3.5.2.1. Xác định khả năng thủy phân protein
Chúng tôi tiến hành xác định khả năng thủy phân protein theo phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận (1976) [3]. Phương pháp này dùng để xác định khả năng thủy phân protein của các chủng vi khuẩn thu được.
Cách tiến hành : Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng có chứa cơ chất cảm ứng là casein ở 37oC trong khoảng 24 đến 48 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau 24 giờ lấy dịch nuôi đem li tâm 5000 vòng/phút lấy dịch loại bỏ cặn. Đổ môi trường đặc có chứa casein với nồng độ tương tự vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên để đục lổ trên môi trường tạo thành giếng.
Dùng Micro pipet hút dịch li tâm cho vào giếng. Để đĩa trong tủ 37oC 3 – 4 giờ để dịch khuyếch tán. Sau 24 giờ dùng thuốc thử HgCl2 đổ lên bề mặt thạch. Nếu có enzyme nó sẽ tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng, do các protein bị phân
giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các vùng chưa bị phân giải sẽ có màu trắng đục.
Đánh giá khả năng tạo thành enzyme để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzyme cao: Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d).
Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng nhiều.
3.5.2.2 Xác định hoạt độ của enzyme protease theo phương pháp Anson
Chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme protease theo phương pháp Anson của Phạm Thị Ánh Hồng (2003) [8] như sau:
Hóa chất : Dung dịch Na2HPO4 1/15M : hòa tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nước thành 250ml.
Dung dịch KH2PO4 1/15M : hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml. Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7,6 : trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 đo và chỉnh lại pH cho đúng.
Dung dịch Casein 1% : đun sôi cách thủy 1g Casein trong dung dịch đệm Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ100ml.
Dung dịch TCA 10% : hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ100ml.
Dung dịch NaOH 0,5N : Hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1 :2)
Dung dịch HCl 0,2N : trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml. Dung dịch tyrosin 20 mM/l : khuấy nghiền 0,118g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml.
Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0,2 N : pha loãng 5ml dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100ml.
Cách tiến hành : Dựng đường chuẩn Tyrosin
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6
Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0
Dung dịch HCl 0,2N (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1
Dung dịch NaOH 0,5 N (ml) 2 2 2 2 2 2
Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm
Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODKC).
- Xác định hoạt tính enzyme : Ống nghiệm thật là ống thí nghiệm, ống nghiệm không là ống kiểm chứng
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Thật Không
Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 5
Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 0
Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 30 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 5 0
Dung dịch enzym mẫu (ml) 0 1
Để yên lọc lấy dịch bên dưới
Dung dịch lọc (ml) 1 1
Dung dịch NaOH 0,5N 2 2
Thuốc thử Folin 0.6 0.6
Lắc đều, để yên sau 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm
Đường chuẩn Tyrosine
Lượng tyrosine (µM) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Hình 4.1 : Đồ thị đường chuẩn Tyrosine
Tính ΔOD = ODTN – ODKC . dựa vào đồ thị chuẩn suy ra µM tyrosine - Cách tính Hoạt tính protease : HT (UI) = v t K V X . . . (UI/ml) hoặc HT (UI) = m v t K V X . . . . (UI/g)
X: là số µM Tyrosine suy ra từ đường chuẩn V: Tổng thể tích hổn hợp phản ứng enzym (11ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml)
K: độ pha loãng của mẫu. t: thời gian thủy phân (phút)
m: Khối lượng mẫu enzim đem xác định hoạt tính (g)
1UI = 1 micromol Tyrosine/ml/phút hoặc UI/g