của 5 bãi rác ở Vĩnh Long, Cần Thơ và Hậu Giang Một số chủng có khả

năng chuyển hóa hàm lượng nitơ rất hiệu quả, sau 5 ngày nuôi cấy chủng trong

môi trường có nồng độ amoni ban đầu là 400mg/l, thì hàm lượng nitơ đã giảm

xuống còn 50mg/l

CHƯƠNG 2 VÂT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học môi trường – Viện Môi trường Nông

nghiệp – Viện Khoa học Nông nghiệp

2.2 Thời gian nghiên cứu

03/2015 – 06/2016

2.3 Đối tượng nghiên cứu

 Vi khuẩn có khả năng nitrat hóa trong mẫu nước thải sau biogas tại một số

trang trại chăn nuôi lợn ở Xã Giao Châu, Huyện Giao Thủy, tỉnh Nam

Định

2.4 Dụng cụ và hóa chất

a Hóa chất

- Hóa chất phân tích NO2-: C6H7NO3S,; CH3COOH; C10H9N;

- Hóa chất phân tích NH4+: NaKC4H4O6; HgI2; KI; NaOH;

- Các hóa chất nhuộm tế bào: dung dịch tím kết tinh; dung dịch lugol;

dung dịch fucsin; cồn C2H5OH 90%

- Các hóa chất sử dụng làm môi trường nuôi cấy: Cao nấm men (Ấn Độ),

pepton (Trung Quốc), cao thịt (Trung Quốc), , agar (Việt Nam), (NH4)2SO4;

K2HPO4; MgSO4.7H2O; FeSO4.7H2O; NaCl; CaCO3; NaNO2; NaCl; Na2CO3;

MnSO4; Na2MoO4.2H2O; KH2PO4; KNO3; NH4Cl; CH3COONa.3H2O;

CaCl2.2H2O; ZnSO4.7H2O; CoCl2.6H2O; CuCl2; H3BO3; NiCl2.H2O, EDTA-Na2;

EDTA-NaFe; NaOH (Trung Quốc)

- Các hóa chất phân tích ADN: Tris HCl 100 mM, EDTA 10 mM, NaOH

0.1 N, SDS 0.5%, Chloroform:isoamyancohol, NaCl 0.5 M, Tris-acetate-EDTA

+ Marker: Thermo Scientific GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder

+ Tách chiết ADN: NaCl; Lysis buffer; lysozyme; CH3COOK; CHCl3

-IAA; (Merck – Đức)

b, Thiết bị:

- Buồng cấy vô trùng (Pháp)

- Máy lắc Inforsagch – 4103 (Pháp)

- Tủ sấy , tủ ấm (Trung Quốc )

- Cân phân tích (Nhâṭ )

- Nồi khử trùng Tomy SS 325 (Nhâṭ )

- Máy đo DO meter Hanna HI 8043 (Hàn Quốc )

- Máy đo pH Hanna 8733 (Hàn Quốc )

- Kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản)

- Máy li tâm

- Bộ điện di DNA (Scientific – Anh)

- Thiết bị chu trình nhiệt Mastercycler

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu

- Mẫu nước được thu thập dựa theo Tiêu chuẩn Việt Nam về lấy mẫu nước

thải: TCVN 5999:1995, các mẫu nước thải được lấy tại bể điều áp thuộc

hệ thống hầm khí sinh học

- Thông tin về số mẫu; địa điểm lấy mẫu: thôn Đắc Sở, thôn Tiên Chưởng,

xã Giao Châu, Huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định

Bảng 2.1 Số mẫu; địa diểm lấy mẫu và đặc tính hầm khí sinh học khi lấy

mẫu nước thải

Địa điểm lấy mẫu Kiểu hầm khí

sinh học

Kích cỡ hầm khí sinh học

Số mẫu được thu thập

2.5.2 Phương pháp phân tích và xác định tính chất nước thải

a) Phương pháp xác định pH nước thải:

Mẫu nước thải chăn nuôi sau biogas được xác định giá trị pH theo phương

pháp Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6492:2011

b) Phương pháp xác định nhu cầu oxy sinh hóa (BOD): TCVN 6001 – 2008

Mẫu nước thải chăn nuôi sau biogas được xác định giá trị thông số nhu cầu

oxy sinh hóa theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6001-2:2008

c) Phương pháp xác định nhu cầu oxy hóa học (COD):

Mẫu nước thải chăn nuôi sau biogas được xác định giá trị thông số nhu cầu

oxy hóa học theo phương pháp Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6491: 1999 (ISO

6060: 1989)

d) Phương pháp xác định hàm lượng amoni NH4

+

[20]

- Lập đường chuẩn amon với chất chuẩn là NH4Cl có nồng độ: 0; 0,1;

0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1 mg/L Lấy lần lượt 50 mL các mẫu

chuẩn ở các nồng độ khác nhau và bổ sung vào từng bình phản ứng, thêm vào

mỗi bình 0,5 mL dung dịch muối NaKC4H4O6, tiếp tục thêm 1 mL dung dịch

thuốc thử Nessler, lắc đều và để yên 5 – 10 phút Đo mật độ quang ở bước sóng

450 nm và lập đường chuẩn Xác định hàm lượng amon của mẫu nước thải đã

tách cặn tương tự Hiệu suất oxy hóa amoni (hiệu suất tách amoni) được xác

định theo công thức: E1 = {(TKNo1 – TKNe1)/TKNo1}.100 (%)

TKNo1 : Nồng độ NH4+_N ban đầu

TKNe1 : Nồng độ NH4

+

_N sinh ra sau thời gian nuôi cấy (mg/L) e) Xác định hàm lượng nitrit NO2- theo phương pháp Griss[20]

Khả năng chuyển hóa nitrite (NO2-) thành nitrate (NO3-) của các chủng

được đánh giá thông qua sự giảm nồng độ nitrite trong môi trường nuôi cấy

 Nguyên tắc

Hàm lượng NO2- được xác định dựa trên phản ứng tạo màu hồng của NO2

-với thuốc thử Griss

Chuẩn bị thuốc thử:

+ Griss 1: Hòa tan 0,5g axit sunfaninic vào 150ml axit acetic 5N

+ Griss 2: Hòa tan 0,5g α- Naphtylamin vào 50ml nước cất, bổ xung 150

axit acetic 5N Bảo quản trong tủ lạnh

Tiến hành: Thêm 0,05ml Griss 1 và 0,05ml Griss 2 vào 5ml dung dịch mẫu

nghiên cứu, sau 10 phút phản ứng kết thúc đo độ hấp thụ ở bước sóng A540 nm

Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ nitrit

 Với các dung dịch mẫu làm tương tự như lập đường chuẩn

 Hiệu suất oxy hóa nitrit được xác định theo công thức:

E2 = {(TKNo2 – TKNe2)/TKNo2}.100 (%)

TKNo2: Nồng độ NO2-_N ban đầu

TKNe2 : Nồng độ NO2-_N sinh ra sau thời gian nuôi cấy (mg/L)

f) Phương pháp xác định hàm lượng nitrat NO3- [20]

Phương pháp dựa trên nguyên tắc giữa phản ứng của nitrat và hợp chất

brucine tạo thành phức hợp màu nâu vàng có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước

sóng 410 mm

Hóa chất: Dung dịch nitrat chứa 100mg N/l; Natri asenit: Hòa tan 0,5g

NaAsO2 trong 100 ml nước cất; thuốc thử brucine: hòa tan 1g brucine-sulfate và

0,1g axit sulfanilic trong 70ml nước cất nóng, thêm 3ml axit HCl , làm lạnh và bổ

sung nước cất đến thể tích cuối cùng là 100ml; dung dịch axit sunfuric: bổ sung

cẩn thận 500ml axit H2SO4 trong 125ml nước cất, làm lạnh ở nhiệt độ phòng;

dung dịch NaCl: hòa tan 300g NaCl trong 1000ml nước cất

Tiến hành: Thêm lần lượt 2ml dung dịch NaCl, 10ml dung dịch H2SO4 vào

cốc chịu nhiệt chứa 10 ml mẫu nghiên cứu, cốc được đặt trong giá ngâm trong bể

nước lạnh, bổ sung 0,5 ml thuốc thử brucine, chuyển giá đựng cốc thí nghiệm lên

bể nước nóng ở 95oC trong 20 phút, để nguội và đo độ hấp thụ màu ở A410

Lượng nitrat trong mẫu nghiên cứu tính được khi đối chiếu với đồ thị chuẩn sử

dụng dung dịch N-NO3- 1 mg/l

Lập đường chuẩn: Cách lập đường chuẩn dung dịch NO3- cũng tương tự

như phương pháp định lượng NO2

-g) Phương pháp xác định tổng chất rắn lơ lửng [20]

- Lấy một thể tích nhất định mẫu nước thải lọc qua giấy lọc (kích thước lỗ

0,45 µm) đã biết khối lượng Giấy lọc được sấy ở 105oC trong 2 giờ Để nguội

trong bình hút ẩm, cân giấy lọc

m2 : Khối lượng mẫu sau khi sấy ở 105oC (mg)

m1 : Khối lượng giấy lọc trước khi sấy (mg)

V thể tích mẫu được lọc (mL)

2.5.3 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn có khả năng nitrat

+ Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn có khả năng nitrit hóa

Phân lập vi khuẩn có khả năng nitrit hóa được tiến hành theo phương pháp

nghiên cứu của Qing-Ling Zhang và cộng sự (2011) Các mẫu nước thải được

pha loãng tới nồng độ nhất định và nuôi cấy trên môi trường rắn bao gồm dinh

dưỡng như là muối kali, magiê, vi lượng và nguồn cơ chất chứa nitơ (muối

amoni), sau đó thu những khuẩn lạc thuần khiết và nuôi cấy trên môi trường lỏng

chưa nguồn dinh dưỡng nitơ, tiếp theo kiểm tra khả năng nitrit hóa của các chủng

bằng thuốc thử griss

Mẫu nước thải được pha loãng theo phương pháp pha loãng thập phân và

pha loãng đến các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5 Sau đó, hút 100 µl dịch

mẫu đã pha loãng cho lên mặt thạch chứa môi trường HNM 1(heterotrophic

nitrifying medium, bock và cộng sự, 1983) và tiến hành chang đều, nuôi cấy

trong điều kiện nhiệt độ 30oC trong thời gian từ 3 đến 5 ngày Khuẩn lạc thuần

khiết được cấy chuyển sang bình tam giác có chứa môi trường HNM 1 lỏng và

nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ là 30oC, tốc độ lắc 150vòng/phút Sau 3 ngày nuôi

cấy, đem thử với thuốc thử Griess, nếu bình nào phản ứng với thuốc thử tạo màu

hồng thì được giữ lại để nghiên cứu tiếp

Thành phần môi trường HNM1 nuôi cấy chủng vi khuẩn bao gồm các thành

phần như dưới đây: (g/l) [60]

(NH4)2SO4 0,8

K2HPO4 3H2O 1,5 MgSO4.7H2O 0,2

Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng nitrat hóa được tiến hành tương tự

như phương pháp phân lập chủng vi khuẩn có khả năng nitrit hóa, nhưng môi

trường nuôi cấy vi khuẩn là môi trường HNM2 Khả năng chuyển hóa nitrit

thành nitrat của các chủng được đánh giá thông qua sự tăng nồng độ nitrat trong

môi nuôi cấy

Thành phần môi trường HNM 2 bao gồm các thành phần dưới đây : (g/l)

[60]