1.2. Khả năng tồn tại của màng sinh vật Màng sinh vật phát triển mạnh ở những nơi có nƣớc, chẳng hạn nhƣ trong nhà bếp, kính áp tròng và thậm chí trong cơ thể sinh vật. Khi hệ thống mạng lƣới sinh vật phát triển đầy đủ, có thể quan sát thấy bằng mắt thƣờng. 1.2.1. Trong môi trƣờng tự nhiên Trong các rừng mƣa nhiệt đới điều kiện độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển phong phú của màng sinh vật nhƣ rêu và những cặn bám dƣới đáy ao Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 4 K53A Sinh học hồ, hay những mảng rêu địa y bám trên thân cây, hay những váng nổi trên bề mặt ao, hồ… (Hình 2A) Màng sinh vật còn có thể đƣợc tìm thấy ở sa mạc. Một trong những hình thức phổ biến của dạng màng sinh vật sa mạc đƣợc gọi là vec-ni sa mạc (varnish desert), một thuật ngữ mô tả hiện tƣợng những hòn đá vách núi có màng sinh vật phát triển xuất hiện những vết màu. Màng sinh vật cũng có thể đƣợc tìm thấy phát triển trong môi trƣờng cực trị nhƣ sông băng ở Nam Cực, hay các mạch suối nƣớc nóng… Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khuẩn có trong màng sinh vật bám ở rễ cây. Rễ cây tiết ra một lƣợng đáng kể các loại đƣờng, axit amin, vitamin… nhƣ là chất dinh dƣỡng cho các màng sinh vật. Ngƣợc lại, màng sinh vật tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của thực vật [39]. 1.2.2. Trong các vật liệu, hệ thống Trong khi màng sinh vật đối với tự nhiên mang nhiều yếu tố tích cực thì đối với công nghiệp, màng sinh vật lại là nguyên nhân của nhiều vấn đề tiêu cực nhƣ sự ô nhiễm và tắc nghẽn màng sinh vật (biofouling) xảy ra gần nhƣ ở tất cả những khâu xử lý trong công nghiệp có liên quan đến việc sử dụng nƣớc nhƣ hoạt động làm mát, sản xuất bột giấy… Màng sinh vật là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng tắc ống dẫn ăn mòn ống dẫn và làm ô nhiễm nguồn nƣớc. Trong các vật dụng hàng ngày cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật. Những mảng bám trên vòi hoa sen, bồn rửa mặt, sự tắc nghẽn đƣờng ống nƣớc là những ví dụ cho sự có mặt của màng sinh vật (Hình 2B) [39]. 1.2.3. Trong y tế và cơ thể sinh vật Trên thực tế cơ thể con ngƣời và các sinh vật nói chung là nơi tồn tại của hệ thống rất đa dạng các loài vi sinh vật. Tuy nhiên đôi khi sự mất cân bằng về hệ vi sinh vật trong cơ thể là nguyên nhân gây ra các vấn đề về nhiễm trùng. Trong đó màng sinh vật là một trong số những nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng mãn tính viêm tai hay thƣờng gặp nhất là trên những mảng bám răng. Thậm chí bề mặt của những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể nhƣ van tim niệu quản nhân tạo cũng có thể là nơi phát triển của biofilm (hình 2C) [38]. Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 5 K53A Sinh học A B C Hình 2. Một số vị trí tồn tại của màng sinh vật A: Màng sinh vật phát triển trên mặt hồ B: Màng sinh vật phát triển trong hệ thống ống dẫn C: Màng sinh vật phát triển trong một số bộ phận cơ thể ngƣời 1.3. Thành phần của màng sinh vật Mạng lƣới màng sinh vật nói chung bao gồm 97% nƣớc, 2-5% là các tế bào vi khuẩn, 3-6% các hợp chất ngoại bào và các ion [36]. 1.3.1. Thành phần các hợp chất ngoại bào (EPS) Việc hình thành các hợp chất ngoại bào là điều kiện tiên quyết cho sự hình thành màng sinh vật. Mạng lƣới ngoại bào (EPS) có độ dày từ 0 2 đến 1µm. Ở một vài loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS mỏng hơn không vƣợt quá 10 đến 30nm. Ngoài những đặc tính cấu trúc, bảo vệ và thẩm thấu EPS còn là nơi dự trữ chất dinh dƣỡng cho tế bào phát triển trong điều kiện thiếu chất dinh dƣỡng [21] . Sự phân bố của EPS trong màng sinh vật thay đổi theo không gian và thời gian. Hàm lƣợng EPS tăng theo độ dày và độ già của màng sinh vật. Màng sinh vật mỏng có lƣợng EPS thấp và giàu protein. Thành phần EPS phong phú hơn khi vào sâu trong cấu trúc màng sinh vật. Hầu nhƣ lƣợng EPS đƣợc sản sinh trong màng sinh vật cũng có nhiều điểm khác so với các vi sinh vật phù du [19]. Thành phần EPS thay đổi theo thành phần vi sinh vật và điều kiện môi trƣờng hình thành nên màng sinh vật. EPS thông thƣờng bao gồm 40-95% polysaccharide, 1-60% protein, 1-10% axit nucleic và 1-40% lipid [12]. Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 6 K53A Sinh học Bảng 1. Vai trò của các thành phần trong EPS [13] Chức năng của hợp chất ngoại bào Thành phần của EPS Chức năng trong biofilm Cấu trúc Polysaccharide trung tính Cấu tạo nên biofilm Amyloid Kênh dẫn Polysaccharide tích điện hoặc kị nƣớc Kênh dẫn ion, kênh dẫn nƣớc Hoạt hóa Các enzym ngoại bào Phân hủy các hợp chất hữu cơ Hoạt hóa bề mặt Amphiphlic Tƣơng tác bề mặt Màng bao Xuất bào, kênh dẫn nƣớc Thông tin di truyền Lectin Đặc trƣng nhận dạng Axit nucleic Thông tin di truyền, cấu trúc Hoạt hóa quá trình oxi hóa khử Hợp chất hữu cơ chịu nhiệt của vi khuẩn Thu nhận electron Chất dinh dƣỡng Các loại polymer Nguồn cung cấp cacbon, nitơ, photpho 1.3.1.1. Vai trò của protein ngoại bào Nhìn chung, thành phần protein trong EPS là tƣơng đối lớn, song vai trò của chúng trong màng sinh vật chƣa đƣợc biết đến một cách rõ ràng. Đối với một số loại vi khuẩn protein đóng vai trò là pili roi curli và sợi amyloid đƣợc cho là yếu tố quan trọng cho sự hình thành màng sinh vật. Ngoài ra, những enzym ngoại bào, thông thƣờng là protease và glycosidase trong màng biofilm, đóng vai trò trao đổi chất [33]. 1.3.1.2. Vai trò của polysaccharide ngoại bào Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh biofilm. Các polysaccharide có thể rất đa dạng về các đặc tính sinh lý, sinh hóa thông qua dạng liên kết glycoside giữa các phân tử (β-1 4 β-1 3 hay α-1 6) hay đơn vị monomer cấu tạo nên. Polysaccharide có thể là các đồng phân tử cấu tạo bởi một đơn phân monosacharide duy nhất nhƣ cellulose dextran hay dị phân tử cấu tạo bởi 2 đến 4 dạng đơn phân khác nhau nhƣ alginate emulsan gellan. Các Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 7 K53A Sinh học monosaccharide phổ biến trong biofilm là D-glucose, D-galactose, D-mannose, Lfucose nhóm axit uronic nhƣ axit D-glucuronic, axit D-galacturonic. Thành phần các đƣờng đơn có ảnh hƣởng đến đặc tính của polysaccharit và qua đó ảnh hƣởng đến tính chất của biofilm [7]. 1.3.2. Thành phần tế bào Cấu trúc màng sinh vật bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo cho sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào. Mạng lƣới chất ngoại bào quy định sự sắp xếp tế bào và tạo nên những kênh dẫn truyền nƣớc bên trong màng sinh vật. Chính nhờ cấu trúc này mà các chất dịch, nƣớc có thể lƣu thông qua màng sinh vật tạo điều kiện cho các chất dinh dƣỡng đƣợc khuếch tán, phân phối đến khắp các tế bào trong màng đồng thời loại đi những chất thải không cần thiết [23]. Màng sinh vật có thể đƣợc hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi sinh vật khác. Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc. Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó qui định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng nhƣ có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào nhƣ lông roi lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể. Giữa các tế bào trong hệ thống mạng lƣới màng sinh vật có các kênh dẫn, cho phép di truyền ngang các tính trạng mới trong quần thể sinh vật [6]. 1.4. Quá trình hình thành màng sinh vật Dựa trên các phƣơng pháp phân tích di truyền học, proteomics và sinh học phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhà khoa học đã đƣa ra một mô hình cấu trúc màng sinh vật cơ bản [8]. Trong mô hình này, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và đƣợc bao quanh bởi một mạng lƣới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật. Nhờ đó dịch tế bào có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dƣỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng nhƣ loại bỏ các chất thải [34]. Sự tạo thành màng sinh vật cũng giống nhƣ một quá trình phát triển của vi sinh vật và cần phải trải qua một số bƣớc bao gồm: sự gắn kết của các tế bào vi Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 8 K53A Sinh học sinh vật trôi nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trƣởng và liên kết các tế bào thành vi khuẩn lạc, sự tạo thành màng sinh vật trƣởng thành (hoàn chỉnh), và cuối cùng là sự tách rời của các tế bào vi sinh vật thành dạng dịch lỏng tế bào (Hình 3). Hình 3. Các giai đoạn chính hình thành màng biofilm [11] 1.Giai đoạn gắn kết lên bề mặt, 2. Hình thành lớp tế bào trên bề mặt, 3. Hình thành mạng lƣới ngoại bào, 4. Hình thành biofilm hoàn chỉnh, 5. Quá trình tách rời Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch Các bề mặt trong môi trƣờng thủy sinh thƣờng đạt đƣợc điều kiện cho sự hấp thụ của các chất vô cơ và hữu cơ. Dƣới một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính lý hóa, các vi khuẩn có thể di chuyển hƣớng đến bề mặt bởi chuyển động Brown hay hóa ứng động và hình thành mối tƣơng tác tạm thời với bề mặt thông qua các lực tƣơng tác yếu nhƣ lực Van der Waals, lực hút tình điện, liên kết hydro. Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút tế bào hay sử dụng các tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế bào riêng rẽ đƣợc bao bọc trong một mạng lƣới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật [30]. Tuy nhiên, các tế bào này chƣa hẳn đã đi vào quá trình hình thành màng sinh vật và có thể rời bề mặt để tiếp tục đời sống tự do riêng lẻ. Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 9 K53A Sinh học Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không những phải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trƣởng để hình thành một màng sinh vật hoàn chỉnh. Vì vậy giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất ngoại bào nhằm làm tăng tính bám dính ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa tế bào và giá thể. Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn bám dính không thuận nghịch đƣợc thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi bám dính. Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi đƣợc đánh giá là quan trọng trong bƣớc đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận động co rút đƣợc chỉ ra là cần thiết cho sự trƣởng thành của màng sinh vật trong điều kiện tĩnh. Cụ thể nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khuẩn lạc trong màng sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tƣơng tác giữa các vi khuẩn với bề mặt để hình thành nên các nhóm tế bào qua đó giúp tăng cƣờng mức độ bám dính với bề mặt [30]. Giai đoạn 3: Hình thành mạng lƣới ngoại bào Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục đƣợc tạo ra bởi các tế bào để liên kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vi khuẩn lạc. Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trƣờng. Kết quả là mật độ tế bào trong một màng sinh vật cũng nhƣ lƣợng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên. Một mạng lƣới màng sinh vật dần đƣợc hình thành [34]. Giai đoạn 4: Hình thành một biofilm hoàn chỉnh Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình trƣởng thành của màng sinh vật bắt đầu. Trong suốt quá trình này, sự phân chia của các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp các tế bào phân chia để lan rộng và phát triển dần lên từ các điểm gắn kết để hình thành các vi khuẩn lạc hay các cụm tế bào. Từ một phạm vi ban đầu biofilm có thể mở rộng về không gian cũng nhƣ độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng. Một biofilm hoàn chỉnh có cấu trúc giống nhƣ tháp hình nấm đƣợc bao quanh bởi các kênh vận chuyển nƣớc có tính thẩm thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh dƣỡng và oxy vào bên trong biofillm cũng đƣợc quan sát. Các biofilm phát triển khá chậm thƣờng cần vài ngày để đạt đƣợc cấu trúc hoàn chỉnh. Một biofilm trƣởng thành đƣợc coi nhƣ một tổ chức tiên tiến luôn có sự thích nghi liên tục với môi Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 10 K53A Sinh học trƣờng bao quanh điều này cũng có nghĩa là khi điều kiện môi trƣờng bất lợi vi khuẩn có thể tách rời khỏi biofilm để tìm một môi trƣờng mới phù hợp hơn [18]. Giai đoạn 5: Tách rời Khả năng phát triển của màng sinh vật giới hạn trong điều kiện dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào. Các phân tử này đƣợc giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dƣỡng, sự tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH, nguồn cung cấp cacbon, oxy. Trong một số trƣờng hợp, khi màng sinh vật đạt đến khối lƣợng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc [29].
Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Quang Huy, người thầy trực tiếp hướng dẫn em tận tình trình thực đề tài, giúp em vượt qua khó khăn hoàn thành tốt khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn cung cấp cho em kiến thức bổ ích suốt bốn năm học vừa qua giúp đỡ em nhiều việc nắm bắt kiến thức động viên em lớn mặt tinh thần Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Phạm Bảo Yên anh chị, bạn, em thuộc phòng Enzyme học phân tích hoạt tính sinh học - Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Protein Enzyme phòng thí nghiệm môn Sinh lý thực vật Hóa sinh chia sẻ, giúp đỡ tạo điều kiện lớn để em thực đề tài khóa luận Khóa luận thực có hỗ trợ kinh phí đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội mã số QG11-16 đề tài Nghiên cứu phát triển công nghệ màng sinh học xử lý nước thải giàu nitơ, photpho Bộ Công thương Nhân dịp em xin cảm ơn hỗ trợ đơn vị tài trợ Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè bên, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực khóa luận, giúp em trưởng thành bước đường Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2012 Sinh viên Đoàn Diệu Linh Đoàn Diệu Linh i K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp BẢNG MỘT SỐ KÍ HIỆU VIẾT TẮT ADH L- arginine ADI Adipic acid ARA L-arabinose CAP Capric acid CIT Trisodium citrate EPS Hợp chất ngoại bào (Extracellular Polymeric Substances) ESC Esculin ferric citrate GEL gelatine GLU D-glucose GNT Potassium gluconate LB Môi trƣờng Luria – Bertani MAL D-maltose MAN D-mannitol MLT Malic acid MNE D-mannose NAG N-acetyl-glucosamine OD Mật độ quang học (Optical Density) PAC Phenylacetic acid PNPG 4-nitrophenyl-βD-Galactopyranoside TRP L- tryptophan URE Urea w/v Khối lƣợng (g)/thể tích (ml) Đoàn Diệu Linh ii K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM .2 1.1 Giới thiệu Biofilm 1.2 Khả tồn màng sinh vật 1.2.1 Trong môi trƣờng tự nhiên 1.2.2 Trong vật liệu, hệ thống 1.2.3 Trong y tế thể sinh vật .4 1.3 Thành phần màng sinh vật 1.3.1 Thành phần hợp chất ngoại bào (EPS) .5 1.3.2 Thành phần tế bào 1.4 Quá trình hình thành màng sinh vật 1.5 Vai trò màng sinh vật vi sinh vật 10 1.5.1 Bảo vệ tế bào trƣớc điều kiện bất lợi môi trƣờng .10 1.5.2 Mối quan hệ hợp tác loài 10 1.6 Ứng dụng màng sinh vật 11 1.6.1 Ứng dụng phòng trừ bệnh hại trồng 11 1.6.2 Ứng dụng xử lý nƣớc thải 11 1.7 Vấn đề xử lý nƣớc thải .12 1.7.1 Quá trình nitrate hóa .13 1.7.2 Quá trình phản nitrate hóa 13 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .15 2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu 15 2.2 Hóa chất, thiết bị 15 2.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy 15 2.2.2 Thuốc thử 16 2.2.3 Máy móc, thiết bị .17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn 18 2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu đánh giá khả tạo màng sinh vật chủng vi sinh vật 18 Đoàn Diệu Linh iii K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2.3.3 Tối ƣu hóa điều kiện môi trƣờng 19 2.3.4 Khả đồng hóa hợp chất hữu 19 2.3.5 Phƣơng pháp nhuộm Gram nhận dạng chủng nghiên cứu 20 2.3.6 Quan sát cấu trúc màng sinh vật kỹ thuật ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét 21 2.3.7 Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrate N-NO3- 21 2.3.8 Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrite N-NO2- 22 2.3.9 Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrite N-NH4+ 22 2.3.10 Phƣơng pháp thống kê sinh học 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết phân lập chủng vi sinh vật có khả tạo biofilm 24 3.2 Đánh giá khả hình thành biofilm .25 3.2.1 Chủng vi sinh vật phân lập môi trƣờng Winogradsky 25 3.2.2 Chủng vi sinh vật phân lập môi trƣờng Winogradsky 27 3.3 Ảnh hƣởng số điều kiện nuôi cấy đến khả hình thành màng sinh vật số chủng vi khuẩn phân lập .28 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 28 3.3.2 Ảnh hƣởng độ pH .28 3.3.3 Ảnh hƣởng nồng độ muối NaCl 29 3.4 Cấu trúc màng sinh vật .30 3.4.1 Hình thái vi khuẩn phân lập 30 3.4.2 Hình thái màng sinh vật 31 3.4.3 Cấu trúc hiển vi màng biofilm 32 3.5 Khả sử dụng hợp chất hữu 33 3.6 Hoạt tính chuyển hóa nitơ 34 3.6.1 Khả chuyển hóa phân giải amoni 34 3.6.2 Khả chuyển hóa nitrite thành nitrate 35 KẾT LUẬN .37 KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Đoàn Diệu Linh iv K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Hiện vấn đề ô nhiễm môi trƣờng đặc biệt ô nhiễm nƣớc thải ngày gia tăng gây ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời môi trƣờng sinh thái Nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao mức cho phép đƣợc thải sông, hồ, gây tƣợng phú dƣỡng làm nƣớc có màu mùi khó chịu đặc biệt lƣợng ôxy hòa tan nƣớc giảm mạnh gây ảnh hƣởng đến hệ sinh thái thủy sinh Những nghiên cứu vi sinh vật học ngày đóng vai trò quan trọng nhiều lĩnh vực từ công nghiệp, nông nghiệp, y học đặc biệt vấn đề xử lý ô nhiễm môi trƣờng Việc áp dụng phƣơng pháp sinh học để xử lý nƣớc thải đƣợc quan tâm đặc biệt phƣơng pháp sử dụng vi sinh vật, chủ yếu vi khuẩn để phân hủy sinh học hợp chất hữu Trong phần lớn nghiên cứu phòng thí nghiệm, vi sinh vật thƣờng đƣợc xem xét đánh giá dƣới góc độ tế bào đơn lẻ Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy hầu hết tế bào vi sinh vật thƣờng liên kết với tạo thành cộng đồng bám dính bề mặt giá thể thông qua mạng lƣới hợp chất ngoại bào, hình thành nên cấu trúc gọi màng sinh vật (biofilm) Biofilm dang cấu trúc sống tồn phổ biến tự nhiên Chúng đƣợc hình thành tế bào tiết polymer ngoại bào tạo điều kiện thuận lợi cho việc bám dính, hình thành mạng lƣới Cấu trúc biofilm giúp cho vi sinh vật tồn chống chịu đƣợc điều kiện bất lợi môi trƣờng đồng thời thông qua mối quan hệ hợp tác loài khác hệ thống màng sinh vật, vi sinh vật tận dụng đƣợc nguồn dinh dƣỡng Nghiên cứu màng sinh vật giúp có nhìn mối tƣơng tác vi sinh vật điều kiện tự nhiên Những phát nghiên cứu giúp kiểm soát đƣợc phát triển vi sinh vật, từ ứng dụng vào nhiều ngành công nghiệp khác có xử lý ô nhiễm môi trƣờng Xuất phát từ thực tiễn trên, tiến hành đề tài “Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả tạo màng sinh vật (biofilm) bƣớc đầu định hƣớng ứng dụng xử lý ô nhiễm nƣớc thải” Đoàn Diệu Linh K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 1.1 Giới thiệu Biofilm Vi sinh vật cấu trúc vô nhỏ bé mà ta quan sát thấy mắt thƣờng Chúng phân bố khắp nơi đất nƣớc, không khí Sự phân bố chúng tùy thuộc vào yếu tố đặc trƣng môi trƣờng Chúng tham gia vào việc chuyển hóa vật chất nhƣ chu trình chuyển hóa hợp chất cacbon nitơ chất khoáng khác Mối quan hệ nhóm vi sinh vật với phức tạp có quan hệ ký sinh, cộng sinh, hỗ sinh, kháng sinh Trong trình sống, gặp môi trƣờng khác nhau, chủng vi sinh vật có biến đổi thích nghi để phù hợp với điều kiện sống [3] Vi sinh vật tồn dƣới hai hình thức chủ yếu dạng tế bào sinh vật phù du trôi tự dạng liên kết với bề mặt giá thể tạo thành cấu trúc màng sinh vật (biofilm) Nghiên cứu vi sinh vật học lịch sử có truyền thống tập trung vào kết nghiên cứu thực nghiệm vi sinh vật trôi tự môi trƣờng chất lỏng Tuy nhiên, nghiên cứu ngày cho thấy phần lớn tế bào vi sinh vật tồn cộng đồng không gian riêng biệt đƣợc gọi biofilm Trên thực tế có đến 99% vi khuẩn sống màng biofilm, có 1% sống trạng thái phù du, tự [10, 32] Hình Màng biofilm Bacillus subtilis dƣới kính hiển vi điện tử quét [25] Trong lịch sử nghiên cứu vi sinh vật, Leeuwenhoek ngƣời quan sát chủng vi khuẩn qua kính hiển vi vào năm 1684 [24] Với việc tự chế nhiều kính hiển vi, Leeuwenhoek phát dạng sinh vật sống mà ông gọi chúng “những động vật vô nhỏ bé” Ông ngƣời phát tƣợng bám dính phát triển phổ biến vi khuẩn mảng bám Đoàn Diệu Linh K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp dạng màng biofilm [1] Đến năm 1940, nghiên cứu phát triển vi sinh vật thành lớp đƣợc thực hiện, Zobell mô tả đặc điểm gắn kết quần thể vi sinh vật Ban đầu, màng sinh vật đƣợc cho hệ thống đồng tế bào bám dính lớp chất nhờn Tuy nhiên, nghiên cứu sau cho thấy màng sinh vật thƣờng tập hợp nhiều loài vi khuẩn tạo thành quần thể phức tạp riêng biệt có khả phát triển cấu trúc phức tạp [35] Trong suốt năm 1960 đến 1970 có nhiều nghiên cứu phát triển màng sinh vật, nhiên thuật ngữ màng sinh vật (biofilm) đƣợc công nhận từ năm 1984 [7] Có nhiều định nghĩa khác màng sinh vật đƣợc đề xuất năm qua Theo bách khoa toàn thƣ Wikipedia màng sinh vật đƣợc định nghĩa là: “một cấu trúc tập hợp vi sinh vật đƣợc bao quanh mạng lƣới ngoại bào tạo đƣợc gắn kết bề mặt bề mặt hữu sinh vô sinh” [40] Nhìn chung, màng sinh vật quần thể sinh vật có cấu trúc phức tạp liên kết với hệ thống mạng lƣới ngoại bào Mạng lƣới có chứa polysaccharide ngoại bào, protein ADN có nguồn gốc từ vi sinh vật Giữa cấu trúc chúng có kênh dẫn chất lỏng cho phép tế bào tƣơng tác với hợp tác trao đổi chất Màng sinh vật đƣợc hình thành loài vi sinh vật song đa số màng sinh vật cộng sinh nhiều loài vi sinh vật khác [9] Sự hình thành màng sinh vật đƣợc coi số chế tồn vi sinh vật, vi khuẩn tận dụng đƣợc nguồn dinh dƣỡng nhận đƣợc bảo vệ điều kiện bất lợi nhƣ khô hạn, xạ cực tím chất độc hại Mặt khác coi hệ thống màng sinh vật mạng lƣới nhiều gen, vật liệu di truyền dễ dàng đƣợc trao đổi qua lại tế bào vi sinh vật [32] 1.2 Khả tồn màng sinh vật Màng sinh vật phát triển mạnh nơi có nƣớc, chẳng hạn nhƣ nhà bếp, kính áp tròng chí thể sinh vật Khi hệ thống mạng lƣới sinh vật phát triển đầy đủ, quan sát thấy mắt thƣờng 1.2.1 Trong môi trƣờng tự nhiên Trong rừng mƣa nhiệt đới điều kiện độ ẩm cao điều kiện thuận lợi cho phát triển phong phú màng sinh vật nhƣ rêu cặn bám dƣới đáy ao Đoàn Diệu Linh K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp hồ, hay mảng rêu địa y bám thân cây, hay váng bề mặt ao, hồ… (Hình 2A) Màng sinh vật đƣợc tìm thấy sa mạc Một hình thức phổ biến dạng màng sinh vật sa mạc đƣợc gọi vec-ni sa mạc (varnish desert), thuật ngữ mô tả tƣợng đá vách núi có màng sinh vật phát triển xuất vết màu Màng sinh vật đƣợc tìm thấy phát triển môi trƣờng cực trị nhƣ sông băng Nam Cực, hay mạch suối nƣớc nóng… Đối với thực vật, số loài thực vật cộng sinh với vi khuẩn có màng sinh vật bám rễ Rễ tiết lƣợng đáng kể loại đƣờng, axit amin, vitamin… nhƣ chất dinh dƣỡng cho màng sinh vật Ngƣợc lại, màng sinh vật tạo điều kiện thuận lợi cho khả hấp thụ chất dinh dƣỡng thực vật [39] 1.2.2 Trong vật liệu, hệ thống Trong màng sinh vật tự nhiên mang nhiều yếu tố tích cực công nghiệp, màng sinh vật lại nguyên nhân nhiều vấn đề tiêu cực nhƣ ô nhiễm tắc nghẽn màng sinh vật (biofouling) xảy gần nhƣ tất khâu xử lý công nghiệp có liên quan đến việc sử dụng nƣớc nhƣ hoạt động làm mát, sản xuất bột giấy… Màng sinh vật nguyên nhân gây tƣợng tắc ống dẫn ăn mòn ống dẫn làm ô nhiễm nguồn nƣớc Trong vật dụng hàng ngày có xuất màng sinh vật Những mảng bám vòi hoa sen, bồn rửa mặt, tắc nghẽn đƣờng ống nƣớc ví dụ cho có mặt màng sinh vật (Hình 2B) [39] 1.2.3 Trong y tế thể sinh vật Trên thực tế thể ngƣời sinh vật nói chung nơi tồn hệ thống đa dạng loài vi sinh vật Tuy nhiên cân hệ vi sinh vật thể nguyên nhân gây vấn đề nhiễm trùng Trong màng sinh vật số nguyên nhân gây số bệnh nhiễm trùng mãn tính viêm tai hay thƣờng gặp mảng bám Thậm chí bề mặt dụng cụ y tế đặt thể nhƣ van tim niệu quản nhân tạo nơi phát triển biofilm (hình 2C) [38] Đoàn Diệu Linh K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp A B C Hình Một số vị trí tồn màng sinh vật A: Màng sinh vật phát triển mặt hồ B: Màng sinh vật phát triển hệ thống ống dẫn C: Màng sinh vật phát triển số phận thể ngƣời 1.3 Thành phần màng sinh vật Mạng lƣới màng sinh vật nói chung bao gồm 97% nƣớc, 2-5% tế bào vi khuẩn, 3-6% hợp chất ngoại bào ion [36] 1.3.1 Thành phần hợp chất ngoại bào (EPS) Việc hình thành hợp chất ngoại bào điều kiện tiên cho hình thành màng sinh vật Mạng lƣới ngoại bào (EPS) có độ dày từ đến 1µm Ở vài loài vi khuẩn độ dày lớp EPS mỏng không vƣợt 10 đến 30nm Ngoài đặc tính cấu trúc, bảo vệ thẩm thấu EPS nơi dự trữ chất dinh dƣỡng cho tế bào phát triển điều kiện thiếu chất dinh dƣỡng [21] Sự phân bố EPS màng sinh vật thay đổi theo không gian thời gian Hàm lƣợng EPS tăng theo độ dày độ già màng sinh vật Màng sinh vật mỏng có lƣợng EPS thấp giàu protein Thành phần EPS phong phú vào sâu cấu trúc màng sinh vật Hầu nhƣ lƣợng EPS đƣợc sản sinh màng sinh vật có nhiều điểm khác so với vi sinh vật phù du [19] Thành phần EPS thay đổi theo thành phần vi sinh vật điều kiện môi trƣờng hình thành nên màng sinh vật EPS thông thƣờng bao gồm 40-95% polysaccharide, 1-60% protein, 1-10% axit nucleic 1-40% lipid [12] Đoàn Diệu Linh K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Bảng Vai trò thành phần EPS [13] Chức hợp chất ngoại bào Thành phần EPS Chức biofilm Polysaccharide trung tính Cấu trúc Cấu tạo nên biofilm Amyloid Kênh dẫn Polysaccharide tích điện kị nƣớc Kênh dẫn ion, kênh dẫn nƣớc Các enzym ngoại bào Phân hủy hợp chất hữu Amphiphlic Tƣơng tác bề mặt Màng bao Xuất bào, kênh dẫn nƣớc Lectin Đặc trƣng nhận dạng Axit nucleic Thông tin di truyền, cấu trúc Hoạt hóa trình oxi hóa khử Hợp chất hữu chịu nhiệt vi khuẩn Thu nhận electron Chất dinh dƣỡng Các loại polymer Nguồn cung cấp cacbon, nitơ, photpho Hoạt hóa Hoạt hóa bề mặt Thông tin di truyền 1.3.1.1 Vai trò protein ngoại bào Nhìn chung, thành phần protein EPS tƣơng đối lớn, song vai trò chúng màng sinh vật chƣa đƣợc biết đến cách rõ ràng Đối với số loại vi khuẩn protein đóng vai trò pili roi curli sợi amyloid đƣợc cho yếu tố quan trọng cho hình thành màng sinh vật Ngoài ra, enzym ngoại bào, thông thƣờng protease glycosidase màng biofilm, đóng vai trò trao đổi chất [33] 1.3.1.2 Vai trò polysaccharide ngoại bào Polysaccharide thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh biofilm Các polysaccharide đa dạng đặc tính sinh lý, sinh hóa thông qua dạng liên kết glycoside phân tử (β-1 β-1 hay α-1 6) hay đơn vị monomer cấu tạo nên Polysaccharide đồng phân tử cấu tạo đơn phân monosacharide nhƣ cellulose dextran hay dị phân tử cấu tạo đến dạng đơn phân khác nhƣ alginate emulsan gellan Các Đoàn Diệu Linh K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 3.2.2 Chủng vi sinh vật phân lập môi trƣờng Winogradski Mức độ phát triển OD620 OD570 ĐC H1.1 H1.2.1 H1.2.2 H1.3.1 H1.3.2 H1.4 H1.6 H1.7 H1.9 H1.11 Các chủng vi sinh vật phân lập từ hầm Biogas Hình A Khả tạo màng sinh vật số chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc thải hầm Biogas Mức độ phát triển OD620 OD570 ĐC L1.1 L1.2.1 L1.2.2 L1.2.3 L1.3 L1.5 L1.6 L1.7 L1.8 L1.9 L1.10 Các chủng vi sinh vật phân lập từ đầm nuôi tôm Hình B Khả tạo màng sinh vật số chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc thải đầm nuôi tôm Dựa vào kết hình 7A, 7B, từ 22 chủng vi khuẩn phân lập từ môi trƣờng Winogradski tiếp tục sàng lọc đƣợc chủng vi khuẩn ký hiệu lần lƣợt L1.5, L1.1 H1.4 có khả tạo màng sinh vật tốt với giá trị OD570 trung bình đạt từ đến 3,6 Nhƣ vậy, hai môi trƣờng phân lập vi khuẩn Winogradski 2, phân lập tuyển chọn đƣợc chủng vi sinh vật có khả tạo màng biofilm mạnh cho nghiên cứu Đó chủng đƣợc ký hiệu lần lƣợt W1-VP1.1; W1-VP2.11; W2-H1.4; W2-L1.1 W2-L1.5 Đoàn Diệu Linh 27 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Ảnh hƣởng số điều kiện nuôi cấy đến khả hình thành 3.3 màng sinh vật số chủng vi khuẩn phân lập Để xác định yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến hình thành phát triển màng sinh vật, tiến hành nuôi cấy đánh giá khả hình thành màng sinh vật chủng vi khuẩn môi trƣờng có nhiệt độ, giá trị pH nồng độ muối môi trƣờng khác 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ Nhiệt độ số yếu tố quan trọng việc sinh trƣởng phát triển vi sinh vật Khi khảo sát hình thành màng sinh vật chủng vi sinh vật điều kiện nhiệt độ môi trƣờng khác ta thu đƣợc kết hình 8 Giá trị OD570 VP1.1 H1.4 L1.1 L1.5 vp2.11 25 30 37 Nhiệt độ 45 50 55 (oC) Hình Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả hình thành màng sinh vật Từ kết khảo sát cho thấy hầu hết chủng vi sinh vật biểu khả hình thành màng sinh vật tốt nhiệt độ từ 30 đến 37oC Đặc biệt có chủng VP1.1 có khả hình thành màng sinh vật tối ƣu 30oC Kết tƣơng đồng với kết nghiên cứu trƣớc Nguyễn Quang Huy cộng [27, 28] Điều cho thấy nhiệt độ 37oC thích hợp cho nhiều chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập Việt Nam 3.3.2 Ảnh hƣởng độ pH Độ pH số đặc điểm điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi sinh vật, đồng thời ảnh hƣởng đến khả Đoàn Diệu Linh 28 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp hình thành màng sinh vật chúng Các loài vi sinh vật thƣờng phát triển tối ƣu khoảng pH định Khi pH môi trƣờng thay đổi làm thăng trao đổi chất môi trƣờng vi sinh vật dẫn đến phát triển vi sinh vật chậm ngừng lại Khi tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh vật phân lập đƣợc môi trƣờng dinh dƣỡng có giá trị pH khác nhau, thu đƣợc kết hình 10 Giá trị OD570 H1.4 L1.1 L1.5 VP1.1 VP2.11 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 Giá trị pH Hình Ảnh hƣởng pH đến khả hình thành màng sinh vật Kết cho thấy có chủng VP2.11 hình thành màng sinh vật tốt nhiều mức pH khác nhau, lại hầu hết chủng vi sinh vật có khả tạo màng sinh vật tốt điều kiện pH Ở giá trị pH pH hầu nhƣ phát triển hình thành màng sinh vật chủng vi sinh vật thấp hẳn Đối với chủng L1.1 chủng L1.5, khả hình thành màng sinh vật tốt khoảng từ giá trị pH từ đến Kết phù hợp với nghiên cứu Vijaya cộng [5] cho tốc độ sinh trƣởng tối ƣu chủng có khả oxy hóa amon oxy hóa nitrite từ khoảng pH từ đến 3.3.3 Ảnh hƣởng nồng độ muối NaCl Trong số chủng thu đƣợc, có chủng L1.1 chủng L1.5 đƣợc phân lập từ đầm tôm nƣớc lợ Do khảo sát khả hình thành màng sinh vật môi trƣờng có giá trị nồng độ muối khác lần lƣợt từ đến 5%, thu đƣợc kết hình 10 Đoàn Diệu Linh 29 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 3.0 Giá trị OD570 2.5 2.0 1.5 L1.1 1.0 L1.5 0.5 0.0 10 15 20 25 30 40 50 Nồng độ muối (‰) Hình 10 Ảnh hƣởng nồng độ muối tới khả hình thành màng sinh vật Từ kết trên, thấy chủng L1.5 có khả tạo màng sinh vật tốt nồng độ muối từ 1% đến 2,5% Kết phù hợp với điều kiện môi trƣờng địa điểm lấy mẫu khu vực cửa biển nƣớc lợ Cấu trúc màng sinh vật 3.4 3.4.1 Hình thái vi khuẩn phân lập Để bƣớc đầu nghiên cứu, phân loại chủng vi khuẩn, tiến hành quan sát khuẩn lạc, nhuộm Gram quan sát dƣới kính hiển vi quang học vật kính với độ phóng đại 1000 lần (Hình 11) Kết cho thấy: - Chủng VP1.1: Khuẩn lạc tròn nhăn màu trắng đục kích thƣớc khoảng 23 mm, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dƣơng - Chủng VP2.11: Khuẩn lạc tròn bóng ƣớt, màu trắng đục kích thƣớc khoảng 1mm, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm - Chủng L1.1: Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu vàng nhạt, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm - Chủng L1.5: Khuẩn lạc tròn, bóng, màu vàng nhạt, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm - Chủng H1.4: Khuẩn lạc tròn, mọng nƣớc, màu trắng đục kích thƣớc khoảng 2-3mm, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dƣơng Đoàn Diệu Linh 30 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Hình 11 Hình thái chủng vi khuẩn dƣới kính hiển vi quang học (×1000) 3.4.2 Hình thái màng sinh vật Các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, thử nghiệm khả hình thành màng sinh vật số giá thể khác Biofilm nổi: hình thành bề mặt nƣớc phần tiếp xúc với không khí Biofilm hình thành lớp váng bề mặt Kết thu đƣợc thực nuôi cấy chủng vi khuẩn điều kiện tĩnh sau 24 đƣợc thể qua hình 12 Hình 12 Khả tạo màng biofilm chủng phân lập Đoàn Diệu Linh 31 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Biofilm bề mặt: Khi tiến hành thử nghiệm khả hình thành màng sinh vật bề mặt vật liệu nhựa (ống eppendorf) phƣơng pháp nhuộm tím kết tinh, quan sát thấy rõ bám dính tế bào quanh thành ống (Hình 13) Hình 13 Khả tạo biofilm bề mặt nhựa số chủng phân lập Kết cho thấy chủng vi khuẩn phân lập đƣợc có khả tạo màng sinh vật tốt giá thể nhựa Kết tƣơng tự với kết nghiên cứu Nguyễn Quang Huy cộng trƣớc [27, 28] 3.4.3 Cấu trúc hiển vi màng biofilm Để quan sát chi tiết cấu trúc nhƣ thành phần biofilm phƣơng pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét SEM A B Hình 14 Cấu trúc hiển vi màng biofilm chủng vi khuẩn phân lập (× 5000) A: Chủng L1.1; B: Chủng L1.5 Ảnh hiển vi điện tử quét cho ta thấy cấu trúc điển hình màng sinh vật (hình 14) với hai thành phần mạng lƣới hợp chất ngoại bào bao phủ khối tế bào nằm xen kẽ bên trong, hình thành nên dạng cấu trúc không gian ba chiều Đoàn Diệu Linh 32 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Khi quan sát hình dạng tế bào dƣới độ phóng đại 10000 lần, nhận thấy tế bào chủng vi khuẩn VP1.1 (Hình 15A) có hình que, bề mặt tế bào nhẵn, đƣờng kính sợi tế bào khoảng 0,6µm, chiều dài tế bào 1,5-2µm Các tế bào xếp thành dạng chuỗi liền Trong hình dạng tế bào chủng VP2.11 (Hình 15B) có hình dạng tròn, nhỏ, xếp rời rạc A B Hình 15 Cấu trúc hiển vi màng biofilm chủng vi khuẩn phân lập (×10000) A: Chủng VP1.1; 3.5 B: Chủng VP2.11 Khả sử dụng hợp chất hữu Để xác định bƣớc đầu tên loài chủng vi khuẩn phân lập đƣợc sử dụng kit thử API 20NE để xác định khả sử dụng, chuyển hóa loại đƣờng nhƣ phản ứng enzym đặc trƣng nhóm vi khuẩn Gram âm Kết bảng cho thấy chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập đƣợc có khả sử dụng nhiều loại đƣờng khác nhƣ có hoạt tính enzym khác Tuy nhiên chƣa thể xác định đƣợc xác tên loài chủng hạn chế thời gian nghiên cứu lặp lại thí nghiệm Bảng Kết đồng hóa số hợp chất hữu Các loại phản ứng NO3 Thành phần KNO3 NO2 Các chủng thí nghiệm VP1.1 VP2.11 H1.4 L1.1 L1.5 + - + - - + + N2 + TRP L- tryptophan - + - - - GLU D- glucose - - - - - ADH L- arginine + - + + - Đoàn Diệu Linh 33 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp URE urea + - + + - ESC Esculin ferric citrate + - + - - GEL gelatine + - + - - - - - - - PNPG 4-nitrophenyl-βDGalactopyranoside GLU D-glucose + - + - - ARA L-arabinose - + - - - MNE D-mannose + - + - - MAN D-mannitol + - + - - NAG N-acetyl-glucosamine + - + - - MAL D-maltose + - + - - GNT Potassium gluconate - - - + + CAP Capric acid - + - + + ADI Adipic acid - + - - - MLT Malic acid + + + + + CIT Trisodium citrate - + - + + PAC Phenylacetic acid - + - - - 3.6 Hoạt tính chuyển hóa nitơ Bƣớc đầu nghiên cứu khả áp dụng chủng phân lập vào việc xử lý nƣớc thải giàu nitơ tiến hành đánh giá khả chuyển hóa nitơ Căn vào điều kiện phân lập, khả tạo biofilm, lựa chọn nghiên cứu chủng VP1.1 VP2.11 với khả chuyển hóa amoni, chủng H1.4, L1.1 L1.5 đƣợc thử hoạt tính chuyển hóa nitrite 3.6.1 Khả chuyển hóa, phân giải amoni Sau nuôi lắc môi trƣờng Winogradsky lỏng, chủng VP1.1 VP2.11 đƣợc đem thử hoạt tính chuyển hóa amoni theo phƣơng pháp xác định độ tăng nồng độ nitrite theo thời gian nuôi cấy vi khuẩn Kết hình biểu diễn độ tăng nồng độ nitrite Đoàn Diệu Linh 34 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Nồng độ Nitrite (mg/l) VP1.1 vp2.11 0 10 20 thời gian (ngày) Hình 11 Khả tạo nitrit từ amoni chủng vi sinh vật Sau 10 ngày nuôi lắc, khả chuyển hóa chủng VP2.11 gần nhƣ không đáng kể Trong chủng VP1.1 bắt đầu có chuyển hóa Sau 20 ngày nuôi cấy, nồng độ nitrite dịch lắc chủng VP1.1 tăng nhẹ nồng độ nitrite dịch lắc chủng VP2.11 tăng đáng kể đồng thời chuyển hóa có xu hƣớng tiếp tục tăng Kết cho thấy hai chủng lựa chon có khả chuyển hóa amoni thành nitrit, nhiên khả chuyển hóa chƣa cao 3.6.2 Khả chuyển hóa nitrite thành nitrate Để đánh giá khả chuyển hóa nitrate thành nitrite, thực thí nghiệm xác định độ tăng nồng độ nitrate dịch lắc sau khoảng thời gian ngày 10 ngày 20 ngày thu đƣợc kết nhƣ hình 12 Sau ngày nuôi cấy hàm lƣợng nitrate dịch nuôi cấy chủng H1.4 L1.1 tăng đáng kể Trong nồng độ nitrate dịch lắc chủng L1.5 hầu nhƣ không thay đổi Đoàn Diệu Linh 35 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 4.0 Nồng độ NO3- 3.5 H1.4 3.0 L1.1 L1.5 2.5 2.0 10 ngày 20 ngày thời gian (ngày) Hình 12 Khả chuyển hóa tạo nitrate chủng vi sinh vật Nồng độ nitrate tiếp tục tăng dịch lắc chủng H1.4 sau 20 ngày nuôi cấy có xu hƣớng tiếp tục tăng chủng L1.5 hàm lƣợng gần nhƣ không thay đổi Đây kết nghiên cứu khả chuyển hóa nitơ từ chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo biofilm Chúng tiếp tục tiến hành nghiên cứu nhằm ứng dụng chủng vi khuẩn việc xử lý nƣớc thải giàu nitơ Đoàn Diệu Linh 36 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN Từ 66 chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ mẫu nƣớc thải Việt Nam, tuyển chọn đƣợc chủng ký hiệu VP1.1, VP2.11, H1.4, L1.1 L1.5 có hoạt tính tạo màng biofilm mạnh Nghiên cứu tối ƣu điều kiện ảnh hƣởng đến hình thành biofilm chủng vi khuẩn cho thấycả chủng vi khuẩn hình thành biofilm tốt điều kiện pH môi trƣờng từ đến 8, nhiệt độ 37oC Hai chủng L1.1 L1.5 có khả tạo biofilm tốt nồng độ muối NaCl cao từ 1% đến 2,5% Cả chủng có khả chuyển hóa hợp chất Nitơ chủng VP2.11 chủng L1.1 có khả chuyển hóa tốt hợp chất amoni nitrite KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu khả tạo thành chất bề mặt khả chuyển hóa hợp chất nitơ chủng vi khuẩn phân lập VP1.1, VP2.11, H1.4, L1.1, L1.5 để ứng dụng công nghệ xử lý nƣớc thải Tiến hành xác định trình tự gen 16S rDNAđể phân loại xác chủng vi khuẩn phân lập sâu nghiên cứu đặc tính tạo màng sinh vật chủng vi khuẩn Đoàn Diệu Linh 37 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002) Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học Nxb Đại học Quốc Gia Hà Nội Lê Xuân Phƣơng (2008), Vi sinh vật học môi trường Nxb Xây dựng Hà Nội Tài liệu tiếng Anh APHA/AWWA/WEF (1995) “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater”, 19th Edition, Washington, DC Bhaskar KV., Charyulu P.B.B.N (2005), “Effect of environmental factors on nitrifying bacteria isolated from the rhizosphere of Setaria italica (L.) Beauv”, African Journal of Biotechnology, 4(10), pp 1145-1146 Böckelmann U., Janke A., Kuhn R., Neu TR., Wecke J., Lawrence JR., Szewzyk U (2006) “Bacterial extracellular DNA forming a defined network-like structure”, FEMS Microbiol Letters, 262(1),pp 31-38 Bryers JD (2000), “Biofilms: an introduction, in Biofilms II: process analysis and applications”, Bryers JD., Editor Wiley-Liss, New York, pp 311 Costerton JW., Lewandowski Z., Caldwell DE., Korber DR., Lappin-Scott HM (1995),“Microbial biofilms” Annu Rev Microbiol, 49, pp 711-745 Costerton JW., Cheng KJ., Geesey GG., Ladd TI., Nickel JC., Dasgupta M., Marrie TJ (1987) “Bacterial biofilms in nature and disease” Annu Rev Microbiol, 41, pp 435-464 10 Costerton JW., Stewart PS., Greenberg EP (1999) “Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections”, Science, 284(5418), pp 1318–1322 11 Davis D and Monroe D “Looking for Chinks in the armor of bacterial biofilms”, PLoS Biol, 5(11), pp 21-29 12 Flemming HC and Wingender J (2002), “Extracellular Polymeric Substances (EPS): Structural, Ecological and Technical aspects” in Đoàn Diệu Linh 38 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Encyclopedia of environmental microbiology, BittonG (ed.), John Wiley & Sons, New York, pp 1223-1231 13 Flemming HC., Neu TR., Wozniak DJ (2007), “The EPS Matrix: The House of Biofilm Cells”, J Bacteriol, 189(22), pp 7945-7947 14 Flemming HC (1993) “Biofilm and environmental protection”, Water Sci Technol, 27, pp 1-10 15 Hallberg GR and Keeney DR (1993), “Nitrate” Alley William A (ed.), Van Nostrand Reinhold, New York, pp.297-322 16 Harsh P., Bais RF., Vivanco JM (2004), “Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production” Plant Physiology, 134 (1), pp 307-319 17 Henze M., Harremoës P., Jansen J., and Arvin E (2002), “Wastewater Treatment Biological and Chemical Processes” 3rd (Ed.), Springer, Berlin 18 Heydorn A., Nielsen AT., Hentzer M., Sternberg C., Givskov M., Ersbøll BK., Molin S (2000), “Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT” Microbiology, 146, pp 2395-2407 19 Kives J., Orgaz B., Sanjosé C (2006), “Polysaccharide differences between planktonic and biofilm-associated EPS from Pseudomonas fluorescens B52” Colloids Surf B Biointerfaces 52 (2), pp 123-127 20 Kokare CR., Chakraborty S., Khopade AN., Mahadik KR (2009), “Biofilm: Importance and applications” Indian Journal of Biotechnology, 8, pp 159168 21 Kolter R and Greenberg EP (2006), “Microbial sciences: the superficial life of microbes” Nature, 441(7091), pp 300-302 22 Lazarova V and Manem J (2000), “Innovative biofilm treatment technologies for water and wastewater treatment” in Bryers JD (ed.) “Biofilms II: process analysis and applications” Wiley-Liss, New York, United States, pp 159-206 Đoàn Diệu Linh 39 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 23 Lewandowski (2000), “Structure and function of biofilms” In Biofilms: Advances in their study and control (ed L.V Evans), pp 1–17 24 Madigan MT and Parker J (2003), Brock Biology of Microorganisms 10th ed., Pearson Education, Inc, New Jersey 25 Morikawa M (2006), “Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species”, J Biosci Bioeng, 101(1), pp 1-8 26 Morikawa M., Kagihiro S., Haruki M., Takano K., Branda S., Kolter R., Kanaya S (2006), “Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces gamma-polyglutamate” Microbiology, 152, pp 2801-2807 27 Nguyen QH., Nguyen TPL., Tran TH (2011) “Characterization of biofilmforming bacteria isolated from soil in Vietnam” VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 27(2S), pp 187-193 28 Nguyen QH and Tran TH (2011), “Isolate biofilm forming Bacillus strains from contamination site in trade villages in Vietnam” VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 27(2S), pp 157-162 29 O'toole GA., Gibbs KA., Hager PW., Phibbs PJ., Kolter R (2000), “The global carbon metabolism regulator crc is a component of a signal transduction pathway required for biofilm development by Pseudomonas aeruginosa” Journal of Bacteriology, 182(2), pp 425-431 30 O'Toole GA and Kolter R (1998), “Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development” Mol Microbiol, 30, pp 295-304 31 O'Toole GA., Pratt LA., Watnick PI., Newman DK., Weaver VB., Kolter R (1999), “Genetic approaches to study of biofilms” Methods Enzymol, 310, pp 91-109 32 Pamp SJ., Sternberg C., Tolker-Nielsen T (2009), “Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy”.Cytometry A,75(2), pp 90-103 Đoàn Diệu Linh 40 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 33 Romaní AM., Fund K., Artigas J., Schwartz T., Sabater S., Obst U (2008), “Relevance of polymeric matrix enzymes during biofilm formation” Microb Ecol, 56(3), pp 427-36 34 Steyn B (2005), “Proteomic analysis of the biofilm and biofilm - associated phenotypes of Pseudomonas aeruginosa cultured in batch” PhD dissertation, The Faculty of Natural and Agricultural Sciences, University of Pretoria, Pretoria 35 Stoodley P., Sauer K., Davies DG., Costerton JW (2002), “Biofilms as complex differentiated communities”.Annu Rev Microbiol, 56, pp 187-209 36 Sutherland IW (2001), “The biofilm matrix - an immobilized but dynamic microbial environment”.Trends Microbiol, 9(5), pp 222-227 37 Haggag WM and Timmusk S (2008), “Colonization of peanut roots by biofilm-forming Paenibacillus polymyxa initiates biocontrol against crown rot disease” J Appl Microbiol, 104, pp 961-969 38 William C., Richard V., Mark S., Mark P., Christopher P., Garth E (2003), “The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections”, J Clin Invest, 112, pp 1466-1477 Website 39 http://www.biofilm.montana.edu 40 http://www.en.wikipedia.org/wiki/Biofilm Đoàn Diệu Linh 41 K53A Sinh học [...]... mô đề tài khóa luận, chúng tôi phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu nƣớc thải có khả năng hình thành màng sinh vật nhằm bƣớc đầu nghiên cứu ứng dụng trong vấn đề xử lý nƣớc thải giàu nitơ Đoàn Diệu Linh 14 K53A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu Với mục tiêu phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng. .. L1.7 L1.8 L1.9 L1.10 Các chủng vi sinh vật phân lập từ đầm nuôi tôm Hình 7 B Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc thải đầm nuôi tôm Dựa vào kết quả trên hình 7A, 7B, từ 22 chủng vi khuẩn phân lập từ môi trƣờng Winogradski 2 chúng tôi cũng tiếp tục sàng lọc đƣợc 3 chủng vi khuẩn ký hiệu lần lƣợt là L1.5, L1.1 và H1.4 có khả năng tạo màng sinh vật tốt với giá trị OD570... quả phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm Từ ba nguồn mẫu nƣớc thải, sau khi nuôi cấy trên các môi trƣờng phân lập Winograski 1 và 2, chúng tôi đã phân lập đƣợc 66 chủng vi sinh vật Trong đó có 44 chủng đƣợc phân lập từ môi trƣờng Winograski 1, 22 chủng còn lại đƣợc phân lập từ môi trƣờng Winograski 2 (Hình 5, Bảng 3) A B Hình 5 Khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ môi trƣờng... các chủng vi sinh vật trôi nổi để xử lý nƣớc thải thì công nghệ xử lý sinh học nƣớc thải bằng màng sinh vật mang lại nhiều lợi ích đáng kể Một là, mật độ các chủng vi sinh vật trong màng sinh vật cao hơn nhiều, tạo điều kiện xử lý tối đa nguồn nƣớc thải Hai là, ngoài vi c loại bỏ các chất không mong muốn trong nƣớc thải thì quá trình tiếp theo là loại bỏ các vi sinh vật này khỏi môi trƣờng Đối với các. .. lập từ đầm nuôi tôm Hình 6 C Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc thải đầm nuôi tôm Đối với các chủng vi sinh vật phân lập từ hầm biogas và đầm nuôi tôm, chúng tôi cũng thực hiện những đánh giá tƣơng tự (Hình 6B, 6C), tuy nhiên không thu đƣợc chủng nào có khả năng hình thành màng sinh vật tốt Mật độ tế bào bám dính khi nuôi cấy trong điều kiện tĩnh không đáng kể... những nghiên cứu ứng dụng mạng lƣới màng sinh vật trong xử lý nƣớc thải đang thu hút sự quan tâm trên thế giới Đặc biệt vi c phân lập các chủng vi sinh vật vừa có khả năng phân hủy các hợp chất nitơ gây ô nhiễm đồng thời vừa có khả năng tạo màng sinh vật là một hƣớng nghiên cứu hứa hẹn đem lại nhiều tiềm năng cho vi c xử lý nƣớc thải Xuất phát từ thực tiễn đó Đoàn Diệu Linh 13 K53A Sinh học Khóa luận... 3.2.1 Chủng vi sinh vật phân lập trên môi trƣờng Winogradski 1 Mức độ phát triển 5 4 3 2 OD620 1 OD570 0 Các chủng vi sinh vật phân lập từ khu tập trung rác thải Hình 6 A Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc thải khu tập trung rác thải làng nghề Vạn Phúc Từ kết quả trên đây cho thấy có thể thấy trong số 12 chủng vi sinh vật phân lập tại khu tập trung rác thải làng... khả năng hình thành và phát triển màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp nhuộm tím kết tinh [26] Bằng phƣơng pháp này chúng tôi đã bƣớc đầu đánh giá đƣợc khả năng hình thành màng sinh vật của 66 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ các địa điểm lấy mẫu Kết quả nghiên cứu đánh giá khả năng phát triển và tạo màng sinh vật đƣơc thể hiện trên các hình dƣới đây (Hình... trường nuôi cấy Các chủng vi sinh vật có hoạt tính tạo màng sinh vật sau khi đƣợc lựa chọn sẽ đƣợc nghiên cứu khả năng phát triển trong các điều kiện pH môi trƣờng khác nhau Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành quan sát đánh giá khả năng tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật bằng cách đo độ hấp thụ OD570 theo phƣơng pháp của Morikawa và cộng sự [26] Các giá trị pH môi trƣờng đƣợc lựa chọn nghiên... sinh vật tốt ở nhiều mức pH khác nhau, còn lại hầu hết các chủng vi sinh vật đều có khả năng tạo màng sinh vật tốt ở điều kiện pH 7 Ở giá trị pH 4 và pH 9 hầu nhƣ sự phát triển và hình thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật đều thấp hơn hẳn Đối với chủng L1.1 và chủng L1.5, khả năng hình thành màng sinh vật tốt ở khoảng từ giá trị pH từ 7 đến 8 Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu của Vijaya