Phân lập tuyển chọn các chủng của bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi

Kết quả các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis...34 Hình 4.3 : Vòng phân giải casein của chủng KTB2, KTB4, KTC1...36 Hình 4.4 : Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của thời gian nuôi

Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis 5

Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 15

Bảng 3.3: Thành phần môi trường MPA dạng thạch 16

Bảng 3.4: Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease [19],[30] 16

Bảng 3.5: Môi trường thử hoạt tính của enzyme protease [24] 16

Bảng 3.6: Môi trường lên men đường maltose 16

Bảng 3.7: Môi trường Simmons Citrate Agar 17

Bảng 3.8: Môi trường khử nitrate 17

Bảng 3.9: Môi trường lòng đỏ trứng 17

Bảng 3.10: Môi trường Clark Lubs 18

Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28

Bảng 4.2: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập 33

Bảng 4.3 : Kết quả đo bán kính vòng phân giải casein của 10 chủng vi khuẩn phân lập (mm) 36

Bảng 4.4 : Kết quả đo tốc độ sinh trưởng và hoạt độ protease của 3 chủng 37

Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn KTC1 38

Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KTC1 40

tổng hợp enzyme protease của KTC1 41

Hình 2 1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 3

Hình 4.1 : Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 26

Hình 4 1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn phân lập được 32

Hình 4.2 Kết quả các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis 34

Hình 4.3 : Vòng phân giải casein của chủng KTB2, KTB4, KTC1 36

Hình 4.4 : Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn KTC1 39

Hình 4.5: Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KTC1 40

Hình 4.6: Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của KTC1 42

THUẬT NGỮ VIẾT TẮT DIỄN GIẢI

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện 3

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái 4

2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.1.5 Đặc điểm sinh hoá 5

2.1.6 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 5

2.2 Giới thiệu về enzyme protease 6

2.2.1 Tổng quan về enzyme Protease 6

2.2.2 Phân loại và đặc điểm của protease 7

2.2.3 Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 8

2.2.4 Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật 9

2.2.5 những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease từ Bacillus nói chung và Bacillus subtilis nói riêng 12

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Đối tượng khảo sát 14

3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 14

3.2.1 Thời gian : 23/12/2013 – 31/5/2014 14

3.2.2 Địa điểm 14

3.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 14

3.3.1 Hóa chất 14

3.3.2 Thiết bị và dụng cụ 14

3.3.3 Môi trường sử dụng 15

3.5.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 19

3.5.2 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao 23 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzyme của các chủng vi khuẩn 27

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28

4.1.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 32

4.2 Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease 35

4.2.1 Kết quả khảo sát vòng phân giải của 10 chủng phân lập được 35

4.2.2 Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của 3 chủng KTB2, KTB4, KTC1 37

4.3 Kết quả nghiên cứu các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme prorease của vi khuẩn KTC1 38

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của chủng vi khuẩn KTC1 38

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của chủng vi khuẩn KTC1 39

4.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzyme của chủng vi khuẩn KTC1 41

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học

đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn Càng ngày đời sống vật chấtcàng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi những nhàsản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu cầu củangười tiêu dùng Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chănnuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người tahạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thaythế thuốc kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học Chế phẩm sinh học là một dạngthức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật thông qua việc cảitiến cân bằng vi sinh vật đường ruột Tác dụng của chế phẩm sinh học là làm tăngkhả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme, tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ởmanh tràng và đại tràng, trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất cóđộc tính (Lã văn kính, 1998) [7] Protease là nhóm enzyme được sử dụng rộng rãitrong chế phẩm sinh học Người ta có thể thu enzyme protease từ nhiều nguồn khácnhau như động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy nhiên thu enzyme từ cơ thể động vậthay thực vật thì rất khó khăn và tốn kém vì thường phải phá bỏ tổ chức để thuenzyme và quá trình bảo quản rất phức tạp Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là

vi khuẩn có chứa rất nhiều loại enzyme có hoạt tính cao Chúng lại có khả năngchuyển hóa các chất và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lạithường rẻ tiền, người ta có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzyme từ các nguồnnguyên liệu khác nhau hẳn [12]

Vì vậy vi sinh vật là nguồn thu enzyme rất tiềm năng Trong các nguồn thuprotease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu protease từ vi khuẩn

Bacillus subtilis vì loài vi khuẩn này rất phổ biến dễ phân lập, thu enzyme và enzyme

thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn(Nguyễn Thị Hiền và cs 2004) [7]

Từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Phân lập tuyển

chọn các chủng của Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi”.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn được các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh

protease làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi

1.3 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học

Phân lập được loài vi khuẩn Bacilussubtilis từ đất, tuyển chọn được chủng có

khả năng sinh protease Biết và hiểu rõ hơn về các thoa tác kĩ thuật cũng như các thông

số quy trình công nghệ trong quá trình thực hiện đề tài

- Ý nghĩa thực tiễn

+ Làm tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học, đáp ứng yêu cầu càng caocủa ngành chăn nuôi

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ

chức y học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ chocác binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 -

1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis.

Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột,viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn này đãtrở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm [9]

2.1.2 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis

- Đặc điểm phân loại:

Theo Vũ Thị Thứ, (1996) [19] Bacillus subtilis thuộc:

Bộ: Eubacteriales

Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis

Hình 2 1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

http://www.isciencemag.co.uk/blog/tasty-humans/attachment/bacillus-subtilis/

- Đặc điểm phân bố:

Vi khuẩn Bacillus subtilis được phân bố hầu hết trong tự nhiên Phần lớn

chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/

g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus

subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử

và tế bào Bacillus subtilis [19].

2.1.3 Đặc điểm hình thái

- Đặc điểm hình thái tế bào

Bacillus subtilis là trực khuẩn, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0,5

-0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng diđộng, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa

tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứtcủa bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tiaphóng xạ [1]

- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Trên môi trường thạch đĩa MPA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều,

có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhănnheo, màu hơi nâu

Trên môi trường thạch nghiêng MPA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăngợn sóng

Trên môi trường gelatin: khuẩn lạc phát triển và làm tan chảy gelatin

Trên thạch khoai tây: khuẩn lạc phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt

Trên môi trường canh MPA: khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển

làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lênkhó tan đều [1]

2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu

trong môi trường thiếu oxy Chúng phát triển tốt trên môi trường MPA với nhiệt độtối ưu là 37 oC, pH = 7,0 - 7,4 [19]

2.1.5 Đặc điểm sinh hoá

Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,saccharose, xylose, arabinose Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+),catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+)

Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis

(Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005)[9]

2.1.6 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.6.1 Cấu tạo bào tử

Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ Vỏ bào tử cónhiều lớp Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và cácchất hoà tan trong nước Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng làmột khối tế bào chất đồng nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổichất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm Bào tử khác tế bàodinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý [1]

2.1.6.2 Khả năng tạo bào tử

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào

tử trong những điều kiện nhất định Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử

theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinhdưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) [1]

Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng Tế bào chất và nhân tậptrung tại một vị trí nhất định trong tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạothành tiền bào tử (Prospore) Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớpmàng Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bàodinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ Khi gặp điềukiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ

và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ramột bào tử [1]

2.2 Giới thiệu về enzyme protease

2.2.1 Tổng quan về enzyme Protease

Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tửprotein giải phóng các acid amin, pepton hoặc ditripepton

Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liênkết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng làcác axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este vàvận chuyển axit amin Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chứcnăng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiềuđối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) vàđộng vật (gan, dạ dày bê…) So với protease động vật và thực vật protease vi sinhvật có những đặc điểm rất khác biệt Trước hết hệ enzyme protease của vi sinh vật

là 1 hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khốilượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng đồng nhất Cũng do đónên protease visinh vật thường có tính đặc hiệu cao, cho sản phẩm thủy phân triệt

để và đa dạng [2]

2.2.2 Phân loại và đặc điểm của protease

Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptid CO-NH của phân tử protein và peptid thành các axit amin tự do và một ít peptid khối lượng phân tử nhỏ [12]

Theo kết quả nghiên cứu trên các protease từ 1950 đến nay cho thấy cácprotease của mỗi loài sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất Hiện nay có nhiềucách gọi tên và phân loại nhóm của protease, và được thay đổi qua nhiều thời kì

2.2.2.1 Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này được chia thành 4 phân nhóm phụ

- Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptid ở đầu Nitơ củamạch polypeptid

- Cacboxypeptidase: xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon củamạch polypeptid

- Dipeptihydrolase: xúc tác cho việc thuỷ phân các liên kết dipeptid

- Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch

2.2.2.2 Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzyme

Theo Nguyễn Đức Lượng và cs (2004)[12], protease được chia thành 4 nhómnhỏ, tên của các nhóm này gồm tên của các axit amin quan trọng nhất có vai trò xúctác trong trung tâm hoạt động của enzyme

- Protease serine (EC 3.4.21.): là những protease có nhóm (-OH) của serinetrong trung tâm hoạt động Các protein serine này thường hoạt động ở vùng pHkiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng

- Protease cystein ( EC 3.4.22.): là các protein có nhóm thiol (-SH) của axitamin cystein ở trung tâm hoạt động Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trungtâm hoạt động của enzyme, vì nó có khả năng tham gia phản ứng cao, tham gianhiều biến đổi hoá học

- Protease aspartic (EC 3.4.23.) : là những protease chứa nhóm (-COOH) trongtrung tâm hoạt động Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng PH là axit, bị ứcchế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các

axit amin có vòng thơm hoặc axit amin kị nước ởcảhai phía của liên kết peptit bịthủy phân

- Protease kim loại (EC 3.4.24.): Là những protease mà trong trung tâm hoạtđộng của chúng có những ion kim loại Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng

pH trung tính

2.2.2.3 Phân loại theo pH tác dụng tối ưu của protease

Theo Nguyễn Đức Lượng và cs (2004) [12], dựa vào pH hoạt động của cácprotease người ta chia protease ra thành 3 loại:

- Protease acid: hoạt động trong khoảng 3-3,8

- Protease base: hoạt động trong khoảng 8,5-8,9

- Protease trung tính

Tuy nhiên, tác động tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của Cơchất vì cùng một loại protease của một chủng vi khuẩn, khi thủy phân casein,hemiglobin, gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau

2.2.3 Chức năng sinh học của protease vi sinh vật

Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật cóthể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật

Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác cótrong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào

Theo Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005 [15], các protease nội bào có thể có vai tròquan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau:Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid amin đểtổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn Cacbon, nito, lưu huỳnh.Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này cóthể có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật

Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide

đã được tổng hợp Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các

protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá trìnhsinh trưởng của vi sinh vật.

2.2.4 Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật

Khác với protease của thực vật và động vật, protease của vi sinh vật là nhữngenzyme ngoại bào Hệ protease của vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp baogồm nhiều enzyme rất giống nhau về hình dạng cấu trúc và khối lượng phân tử nênrất khó tách ra dười dạng tinh thể đồng nhất Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzymekhác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu cao và cho sản phẩmthủy phân triệt để và đa dạng Protease do vi khuẩn tổng hợp có khả năng chịu đượcnhiệt độ cao hơn các nguồn khác nên được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vựcnhư: công nghiệp thực phẩm, y học, nông nghiệp v.v… [2]

2.2.4.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Theo Lương Đức Phẩm (2007) [17] Protease của vi khuẩn được sử dụng trongquá trình chế biến cá Ở mang cá, đặc biệt là ở ruột cá nguồn vi sinh vật rất phongphú Khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá protease có trong ruột cá thủyphân một phần protein của cá Trong một số trường hợp khi thêm protease sẽ làmtăng hương vị của sản phẩm

Ngoài ra protease còn được sử dụng để làm mểm thịt và tăng hương vị thịt saukhi chế biến Nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ làm tănghương vị thịt Việc thủy phân protein bằng protease không phá hủy các vitamin cótrong nguyên liệu, không làm sẩm màu dịch thủy phân và không tạo thành các sảnphẩm phụ khác Người ta cũng sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủyphân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da và để sản xuất thức ănkiêng)

Một số protease có khả năng làm đông sữa trong sản xuất phomat Proteaselàm phomat chóng chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại phomatkhác nhau Protease của vi khuẩn có thể thay thế một phần renin Vì thế, ta có thểgiảm giá thành trong sản xuất phomat [7]

Dùng protease của vi khuẩn để thu casein kỹ thuật dùng trong các ngành khácnhau như : vecni, chất màu, hương liệu Nó cũng được sử dụng trong sản xuấtchao và các dịch thủy phân.

2.2.4.2 Trong công nghiệp nước giải khát

Protease được sử dụng để làm trong bia và nước ép trái cây Được sử dụngtrong quá trình sản xuất rượu giúp phân giải các protein có tác dụng kìm hãmamylase do đó làm tăng quá trình đường hóa tinh bột [7]

2.2.4.3 Trong công nghiệp thuộc da

Protease còn được sử dụng để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông rakhỏi da mà không là ảnh hưởng đến chất lượng da, vì vậy, da thu được sẽ mềm vàsạch lông hơn [12]

2.2.4.4 Trong mỹ phẩm

Protease được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm,kem bôi mặt Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn cácloại xà phòng có chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như:vết máu khá tốt [12]

2.2.4.5 Trong nông nghiệp

Protease được sử dụng để xử lý các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho vậtnuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số sử dụng thức ăn, có thể tiếnhành bằng cách thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc dùngprotease để xử l ý sơ bộ thức ăn [17]

2.2.4.6 Trong nghiên cứu khoa học

Được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc protein

2.2.4.7 Trong công nghiệp dược phẩm và y học

Sản xuất các chất hoạt hóa và kiềm hãm protease để điều trị các bệnh đặctrưng Protease được sử dụng để tăng khả năng tiêu hóa protein ở những người bịtiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường do thiếu enzyme Protease còn được sử dụng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể đểchữa bệnh nghẽn tỉnh mạch Protease được sử dụng để làm tiêu mủ ở các vếtthương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp [12]

2.2.4.8 Trong xử lý rác

Hiện nay đất nước đang ngày càng phát triển, dân số tăng nhanh, khối lượngchất thải đặc biệt là rác hữu cơ trong công nghiệp, nông nghiệp và sinh hoạt tăng rấtnhanh Theo tính toán của công ty công trình đô thị I, mỗi ngày người Hà Nội thải

ra khoảng 1500m3 rác Mỗi năm, một người dân ở thành phố Hồ Chí Minh trungbình thải ra 160 kg rác Như vậy, khối lượng rác mà thành phố thãi ra mỗi năm là

360000 tấn Phần lớn rác được đưa đến các bãi rác để đem chôn, đem đốt hoặc đổvào các dòng nước đây là nguồn gốc lây lan của các ở bệnh tật, phát sinh ra các độc chất gây ô nhiểm không khí ảnh hưởng đến con người, vật dụng gia súc và hoamàu Trong rác vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại 115 ngày, vi khuẩn phó thươnghàn tồn tại 136 ngày, vi khuẩn kiết lỵ 40 ngày, trứng giun đũa 300 ngày.Rác khôngđược dọn kịp thời sẽ gây tắc nghẽn cống rãnh hoặc án ngữ đường phố, tạo môitrường tốt cho ruồi muỗi và các loài trung gian truyền bệnh khác phát triển Hiệnnay, người ta xử lý rác bằng cách đốt ở các nhà máy thu hơi nhiệt cho nhà mát phátđiện hoặc nhà máy hơi công nghiệp Khi đốt như thế các chất thải là các chất tổnghợp, cao su sẽ gây ra nhiều khì độc như SO2, SO3, P2O5, NO, NO2, CO gây hại chosức khỏe

Nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học, người ta đã đề ra con đường xử lý rácbằng con đường sinh học Tức là phân hủy rác hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh vật.Nguồn vi sinh vật có hoạt tính protease hiện hữu khá phong phú trong tự nhiên Người ta có thể sử dụng các vi sinh vật này để phân hủy các nguồn protein động vật

và thực vật có trong rác hữu cơ [16] Để giải quyết vấn đề bảo vệ môi trường sống,đồng thời tận dụng phế liệu sản xuất ra những vật liệu quan trọng cho các ngành.Một trong những biện pháp tốt nhất là tái xuất phế thải làm phân bón hữu cơ, giá thểtrồng nấm, nuôi giun Trong rác có chứa một số chất hữu cơ, cũng như các yếu tốdinh dưỡng dùng để bổ sung độ phì nhiêu cho đất và làm tăng thu hoạch cây trồng.trung bình trong 10 tấn rác có 900-1900kg chất hữu cơ theo hướng này rác có thể ủthành đống, tại đây sẽ xảy ra các quá trình phân giải các chất hữu cơ của vi sinh vật.Nhiệt độ của các đống ủ khoảng 50oC Muốn cho quá trình ủ rác diễn ra nhanh hơn

người ta cho thêm vào đó các loại vi khuẩn như Streptomyces, Azotobacter, một số nấm mốc như Rhizobium

Ở nước ta hiện nay đã có những nhà máy ủ phân rác để bổ sung chất hữu Cơcho nông nghiệp như nhà máy DANO (hooc môn) công suất 5 tấn/ ngày Tại đây ủphân rác dựa trên các tác động phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật Các điều kiệnbên ngoài có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá trình ủ rác

Do đó phải tạo điều kiện cần thiết nhằm thúc đẩy mạnh hoặc khống chế hoạt độngcủa vi sinh vật làm cho rác hoại kỹ hơn, đỡ mất chất dinh dưỡng

2.2.4.9 Trong kỹ nghệ phim ảnh

Protease từ vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu cảm quan khácnhau như phim điện ảnh, phim rơnghen, phim chụp Nó sẽ phân giải và hòa tan lớpnhủ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lạicác loại phim và giấy ảnh quí

2.2.5 những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease từ Bacillus nói chung và Bacillus subtilis nói riêng.

2.2.5.1 Trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thu nhận protease từ vi khuẩn

Bacillus subtilis làm cơ sở để sản xuất các sản phẩm sinh học phục vụ cho con

người và các động vật

Năm 2009 Ghafoor A và cộng sự đã nghiên cứu Chủng Bacillus subtilis

AG-1 và EAG-2, thu enzyme protease ngoại bào [22]

Năm 2002 Joo HS và cộng sự đã nghiên cứu khả năng tối ưu hóa việc sản xuất

một protease kiềm ngoại bào từ vi khuẩn Bacillus Horikoshi [32].

Năm 1999 Mehrotra S và cộng sự đã nghiên cứu Sản xuất protease kiềm bởi

các loài vi khuẩn Bacillus [31].

2.2.5.2 Ở Việt Nam

Năm 1995 Lê Đức Mạnh và cộng sự đã nghiên cứu thu nhận và bảo quản

protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis [14].

Năm 2004 Đỗ Thị Bích Thủy đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên

khả năng sinh protease của Bacillus subtilis [20].

Năm 2013 Trần Ngọc Hùng, Lê Phi Nga đã nghiên cứu thu Protease từ

Bacillus subtilis sử dụng trong chế phẩm sinh học trong chăn nuôi [10].

Năm 2010 Nguyễn Văn Rư và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy và thu enzyme

protease từ chủng Bacillus subtilis.

Năm 2009 Nguyễn Thị Trần Thụy đã nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn

Bacillus subtilis phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm.

Năm 2009 Phan Trương Hương Thảo đã nghiên cứu thu nhận và khảo sát một

số đặc tính của enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis.

Năm 2007 Bùi Thị Phi đã nghiên cứu phân lập khảo sát đặc điểm sinh học và

tìm hiểu khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử

nghiệm chế phẩm sinh học

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng khảo sát

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh protease phân lập từ đất tại

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 3.1 dưới đây:

Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ST

T Tên hóa chất Xuất xứ

ST T

Tên hóa

3

7 Triammoniu

m citrate Trung Quốc

3.3.2 Thiết bị và dụng cụ

3.3.2.1 Thiết bị sử dụng

Đề tài đã sử dụng các thiết bị nghiên cứu liệt kê trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ST

T Tên thiết bị Xuất xứ

10

Tủ lạnh sâu (-80oC) Sanyo-Nhật

MMM MedcenterEinrichtungenGmbH-Đức

S.p.A-12

Máy khuấy từ(máy vortex)

Sartorius Đức

AG-5 Máy ly tâm Sartorius AG-Đức 13 Cân điện tử Sartorius

AG-Đức

AG-Đức

8 Kính hiển vi Sartorius AG-Đức

3.3.2.2 Các dụng cụ nghiên cứu

Các dụng cụ khác được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: micropipette 100µl, 100-1000µl (Mỹ), đầu côn, bình tam giác, que cấy, que trang, đĩa petri, ốngeppendorf, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, giá eppendorf…

10-3.3.3 Môi trường sử dụng

- Môi trường phân lập, nuôi cấy và bảo quản các chủng kiểm định: môitrường MPA dạng thạch và MPA dịch thể

Bảng 3.3: Thành phần môi trường MPA dạng thạch

Bảng 3.5: Môi trường thử hoạt tính của enzyme protease [24]

Môi trường cơ sở

Bảng 3.7: Môi trường Simmons Citrate Agar

Khử trùng ở 121oC/15 – 20 phút Khi môi trường nguội đến 50oC thêm 12,5

ml dung dịch lòng đỏ trứng gà Trộn đều rồi phân vào đĩa petri vô trùng Cách phadung dịch lòng đỏ trứng: rửa sạch trứng, sát trùng bên ngoài trứng bằng cồn Dùng

kẹp đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lòng đỏ vào bacher có chứa 25 –30ml nước muối sinh lý vô trùng Bảo quản dung dịch này ở 4oC để dùng.

Bảng 3.10: Môi trường Clark Lubs

Lọc trong trước khi dùng

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

+ Quan sát hình thái khuẩn lạc

+ Nhuộm Gram quan sát hình thái tế bào

+ Thử các phản ứng sinh hóa để tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

- Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh protease cao

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh

trưởng và tạo enzyme của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được

3.5 Phương pháp thực hiện đề tài

3.5.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

3.5.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn

Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở dưới.Cân 10g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô

trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1

3.5.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được phân lập từ đất theo phương pháp của Nguyễn Lân

Dũng và Hoàng Đức Nhuận (1976) [3] như sau:

Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự

từ 1 đến 4 Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập cónồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, đượcnồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng Tiếp theo chọncác ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từmỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường MPA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) vàtrang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa MPA này vào tủ ấm ủ ở

37oC/24h Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi

ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại

trên môi trường MPA nghiêng

3.5.1.3 Phương pháp giữ giống và cấy chuyển

Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi trườngthạch nghiêng trong ống nghiệm theo phương pháp của Nguyễn Lân Dũng vàHoàng Đức Nhuận (1976) [3]

Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ốngnghiệm chờ thạch đông Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng và cấy zich zắc trên bềmặt thạch nghiêng Nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 37oC, sau 24h thấy xuất hiệnkhuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 4oC giữ giống

Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống

3.5.1.4 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc

Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường rắn MPA theophương pháp của Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận (1976) [3]

- Khả năng phát triển của khuẩn lạc.

- Bề mặt khuẩn lạc

- Màu sắc khuẩn lạc

3.5.1.5 Phương pháp nhuộm Gram

Chúng tôi tiến hành nhuộm gram theo phương pháp của Nguyễn Lân Dũng,Hoàng Đức Nhuận (1976) [3] Đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu được sửdụng rất phổ biến để quan sát các đặc điểm hình thái, kích thước của tế bào vi khuẩn Cách tiến hành: cho một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy vô trùnglấy một ít tế bào vi khuẩn mọc trên môi trường đặc hoà vào giọt nước

Hơp hiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá vì như thế tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng Khi giọt nước bay hơi dần vikhuẩn sẽ gắn chặt vào phiến kính

Nhuộm màu nhờ tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc nhuộm này lên vết bôi, giữ

1-2 phút rồi rửa bằng nước cất Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1phút, sau đó đổ thuốc đi và tráng bằng nước cất Sau đó rửa bằng cồn 96o trong thờigian khoảng 30-40 giây Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi

Sau đó nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng khoảng 1-2 phút Rửa lại bằngnước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thì đó là vikhuẩn Gram dương, ngược lại vi khuẩn nhuộm màu hồng là vi khuẩn Gram âm.Chọn các chủng có khả năng nhuộm màu Gram dương để tiếp tục nghiên cứu

3.5.1.6 Phương pháp khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được.

- Phương pháp xác định khả năng lên men đường

Chúng tôi tiến hành xác định khả năng lên men đường theo phương pháp củaNguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận (1976) [3] như sau:

Chuẩn bị :

Môi trường đường : maltose

Giống vi khuẩn Bacillus subtilis

Ống nghiệm, ống Durham