Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn acetobacter xylinum có khả năng tạo màng bacterial cellulose có đặc tính dai mỏng

NGUYỄN THỊ LAN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BACTERIAL CELLULOSE CÓ ĐẶC TÍNH DAI MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sin

NGUYỄN THỊ LAN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI

KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CÓ

KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BACTERIAL CELLULOSE CÓ ĐẶC TÍNH DAI MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội – 2011

MỤC LỤC

Trang

PHẦN MỞ ĐẦU

PHẦN NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí và đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum

1.2 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose 7

1.2.2 Cơ chế hình thành màng bacterial cellulose 8

1.3 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới 9

và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam 11

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vi sinh vật 12 2.1.2 Thiết bị và hoá chất 12 2.1.3 Môi trường 13

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Acetobacter 13

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái – nuôi cấy của các chủng A.xylinum 14

2.2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi 14

2.2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [1] 14

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng Acetobacter xylinum 15

2.2.3.1 Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase [11] 15

2.2.3.2 Phương pháp kiểm tra khả năng oxy hoá

rượu ethanol thành acid acetic [11] 15

2.2.3.3 Xác định khả năng oxy hoá acid acetic [11] 15

2.2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp cellulose 16

2.2.4 Phương pháp xác định trọng lượng khô của màng BC 19

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng thấm hút nước của màng BC (g/100cm 2 ) 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng Acetobacter xylinum 17

3.1.1 Làm giàu mẫu nguyên liệu 18

3.1.2 Phân lập vi khuẩn Acetobacter 19

3.1.3 Tuyển chọn các chủng A.xylinum tạo màng Bacterial Celullose (màng BC) 21

3 2 Tuyển chọn các chủng có khả năng tạo

màng BC dai, mỏng 24 3.3 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng

3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào học của các

3.3.2 Đặc điểm nuôi cấy của các chủng Acetobacter xylinum 28

3.3.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng

DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU

HÌNH Trang

Hình 1.2 Sợi cellulose của màng BC và sợi cellulose của thực vật 7

Hình 1.3 Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum 9

Hình 3.1 Qui trình phân lập vi khuẩn A.xylinum 17

Hình 3.2 Một số mẫu màng thu được sau khi làm giàu nguyên liệu 19

Hình 3.3 Chuyển hóa ethanol thành acid acetic của vi khuẩn 20

Hình 3.5 Một số loại màng do các chủng vi khuẩn hình thành trên bề mặt môi trường dịch thể 23

Hình 3.6 Khả năng tạo màng cellulose của các chủng A.xylinum 23

Hình 3.7 Các loại màng bacterial cellulose (BC) 26 Hình 3.8 Hình dạng tế bào của hai chủng vi khuẩn A.xylinum 27

Hình 3.9 Khuẩn lạc A.xylinum 28

BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum 5 Bảng 1.2 Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter 6 ( so sánh với Pseudomonas ) Bảng 3.1 Một số đặc tính của màng BC 25

Bảng 3.2 Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum 28

Bảng 3.3 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng R1 và B4 30

Bảng 3.4 Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của 2 chủng R1 và B4 31

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng

của chủng R1 và B4 32

Cộng sự Công ty

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hàng ngày Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn để lại di chứng đến khả năng vận động, thẩm mĩ và sức khỏe của người bệnh Ở Việt Nam, riêng viện bỏng quốc gia Hà Nội mỗi năm tiếp nhận khoảng 3000 bệnh nhân bỏng do đủ các nguyên nhân và mức độ khác nhau Hơn nửa số bệnh nhân bỏng là trẻ em và

¼ số bệnh nhân nhập viện bị bỏng sâu TS Nguyễn Viết Lượng trưởng phòng hành chính tổng hợp đồng thời là người điều hành các đề tài nghiên cứu của Viện Bỏng Quốc gia cho biết: “Trước đây những ca bỏng sâu rất dễ tử vong

do hồi đó thiếu những loại thuốc đặc hiệu Thuốc nhập khẩu rất hiếm và đắt”

Nếu bệnh nhân bị bỏng nhẹ, diện tích vết bỏng nhỏ các tế bào xung quanh tự phát triển dần phủ kín vết thương Nhưng nếu là vết bỏng sâu thì buộc phải cấy ghép da Song song với việc cấy ghép da là việc tìm kiếm các loại da tự thân, da dị loại và các loại màng sinh học thay thế da tạm thời trong điều trị Mặc dù da tự thân là vật liệu lí tưởng nhưng trong nhiều trường hợp không đủ đáp ứng hoặc thể trạng bệnh nhân không cho phép lấy… Việc tìm kiếm các loại da dị loại và màng sinh học thay thế cho da tạm thời đã trở thành phương pháp hiệu quả hơn cả Tuy nhiên các loại da dị loại như da ếch tươi, đông khô; da lợn tươi, đông lạnh lại có những nhược điểm nhất định như việc sử dụng ở thế bị động, bảo quản và xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng Chính vì vậy, vật liệu che phủ tạm thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan trọng trong điều trị bỏng Một trong các loại màng sinh học đã và đang được quan tâm ngày nay

là màng cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn có cấu trúc hoá học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng lại có một số tính chất hoá lý đặc biệt như độ bền cơ học, khả năng

thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer lớn rất thích hợp làm màng trị bỏng Thế giới đã có nhiều nghiên cứu về màng trị bỏng từ cellulose vi khuẩn Ở Việt Nam các nghiên cứu về vấn đề này còn rất

ít, mới chỉ có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh (2008) và nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung (2009) được công bố Các loại màng trị bỏng của chúng ta hiện nay phần lớn là nhập ngoại với giá rất đắt đỏ

Từ những lí do nói trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu:

“ Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng Bacterial Cellulose ( màng BC ) có đặc tính dai, mỏng”

2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum (A.xylinum) từ một

số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam

- Tuyển chọn các chủng A.xylinum đã phân lập có khả năng tạo màng

Bacterial Cellulose dai, mỏng

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng đã tuyển chọn

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum

- Tuyển chọn các chủng A.xylinum có khả năng tạo màng Bacterial

Cellulose (BC) dai, mỏng

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng A.xylinum

4 Ý nghĩa của đề tài

- Đề tài nghiên cứu lựa chọn các chủng A.xylinum có khả năng tạo

màng BC dai mỏng Có triển vọng ứng dụng trong chế tạo màng trị bỏng

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí và đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum trong sinh giới:

1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum

Tên gọi: Acetobacter xylinum là một tên gọi chính thức theo hệ thống

danh pháp quốc tế 1990

Năm 1957, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology”

A.xylinum được xếp vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes [13].

Đến năm 1974, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology”,

A.xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc [14].

Năm 1984 Theo Bergey [4], Acetobacter xylinum được xếp vào chi

Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae Họ vi khuẩn này gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter.

Ngày nay, đã tồn tại nhiều quan điểm khác nhau trong việc phân loại vi

khuẩn acetic nói chung và A.xylinum nói riêng Vấn đề này vẫn đang gây

nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những nghiên cứu tiếp theo

1.1.2 Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum

* Đặc điểm hình thái - tế bào học

A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng

2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn có chứa hemicellulose

Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,

hoá dị dưỡng Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước

ép hoa quả, trong đất

* Đặc điểm nuôi cấy

Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc

nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường Vi

khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng

sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC [18] Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [13]

*Đặc điểm sinh lý – sinh hoá

+ Đặc điểm sinh lý

Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH = 4 - 6 Nhiệt độ

và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay

cả trong môi trường tối ưu Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn

A.xylinum sinh trưởng và tạo màng

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn A.xylinum [36]

1m

A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm

acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ

+ Đặc điểm sinh hoá :

Năm 1950, Prateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn như: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [23]… Theo quan

điểm này, A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonas, bộ

Pseudomonadales, lớp Schizomycetes Đặc điểm phân biệt với các chủng khác

cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây:

Bảng1.1.Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum

+

2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí +

3 Sinh trưởng trên môi

trường Hoyer Sinh khối không phát triển _

4

Chuyển hoá

glycerol thành

dihydroxyaceton

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch

5 Chuyển hoá glucose

thành acid

Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường chứa CaCO3

+

6 Kiểm tra khả năng

sinh sắc tố nâu Không hình thành sắc tố nâu _

7 Kiểm tra khả năng

tổng hợp cellulose Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam +

Theo Bergey (1984) [4], Acetobacter xylinum được xếp vào chi

Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae Họ vi khuẩn này gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter Đặc điểm phân biệt giữa 2 chi được trình bày

trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter

( so sánh với Pseudomonas )

Đặc điểm Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas

1.2 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose

Cellulose cấu trúc màng BC có thành phần hóa học tương tự cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mạch thẳng, có đường kính sợi nhỏ hơn rất nhiều so với sợi cellulose của thực vật, đồng thời khả năng kết tinh cao (khoảng 60 %), độ polimer hóa lớn nên màng

BC có độ bền cơ học cao, khả năng thấm hút nước lớn [18] Đây là đặc tính

ưu việt hơn hẳn so với cellulose thực vật Khi quan sát trên kính hiển vi điện

tử thấy đường kính của sợi cellulose vi khuẩn chỉ bằng 1/100 của sợi cellulose thực vật.[35]

Do có những đặc điểm ưu việt như trên mà màng BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau Một trong các lĩnh vực đáng lưu ý đó là lĩnh vực y học Trong lĩnh vực này, màng BC được ứng dụng

để sản xuất màng trị bỏng [22],

Sợi cellulose của màng BC Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.2 Sợi cellulose của màng BC và sợi cellulose

của thực vật [35]

1.2.2 Cơ chế hình thành màng bacterial cellulose

*Vị trí tổng hợp

Vị trí tổng hợp cellulose của tế bào A.xylinum nằm giữa lớp màng

lipopolysaccharide và lớp màng sinh chất [34] Quan sát dưới kính hiển vi điện tử khi nhuộm âm bản và tiêu bản cho thấy: mỗi tế bào có 46 điểm tổng hợp cellulose Khoảng cách giữa mỗi điểm là 12 – 15nm, kích thước mỗi điểm là 3,5 nm Khi tế bào phân chia, các vị trí tổng hợp được phân bố đều vào hai tế bào con [29]

*Cơ chế tổng hợp

Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều

loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [11], [12]

Quá trình tổng hợp được diễn ra như sau:

Tại các điểm tổng hợp cellulose, nhờ có hệ thống các enzyme xúc tác

mà các phân tử đường được chuyển hóa thành các chuỗi  - 1,4 glucopyranose Vi khuẩn đẩy dài các chuỗi -1,4 glucopyranose từ một đầu,

các sợi này gọi là “sợi đẩy dài” ( H1.3 – 1 – 2 – 3 ) Tại một số điểm tổng

hợp cellulose khác nhau cũng hình thành các chuỗi  - 1,4 glucopyranose Các chuỗi mới hình thành liên kết với nhau và với “sợi đẩy dài” tạo thành sợi

nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm ( hình 1.3 – 4) Những sợi nhỏ kết tinh

tạo sợi lớn hơn – sợi vĩ mô, tiếp tục những sợi vĩ mô lại kết hợp với nhau để

tạo thành bó và cuối cùng tạo dải – ribbon ( H 1.3 – 5, H 1.3 – 6, H 1.3 – 7)

Kích thước của dải ribbon còn nhiều ý kiến chưa đồng nhất, nó có thể đạt từ 3-4 x 70-80 nm [33], 3,2x133 nm (Brown và cs, 2000) Những dải ribbon từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải ribbon khác bằng liên kết hydro hoặc liên kết Van de Van tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng [12], [19]

1.3 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới và ở Việt

Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới

Do có nhiều ứng dụng nên A.xylinum đã thu hút được rất nhiều sự quan

tâm của các nhà khoa học trên thế giới và đã có rất nhiều công trình nghiên cứu lớn nhỏ ở khắp các quốc gia

Hình 1.3 Sự hình thành những dải ribbon trong màng

BC của A.xylinum [22]

Những nghiên cứu về A.xylinum trên thế giới tập trung theo hai hướng

cơ bản:

*Hướng thứ nhất: chủ yếu là phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu các đặc

tính sinh học của A.xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng trong

sinh giới

Tiêu biểu là các nghiên cứu của Beijerinck [15], Prateur [23] trên

cơ sở nghiên cứu các đặc tính hình thái, nuôi cấy, sinh lý-sinh hóa Các tác

giả đã xác định nguồn gốc, đặc điểm phân loại của A.xylinum

Theo các nghiên cứu này, A.xylinum được xếp vào những nhóm phân loại khác nhau Có quan điểm cho rằng: A.xylinum thuộc chi Acetobacter, họ

Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes; có những quan

điểm lại coi Acetobacter xylinum như một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc Gần đây nhất là quan điểm xếp A.xylinum vào chi Gluconacetobacter, họ

Acetobacteraceae Vấn đề này còn gây nhiều tranh cãi Vì thế mặc dù là

hướng nghiên cứu truyền thống nhưng ngày nay nó vẫn thu hút được nhiều nhà khoa học đi theo hướng này

*Hướng thứ hai: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm

cũng như ứng dụng của bacterial cellulose vi khuẩn A.xylinum

Đây là hướng nghiên cứu chủ yếu nhất Các nghiên cứu trong hướng này khai thác những khía cạnh khác nhau của quá trình tổng hợp, đặc điểm

cũng như ứng dụng của bacterial cellulose vi khuẩn A.xylinum

Điển hình là một số công trình nghiên cứu của một số tác giả như: M Schramm và cộng sự [24].[30],[31] đã nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng hình thành màng BC; Neelobon Suwannapinunt và cộng sự (2007) nghiên cứu đặc tính vật lý của màng BC [28]; nghiên cứu về gen sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum có công trình nghiên cứu của các tác

giả như C Wong và cộng sự (1990) [32], Dag H Coucheron (1991; 1993) [20], [21]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam

Ở Việt Nam những vấn đề nghiên cứu về A.xylinum và màng BC trong điều trị bỏng là khá mới mẻ Có rất ít các nghiên cứu liên quan đến A.xylinum,

sự hình thành màng và ứng dụng của màng Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu về quá trình tạo màng, đặc tính, cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng : nhóm nghiên cứu của PGS.TS Nguyễn Văn Thanh và ThS Huỳnh Thị Ngọc Lan (2006) đã tuyển chọn chủng có khả năng tạo màng trị bỏng có màu trắng với độ dày 0,5mm và có kích thước khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng; nhóm nghiên cứu của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung khi tiến

hành khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn Acetobacter xylinum đã phân

lập tuyển chọn được 65 chủng vi khuẩn trong đó có chủng BHN2 có triển vọng ứng dụng tốt

Ngoài ra còn có các nghiên cứu của các tác giả như:

Nguyễn Thúy Hương (2006) đã nghiên cứu chọn lọc dòng A.xylinum

thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn

Nguyễn Thị Nguyệt (2008) đã nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum cho

màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da,

Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) đã nghiên cứu đặc tính sinh học và khả

năng tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn A.xylinum và đã phân lập được

14 chủng từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam

Màng Bacterial Celullose có vai trò quan trọng trong điều trị bỏng Chính vì vậy việc nghiên cứu các chủng có khả năng tạo màng BC tốt nhất đáp ứng được yêu cầu trong điều trị bỏng sẽ có ý nghĩa thực tiễn rất lớn

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

- Chủng BHN2 do PTN Vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp

2.1.2 Thiết bị và hoá chất

2.1.2.1 Thiết bị

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

Nồi hấp Tommy (nhật)

Box vô trùng (Haraeus)

Máy lắc TEIO TECH (Hàn Quốc)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)

Kính hiển vi quang học LABOMED ( Mỹ)

- Agar ( Cty TNHH Hải Long – Hải Phòng)

- Rượu ethanol, acid acetic ( Cty hóa chất Đức Giang - Hà Nội)

- Dihyroxyaceton, Blue Bromophenol 0.04% (xuất xứ: Trung Quốc) -,Pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNO2, H2SO4 (xuất xứ: Trung Quốc)

- KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaCl, NaOH (xuất xứ: Trung Quốc)

- Lugol, Fucshin, Tím Gentian, Phenolphtalein (xuất xứ: Trung Quốc)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Acetobacter

Phân lập vi khuẩn theo phương pháp của Winogradski và Beijerinck [11] – Phân lập sau khi đã làm giàu

Nguồn vật liệu: Mẫu màng lên men giấm tự nhiên từ các nguồn bia hơi

Hà Nội, rượu vang, dịch quả (chuối), nguồn vô cơ (saccharose và ethanol)

Tiến hành phân lập: Vớt mẫu màng đã được rửa qua cho vào ống

nghiệm chứa nước cất thanh trùng Lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút thu được huyền phù vi sinh vật Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-12 Dùng pipet hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng 10-3 đến

10-12 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp Petri, dùng que chang chang đều Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 5-7 ngày Dựa vào

sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 40C Để tiện cho việc tuyển chọn, chúng tôi tạm gọi mỗi khuẩn lạc được tách ở trên là một chủng vi khuẩn acetic

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái – nuôi cấy của các

chủng A.xylinum

2.2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi

Làm tiêu bản các chủng vi khuẩn theo phương pháp nhuộm Gram Sau

đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus CH-2 với độ phóng đại 1000 lần

2.2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [1]

Cấy các chủng vi khuẩn nghiên cứu lên các hộp petri có chứa môi trường đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C Sau 7 ngày quan sát khuẩn lạc của các chủng Khi miêu tả khuẩn lạc cần ghi nhận các đặc điểm sau đây:

- Hình dạng khuẩn lạc: Tròn, dạng amip, dạng rễ cây, dạng không đều

- Đặc tính quang học: Trong, bán trong, không trong, lóng lánh, đục, huỳnh

quang

- Màu sắc: Ghi màu sắc khuẩn lạc và xem có tiết sắc tố vào môi trường hay

không

- Bề mặt: Bóng, xù xì, gấp nếp, gồ ghề

- Cấu trúc khuẩn lạc: Đồng nhất, dạng hạt nhỏ, dạng hạt lớn

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng

Acetobacter xylinum

2.2.3.1 Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase [11]

Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +) Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -)

2.2.3.2 Phương pháp kiểm tra khả năng oxy hoá rượu ethanol thành acid acetic [11]

Nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường bao gồm:

Cao nấm men: 10g Rượu ethanol : 10%-15% (vol/vol)

Nước máy: 1000ml pH : 6,8-7.0

Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%: 20ml

Phân phối môi trường vào các ống nghiệm (4-5ml), khử trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội khoảng 30oC cấy vi khuẩn nghiên cứu mới hoạt hoá, nuôi 7 ngày trong điều kiện thích hợp Quan sát thấy môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính, không đổi màu là âm tính

2.2.3.3 Xác định khả năng oxy hoá acid acetic [11]

Sử dụng môi trường sau để khử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn

Thành phần: Cao nấm men: 10g Calcium acetate: 10g

Thạch: 20g Nước máy: 1000ml

pH : 7,0-7,2 Phân phối môi trường vào bình tam giác đem khử trùng ở 121oC trong

20 phút, để nguội khoảng 40-45oC đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới hoạt hoá (18-24h) nuôi 6-7 ngày ở điều kiện thích hợp Quan sát hiện tượng: