Phân lập và tuyển chọn các chủng loại nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao ở vĩnh phúc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH- KTNN _*** _ PHÙNG DŨNG MẠNH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO Ở VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT Người hướng dẫn khoa học TS PHƯƠNG PHÚ CÔNG HÀ NỘI - 2010 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, TS Phương Phú Công người trực tiếp tận tình hướng dẫn, bảo em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô tổ vi sinh vật học toàn thể thầy cô khoa Sinh - KTNN, trường ĐH Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu Cuối em xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ Em suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 05 năm 2010 Sinh viên Phùng Dũng Mạnh Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết thu khoá luận trung thực, chưa công bố công trình khoa học Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, tháng 05 năm 2010 Sinh Viên Phùng Dũng Mạnh Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU………… …………………… 1.1 Đại cương nấm mốc……………….…… ……………………… 1.2 Chi Aspergillus Micheli ex Fries……….………………………………6 1.2.1 Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus giới…………….6 1.2.2 Đặc điểm sinh học Aspergillus………………………………… 1.3 Sơ lược chi Penicillium……………………………………………12 1.4 Cellulose cellulase…………………………………………………14 1.4.1 Cellulose……………………………………………………… ……14 1.4.2 Cellulase…………………………………………………………… 15 1.4.3 Cơ chế tác động phức hệ cellulase…………………… .16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….18 2.1 Vật liệu nghiên cứu………………………………………………… 18 2.1.1 Mẫu phân lập……………………………………………………… 18 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất dung cho nghiên cứu………………… 18 2.2 Môi trường………………………………………………………….…18 2.3 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… .19 2.3.1 Phương pháp phân lập…………………………………………… 19 2.3.1.1 Thu thập mẫu………………………………………………… 19 2.3.1.2 Chuẩn bị môi trường phân lập bảo quản…………………….19 2.3.1.3 Tiến hành phân lập…………………………………………… 20 Khóa luận tốt nghiệp Phùng Dũng Mạnh - K32D 2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính……………………………………… 21 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu định loại (Maren A Klich, 2002)………21 2.3.3.1 Phương pháp cấy chấm điểm chủng nấm mốc lên môi trường Crapek-Dox sở để nghiên cứu đặc điểm vĩ mô………….21 2.3.3.2 Phương pháp cấy khối thạch để quan sát đặc điểm vi mô (Robert A Samson and Ellen S Hoekstra, Jens C Frisvad and Filtenborg, 1996)……………………………………………… 21 2.3.4 Phương pháp quan sát đặc điểm phân loại…………………….22 2.3.4.1 Quan sát đặc điểm vĩ mô sau mắt thường kính hiển vi soi nổi…………………………………………… 22 2.3.4.2 Quan sát xác định đặc điểm vi mô kính hiển vi quang học chụp ảnh qua kính hiển vi (Axioskop)………………….23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………… …………24 3.1 Kết phân lập………………………………………………………24 3.2 Kết thử hoạt tính………………………………………………….25 3.3 Kết định loại sơ bộ……………………………………………….27 3.3.1 Bản mô tả chủng M3……………………………………………… 27 3.3.2 Bản mô tả chủng M5-3………………………………………………29 3.3.3 Bản mô tả chủng M6-1………………………………………………31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………… 34 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng bọng đỉnh giá chi Aspergillus……………………… 10 Hình 1.2 Cấu tạo quan sinh bào tử trần Aspergillus………………… 11 Hình 1.3 Cấu tạo khuẩn ty quan sinh bào tử trần Penicillium… 13 Hình 1.4 Cấu trúc không gian lập thể cellulose……………………… 15 Hình 1.5 Sơ đồ phân giải cellulose theo Erikson CS (1974)…………….17 Hình 3.1 Hoạt tính cellulase chủng mạnh nhất……………………….26 Hình 3.2 Một số đặc điểm hình thái chủng M3……………………… 29 Hình 3.3 Một số đặc điểm hình thái chủng M5-3………………………31 Hình 3.4 Một số đặc điểm hình thái chủng M6-1………………………33 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các chủng nấm mốc phân lập được………………………………23 Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase chủng nấm mốc…………………… 25 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CBH Cellobiohydrolase CMC Cacboxyl methyl cellulose CMC-ase Cacboxymethylcellulase CS Cộng E1 Exoglucanase E2 Endoglucanase UV Tia cực tím Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nấm mốc vi sinh vật hiếu khí, nhân chuẩn, dị dưỡng, chúng thường có mặt đất, xác động thực vật không khí, số ký sinh động thực vật người Một số nấm mốc tác nhân gây bệnh, làm hư hỏng sản phẩm công, nông nghiệp có nhiều loài có ích tổng hợp enzyme, axit hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, kích thích tố tăng trưởng động thực vật ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông nghiệp Cellulase phức hệ enzyme thủy phân cellulose, tổng hợp chủ yếu vi sinh vật, có nấm mốc Cellulase ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực, tương lai người ta sử dụng cellulase nhằm hai mục đích chính: thứ dùng cellulase trực tiếp để phân hủy phế thải công, nông nghiệp có thành phần chủ yếu cellulose công nghệ môi trường, thứ hai thuỷ phân cellulose tạo chất lên men để thu sản phẩm cuối khác Đặc biệt chăn nuôi, biện pháp nâng cao suất vật nuôi nâng cao hiệu suất sử dụng chất dinh dưỡng có thức ăn mức cao Để giải vấn đề này, người ta dùng chế phẩm enzyme (gồm nhiều loại enzyme gọi multi-enzyme, có cellulase) để bổ sung vào phần thức ăn vật nuôi Các enzyme với enzyme có sẵn đường tiêu hóa phân giải chất dinh dưỡng thức ăn giúp cho vật tiêu hóa tốt Việc bổ sung chế phẩm gồm nhiều loại enzyme giúp vật nuôi hấp thụ tốt nguồn thức ăn khác Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Hàng năm, hoạt động ngành nông nghiệp thải môi trường hàng trăm ngàn phế phẩm có thành phần chủ yếu cellulose, nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Nếu lượng phế phẩm xử lý làm thức ăn gia súc phân bón nguồn lợi lớn mặt kinh tế, đồng thời lại giải vấn đề ô nhiễm môi trường Trên giới Việt Nam, có nhiều nghiên cứu cellulose ứng dụng thức ăn chăn nuôi như: Chu Thị Thanh Bình CS (2002) ứng dụng chủng nấm men chế biến bã thải hoa giàu cellulose làm thức ăn gia súc Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1991) lên men xốp sắn cách sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò kết cho nhiều triển vọng Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu tập trung vào chủng nấm mốc phân giải cellulose, nguyên nhân tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật tỏ ưu so với nấm mốc khả sinh cellulase Nhưng xét khả chống chịu pH, khả sử dụng nguồn cacbon, nguồn nitơ nấm mốc tỏ ưu so với nhóm vi sinh vật khác Từ lý do, với mục đích tìm hiểu, làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học, chọn đề tài “Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh cellulase cao Vĩnh Phúc” để nghiên cứu Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả tổng hợp cellulase Bước đầu phân loại sơ số chủng có hoạt tính cellulase cao Ý nghĩa đề tài Bước đầu tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính enzyme cellulase cao, cung cấp nguồn giống vi sinh vật phục vụ cho nghiên cứu khác sâu vào ứng dụng, hứa hẹn cho nhiều ứng dụng thực tiễn Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng nấm mốc Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, số dạng sinh sản vô tính nhóm nấm túi (Ascomycetes) nhóm nấm đảm (Basidiomycetes) Deuteromycota bao gồm khoảng 2400 chi có 1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes 700 chi thuộc nhóm Coelomycetes Theo E Kiffer, M Morelet, 2000, số chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycotina) chi Penicillium có số loài nhiều khoảng 223 loài, chi Aspergillus có khoảng 185 loài Deutermycota với nấm túi (Ascomycetes), nấm đảm (Basidiomycetes) xếp vào nhóm nấm bậc cao (Michael J Carlile et al 2001) Chúng sinh vật nhân chuẩn, dị dưỡng, phần lớn sống hoại sinh (saprophytism), số kí sinh (parasitism) người động thực vật, số khác cộng sinh (symbiosis) Thành tế bào có kitin, hệ sợi (mycelium) tản phát triển mạnh dạng sợi có vách ngăn, nhân thể đơn bội, lưỡng bội, thể song nhân, sinh sản bào tử (bào tử roi) Theo quan điểm nhà nấm học nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes) nhóm nấm bao gồm nấm túi nấm đảm khả sinh sản hữu tính (telemorph), hình thức sinh sản vô tính (anamorph) gọi chung nhóm Mitosporic fungi (Michael J Carlie, Sarah C Watkinson, Graham, 1994; Noyd R.K, 2000) Ở nấm túi (Ascomycetes) nấm đảm (Basidiomycetes), trình sinh sản hữu tính xảy giai đoạn vòng đời gọi giai đoạn hoàn thiện (perfect stage) hay dạng sinh sản hữu tính (telemorph) Ngược lại đặc trưng nấm bất toàn Deuteromycetes hình thức sinh sản vô tính Các bào tử trần vô tính (conidia hay mitotic spores) sinh trình Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp - Chuẩn bị hộp lồng, lam kính, lamen, ướt, khoan nút chai vô trùng - Đổ môi trường định loại nghiên cứu vào hộp lồng cho độ dày đạt gần mm, dùng khoan nút chai khoan lấy khối thạch - Đặt khối thạch điểm cách lam kính - Cấy bào tử vào khối thạch - Đậy lamen lên khối thạch - Đặt ướt vô trùng vào để giữ ẩm cho mẫu Sau cấy xong dùng kính hiển vi theo dõi ngày phát triển hệ sợi, hạch nấm 2.3.4 Phƣơng pháp quan sát đặc điểm phân loại 2.3.4.1 Quan sát đặc điểm vĩ mô sau mắt thƣờng dƣới kính hiển vi soi - Màu sắc bào tử (conidial color): màu sắc nấm, đặc điểm quan trọng để phân loại đến mức chi phụ - Đường kính khuẩn lạc (colony diameter): kích thước lớn khuẩn lạc nuôi hộp lồng - Màu sắc hệ sợi (mycelial color): thường có màu trắng số loài có màu khác - Dịch tiết bề mặt hệ sợi (exudate): giọt lỏng nhỏ, hình thành bề mặt hệ sợi 22 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp - Màu mặt sau khuẩn lạc (reverse color): màu sắc quan sát phía khuẩn lạc cách nhìn từ phía đĩa thạch Màu sắc thường phụ thuộc vào môi trường - Sắc tố hòa tan (Soluble pigment): sắc tố khuếch tán vào agar theo viền khuẩn lạc - Hạch nấm (Sclerotia): khối cứng gồm sợi nấm, thường hình cầu, gần cầu elip, không chứa bào tử - Thể (cleistothecia): thể không tự mở, chứa túi bào tử mà bên bào tử túi 2.3.4.2 Quan sát xác định đặc điểm vi mô dƣới kính hiển vi quang học chụp ảnh qua kính hiển vi (Axioskop) - Giá bào tử trần (conidiophore, tipe): xác định chiều dài, màu sắc cấu trúc bề mặt giá bào tử trần, đặc điểm quan trọng để phân loại - Bọng đỉnh giá (versicle): đỉnh phồng lên cuống bào tử nấm Quan sát hình dạng đo kích thước - Các lớp thể bình (Seriation): quan sát số tầng thể bình - Bào tử trần (conidia): hình thái, kích thước cấu trúc bề mặt đặc điểm quan trọng - Bông nấm (conidial head): quan sát hình dạng nấm - Tế bào Hulle: thành dày, có tính khúc xạ cao - Bào tử túi: màu sắc, kích thước, cách trang trí bào tử túi, bao gồm gờ nổi, đường rãnh bao xung quanh bào tử túi cấu trúc bề mặt thành lồi 23 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập Từ mẫu thu thập tiến hành phân lập môi trường Crapek- Dox sở đến ngày thu 30 chủng nấm mốc Kết phân lập trình bày cụ thể bảng bảng 3.1 Bảng 3.1 Các chủng nấm mốc phân lập STT Mẫu Chủng mốc 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 1 2 3 3 4 5 6 6 7 8 9 M1-1 M1-2 M1-3 M1-4 M2-1 M2-2 M2-3 M3 M3-2 M3-3 M3-6 M4-1 M4-2 M4-3 M5-1 M5-3 M5-6 M6-1 M6-2 M6-3 M6-4 M7-1 M7-2 M7-3 M8-1 M8-2 M8-3 M9-1 M9-2 M9-3 Đặc điểm chủng Mầu khuẩn lạc Thời gian xuất Đen ngày Nâu nhạt ngày Nâu đậm ngày Xanh rêu ngày Đen ngày Đen ngày Xám ngày Xanh lục ngày Nâu đậm ngày Xanh đen ngày Đen ngày Xanh rêu ngày Trắng ngày Vàng nhạt ngày Xanh rêu ngày Vàng hoa cau ngày Vàng hoa cau ngày Đen nâu ngày Nâu ngày Xám ngày Xám xanh ngày Trắng ngày Xanh rêu ngày Nâu đậm ngày Nâu ngày Nâu nhạt ngày Vàng nhạt ngày Nâu ngày Trắng mịn ngày Xanh đen ngày 24 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Mỗi mẫu phân lập thu từ đến chủng nấm mốc có hình thái khuẩn lạc khác Các khuẩn lạc chủng chủ yếu xuất sau đến ngày, số xuất sau ngày nuôi cấy Trên môi trường Crapek-Dox, nấm mốc, xạ khuẩn số vi khuẩn mọc Nhưng ta phân biệt rõ ràng khuẩn lạc nấm mốc với khuẩn lạc vi khuẩn xạ khuẩn: khuẩn lạc nấm mốc thường dạng xốp kích thức sợi nấm to hơn, phát triển nhanh to nhiều lần so với khuẩn lạc xạ khuẩn vi khuẩn; khuẩn lạc vi khuẩn thường nhày, ướt nhắn; khuẩn lạc xạ khuẩn bông, xốp, khô, rắn chắc, xù xì, trường hợp hệ sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo Kết thể bảng 3.1 cho thấy chủng nấm mốc Vĩnh Phúc đa dạng, có tiềm cho nhiều ứng dụng thực tế sản xuất enzyme, sản xuất kháng sinh, xử lý rác thải,… 3.2 Kết thử hoạt tính Mục tiêu đề tài tuyển chọn chủng nấm có khả sinh cellulase phân hủy cellulose nên tiến hành thử hoạt tính môi trường Crapek-Dox thay nguồn chất CMC theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch: dùng khoan nút chai, khoan lỗ môi trường thử hoạt tính (môi trường thạch chứa 1% CMC) Nhỏ vào lỗ khoan dung dịch enzyme thu sau nuôi cấy chìm Để tủ lạnh 6-8 cho enzyme khuếch tán vào môi trường thạch sau cho vào tủ ấm 320C 24giờ Hiện hình vòng phân giải dung dịch thuốc thử liugon đỏ 1% Hoạt tính enzyme xác định hiệu số D - d (mm) Trong D: đường kính vòng phân giải; d: đường kính lỗ đục Kết chi tiết trình bày cụ thể bảng 3.2 25 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase chủng nấm mốc STT 10 11 12 13 14 15 Chủng mốc M1-1 M1-2 M1-3 M1-4 M2-1 M2-2 M2-3 M3 M3-2 M3-3 M3-6 M4-1 M4-2 M4-3 M5-1 Hoạt tính cellulase STT (D-d, mm) 16 13 17 18 11 19 20 12 21 22 22 23 10 24 12 25 11 26 10 27 28 29 30 Chủng mốc M5-3 M5-6 M6-1 M6-2 M6-3 M6-4 M7-1 M7-2 M7-3 M8-1 M8-2 M8-3 M9-1 M9-2 M9-3 Hoạt tính cellulase (D-d, mm) 20 13 18 11 10 13 15 12 13 14 Kết bảng 3.2 cho thấy tất 30 chủng nấm mốc phân lập có hoạt tính cellulase Trong đó, có 12 chủng có hoạt tính nhỏ 10 mm, 15 chủng có hoạt tính từ 10 – 15 mm chủng có hoạt tính lớn 15 mm chủng M3 (22 mm), M5-3 (20 mm), M6-1 (18 mm) M3 M5-3 M6-1 Hình 3.1 Hoạt tính cellulase chủng mạnh 26 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Sau xác định chủng M3, M5-3 M6-1 có hoạt tính cellulase cao với hoạt tính 22 mm, 20 mm 18mm, so sánh hoạt tính chủng với kết nghiên cứu khác công bố thấy chủng có hoạt tính cellulase tương đối mạnh nên định chọn chủng M3, M5-3 M6-1 để nghiên cứu định loại 3.3 Kết định loại sơ 3.3.1 Bản mô tả chủng M3 Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A Klich, 2002), bước đầu xác định chủng M3 thuộc chi Penicillium có đặc điểm hình thái giống với đặc điểm hình thái chi Penicillium khóa phân loại Samson CS (1995) Những đặc điểm hình thái chủng M3 miêu tả cụ thể sau: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: - Đường kính khuẩn lạc (mm) môi trường Crapek-Dox sở: 30 mm sau ngày nuôi cấy - Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: khuẩn lạc có màu xanh lục giữa, rìa màu xám xanh - Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc: có màu nâu tối, không nhăn Cấu tạo quan sinh sản vô tính: - Giá bào tử trần (conidiophore, tipe): chia nhánh, dạng mảnh, nhăn - Bông nấm (conidial head): hình chổi - Bọng đỉnh giá (vesicle): hình đế, bàn chang - Các lớp thể bình (seriation): lưỡng tầng 27 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp - Bào tử trần (conidia): có hình ovan, cầu, bề mặt ráp Mặt trước khuẩn lạc Mặt sau khuẩn lạc Bông nấm (X10) Bông nấm (X40) Bọng đỉnh giá (X100) Bọng đỉnh giá (X100) 28 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Bào tử (X40) Bào tử (X100) Hình 3.2 Một số đặc điểm hình thái chủng M3 3.3.2 Bản mô tả chủng M5-3 Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A Klich, 2002), bước đầu xác định chủng M5-3 thuộc chi Aspergillus chủng có đặc điểm hình thái giống với đặc điểm hình thái chi Aspergillus khóa phân loại Raper & Fennell (1965) Những đặc điểm hình thái chủng M5-3 miêu tả cụ thể sau: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: - Đường kính khuẩn lạc (mm) môi trường Crapek-Dox sở: 40 mm sau ngày nuôi cấy - Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: bào tử màu vàng hoa cau, vàng tươi, rìa khuẩn lạc có màu vàng xanh, hệ sợi khí sinh từ trắng đến vàng nhạt - Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc: màu vàng tối, không nhăn Cấu tạo quan sinh sản vô tính: 29 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp - Giá bào tử trần (conidiophore, tipe): không phân nhánh, ráp, thành dày - Bông nấm (conidial head): hình bán cầu, gần cầu - Bọng đỉnh giá (versicle): hình bán cầu, hình cầu - Các lớp thể bình (seriation): đơn tầng bao phủ 70-90% - Bào tử trần (conidia): hình cầu Mặt trước khuẩn lạc Mặt sau khuẩn lạc Bông nấm (X10) Bông nấm (X40) 30 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Bọng đỉnh giá (X100) Bọng đỉnh giá (X100) Bào tử (X40) Bào tử (X100) Hình 3.3 Một số đặc điểm hình thái chủng M5-3 3.3.3 Bản mô tả chủng M6-1 Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A Klich, 2002), bước đầu xác định đặc điểm hình thái chủng M6-1, chủng có nhiều đặc điểm giống với nhóm loài Apergillus niger (theo khóa phân loại Raper & Fennell, 1965) Do xác định chủng M6-1 thuộc nhóm loài Apergillus niger, nhóm loài xếp vào danh mục sinh vật an toàn Đặc điểm chủng M6-1 miêu tả cụ thể sau: 31 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: - Đường kính khuẩn lạc (mm) môi trường Crapek-Dox sở: 55 mm sau ngày nuôi cấy - Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: bào tử màu đen nâu, có vòng trắng ngăn cách phần khuẩn lạc với phần rìa khuẩn lạc - Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc: màu cam, nâu, nhẵn Cấu tạo quan sinh sản vô tính: - Giá bào tử trần (conidiophore, tipe): không phân nhánh, nhẵn, thẳng dày - Bông nấm (conidial head): hình cầu - Bọng đỉnh giá (versicle): dạng cầu, bán cầu - Các lớp thể bình (seriation): đơn tầng, bao phủ 50-80% - Bào tử trần (conidia): đa số hình ovan elip, số hình cầu Mặt trước khuẩn lạc Mặt sau khuẩn lạc 32 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Bông nấm (X10) Bông nấm (X40) Bọng đỉnh giá (X100) Bọng đỉnh giá (X100) Bào tử (X40) Bào tử (X100) Hình 3.4 Một số đặc điểm hình thái chủng M6-1 33 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN Các kết thu đáp ứng mục tiêu nghiên cứu ban đầu đề tài: Từ mẫu rác thải, cành gỗ, cây, rơm mục, đất mùn lấy vùng Yên Lạc, Xuân Hòa (Phúc Yên) thành phố Vĩnh Yên tỉnh Vĩnh Phúc, phân lập 30 chủng nấm mốc, tất 30 chủng nấm mốc có khả tổng hợp cellulase phân giải cellulose Kết cho thấy chủng nấm mốc có khả sinh cellulase Vĩnh Phúc đa dạng, có tiềm cho nhiều ứng dụng thực tiễn Trong 30 chủng có hoạt tính cellulase có chủng M3, M5-3 M6-1 có hoạt tính cellulase cao nhất, hoạt tính chủng 22 mm, 20 mm 18 mm Đã bước đầu định loại sơ chủng M3, M5-3 M6-1 Trong chủng M3 thuộc chi Penicillium, chủng M5-3 M6-1 thuộc chi Aspergillus Riêng chủng M6-1 nghiên cứu sâu định loại đến loài, theo chủng M6-1 thuộc nhóm loài Aspergillus niger loài thuộc danh mục sinh vật an toàn, hứa hẹn cho nhiều ứng dụng thực tế phục vụ cho đời sống KIẾN NGHỊ Các chủng phân loại sơ dựa vào hình thái chủ yếu Để phân loại cách xác chủng nấm cần phải kết hợp thêm phương pháp phân loại kỹ thuật sinh học phân tử Ba chủng M3, M5-3 M6-1 có hoạt tính cellulase tương đối mạnh nên cần có nghiên cứu để đánh giá hết tiềm ứng dụng chủng này, đặc biệt chủng M6-1 thuộc loài Apergillus niger loài thuộc danh mục sinh vật an toàn 34 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TẾNG VIỆT [1] Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, (2001) Vi nấm dùng công nghệ sinh học, NXB KH & KT Hà Nội, trang: 13-16, 154-168 [2] Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lương Thùy Dương “Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm men có khả phân giải cellulose nhằm ứng dụng xử lý bã thải hoa làm thức ăn chăn nuôi” [3] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Văn Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học Nxb Khoa học Kĩ thuật 325 – 378 [4] Nguyễn Thị Mai Hoa (2004) “Nghiên cứu phân loại chủng thuộc chi Aspergillus phân lập từ rừng ngập mặn Nam Định Thái Bình” Luận văn thạc sĩ sinh học [5] Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sĩ Lê Thanh (2007) “Tuyển chọn nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng penicillium SP DTQ-HK1” Tạp chí Công nghệ Sinh học (3): 355 – 362 TIẾNG ANH [6] B Botton A Breton M Fevres Gauthier Ph Guy, (1990), Moisissures Utiles et Nuisibles Importance Industrielle, 2nd edition, Masson, Paris Milan Barcelone Mexico, p: 84, 101, 103, 109, 112, 118 [7] James M Jay, (1996), Modern Food Microbiology, International Thomson Publishing, p: 26,27 [8] Kiffer E., M Morelet, (2000), The Deuteromycetes (Mitosporic Fungi), Science Publishers TNC, U.S.A., 115pp [9] Maren A Klich, 2002 Identification of Common Aspergillus Species, Published by the Centralbureau voor Schimmelcultues, Utrecht, The Nethrlands, 107 pp 35 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp [10] Mc Kenzie Erick H.C., (2004), Fungal Taxonomy Workshop, Landcare Research Private Bag 92170 Auckland New Zealand, p 3,6 [11] Michael J.Carlie, Sarah C Watkinson, Graham W Gooday, (1994), The fungi, Academic presss, p 68,70 [12] Noyd R.K., (2002), Mycology Reference Card, The American Phytopathological Society 3340 Pilot Knob Road St Paul, Minnesota 551212079, USA, 18pp [13] Raper Fennell (1965) The Genus Aspergillus, The williiams & Wikins Company 428 E Preston street Baltimore, Md 21202 U.S.A, 570pp [14] Robert A, Samson, (1999), The Genus Aspergillus with Special Regard the Aspergillus fumigatus Group, in: “Contributions to Microbiology”, vol.2: p [15] Robert A Samson and Ellen S.Hoekstra, Jens C Frisvad and Filtenborg (1996) Introductrion to Food-borne Fungi, Centraalbureau voor Schimmelcultues Baarn Delft, Pg : 3, 4, 52-83 [16] Robert A Samson, John I Pitt (2000) Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification, p: 83- 113 [17] Tsuneo Watanabe, 2002 Soil and Seed Fungi, CRC Prees, P: 190-196 36 [...]... trường hợp không có hệ sợi khí sinh thì khuẩn lạc có dạng màng dẻo Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 cho thấy các chủng nấm mốc ở Vĩnh Phúc khá là đa dạng, có tiềm năng cho nhiều ứng dụng thực tế như sản xuất enzyme, sản xuất kháng sinh, xử lý rác thải,… 3.2 Kết quả thử hoạt tính Mục tiêu của đề tài là tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh cellulase phân hủy cellulose nên tôi tiến hành thử hoạt tính... M9-2 M9-3 Hoạt tính cellulase (D-d, mm) 20 13 18 11 10 6 7 13 15 5 6 7 12 13 14 Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy tất cả 30 chủng nấm mốc phân lập đều có hoạt tính cellulase Trong đó, có 12 chủng có hoạt tính nhỏ hơn 10 mm, 15 chủng có hoạt tính từ 10 – 15 mm và 3 chủng có hoạt tính lớn hơn 15 mm là chủng M3 (22 mm), M5-3 (20 mm), M6-1 (18 mm) M3 M5-3 M6-1 Hình 3.1 Hoạt tính cellulase của 3 chủng mạnh nhất 26... định được 3 chủng M3, M5-3 và M6-1 là có hoạt tính cellulase cao nhất với hoạt tính lần lượt là 22 mm, 20 mm và 18mm, tôi so sánh hoạt tính của 3 chủng này với các kết quả của các nghiên cứu khác đã được công bố và thấy rằng 3 chủng này có hoạt tính cellulase tương đối mạnh nên tôi quyết định chọn 3 chủng M3, M5-3 và M6-1 để nghiên cứu định loại 3.3 Kết quả định loại sơ bộ 3.3.1 Bản mô tả chủng M3 Bằng... hình thành từ các sợi nấm kết lại hoặc từ các mô thực vật kết hợp với sợi nấm ở những loài kí sinh trên thực vật Phân loại lớp Coelomycetes dựa vào hình thái bào tử và thể quả đồng thời dựa vào phương pháp hình thành bào tử và giá bào tử trần Agonomycetes (mycelia sterilia – nấm bất thụ): Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử Một số tạo thành cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo... ta có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc của nấm mốc với các khuẩn lạc của vi khuẩn và xạ khuẩn: khuẩn lạc của nấm mốc thường dạng xốp hơn do kích thức sợi nấm to hơn, phát triển nhanh hơn và to hơn nhiều lần so với các khuẩn lạc của xạ khuẩn và vi khuẩn; khuẩn lạc vi khuẩn thường nhày, ướt và nhắn; khuẩn lạc của xạ khuẩn thì bông, xốp, khô, rắn chắc, xù xì, những trường hợp không có hệ sợi khí sinh. .. dạng của toàn bộ bông nấm cũng là những đặc điểm phân loại đáng chú ý Hình dạng bông nấm có thể là hình cầu chặt hoặc lỏng, hoặc hình phóng xạ, có thể là hình cột thẳng đứng, chặt, có thể là phân thành các thùy khác nhau (Botton B, Breton A, 1990; Raper & Fennell, 1965) Một số loài Aspergillus có khả năng tạo ra nhiều tế bào có thành dày gọi là tế bào Hulle (hình 1.2: c) và các hạch nấm (sclerotium) Hình1.2... trong các khóa phân loại của mình E Kifer & N Morelet, Robert K Noyd (2000) đã kết hợp khóa phân loại của Saccardo (1880-1884) và Grove (1919) để phân chia Deuteromycota thành 2 lớp lớn là Hyphomycetes và Coelomycetes dựa vào cách sắp xếp của các giá bào tử trần - Lớp Hyphomycetes: đặc trưng bởi các giá bào tử trần (conidiophores) tạo ra trên sợi nấm, không tạo thể quả vô tính - Lớp Coelomycetes: các. .. pháp phân lập 2.3.1.1 Thu thập mẫu Lấy các cành, lá cây mục, rơm rạ mục, đất mùn và rác thải ở những nơi khô ráo, mỗi loại mẫu lấy khoảng 20 gam mỗi lần, tiến hành lấy ở các vùng khác nhau Mẫu sau khi lấy sẽ được cho vào túi nilon rồi đánh dấu và ghi đầy đủ thông tin về thời gian và địa điểm mẫu được lấy Các mẫu sau khi được thu thập cần phải được tiến hành phân lập ngay 2.3.1.2 Chuẩn bị môi trƣờng phân. .. 3.1 Kết quả phân lập Từ 9 mẫu thu thập được tôi tiến hành phân lập trên môi trường Crapek- Dox cơ sở trong 2 đến 4 ngày đã thu được 30 chủng nấm mốc Kết quả phân lập được trình bày cụ thể ở bảng ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Các chủng nấm mốc phân lập được STT Mẫu Chủng mốc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 6 7 7 7 8 8 8 9... nhạt 3 ngày Vàng nhạt 3 ngày Nâu 4 ngày Trắng mịn 3 ngày Xanh đen 4 ngày 24 Phùng Dũng Mạnh - K32D Khóa luận tốt nghiệp Mỗi mẫu phân lập đều thu được từ 3 đến 4 chủng nấm mốc có hình thái khuẩn lạc khác nhau Các khuẩn lạc của các chủng này chủ yếu xuất hiện sau 2 đến 3 ngày, một số ít xuất hiện sau 4 ngày nuôi cấy Trên môi trường Crapek-Dox, cả nấm mốc, xạ khuẩn và một số vi khuẩn đều có thể mọc được ... học, chọn đề tài Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh cellulase cao Vĩnh Phúc để nghiên cứu Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả tổng hợp cellulase Bước đầu phân loại. .. nấm mốc, tất 30 chủng nấm mốc có khả tổng hợp cellulase phân giải cellulose Kết cho thấy chủng nấm mốc có khả sinh cellulase Vĩnh Phúc đa dạng, có tiềm cho nhiều ứng dụng thực tiễn Trong 30 chủng. .. NGHỊ Các chủng phân loại sơ dựa vào hình thái chủ yếu Để phân loại cách xác chủng nấm cần phải kết hợp thêm phương pháp phân loại kỹ thuật sinh học phân tử Ba chủng M3, M5-3 M6-1 có hoạt tính cellulase