Chi Acetobacter bao gồm nhiều loài khác nhau như Acetobacter aceti, Acetobacter kiitzingianum, Acetobacter linderni, Acetobacter acetosum,
Acetobacter suboxydans...11. Trong đó có một số loài cũng hình thành lớp màng hoặc lớp váng trên bề mặt môi trường lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, lớp màng này rất dễ nhầm với màng Bacterial Cellulose do vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo ra. Ví dụ như Acetobacter schiitzenbachii có khả năng tạo váng dày không bền vững; Acetobacter kiitzingianum tạo màng xếp nếp to trên các môi trường lỏng; Acetobacter pasteurianum tạo váng khô và nhăn nheo...11 Vì thế để tuyển chọn được các chủng Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng BC từ các chủng Acetobacter đã phân lập được ở trên cần tiến hành theo các bước như sau:
Bước 1: Khảo sát khả năng tạo màng BC của các chủng Acetobacter đã phân lập trên môi trường 3. Tiến hành nuôi cấy 8 chủng vi khuẩn Acetobacter
trong môi trường dịch thể ở nhiệt độ 300C và theo dõi khả năng tạo màng BC của các chủng. Kết quả có 6 chủng hình thành màng trên môi trường lỏng với những tính chất, đặc điểm và thời gian hình thành màng khác nhau là: R1, B1, B4, B5, VC1, C1.
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
Bước 2: Kiểm tra bản chất cellulose của màng theo phương pháp 2.2.3.4: Nhỏ lugol và H2SO4 60% vào màng tạo trên môi trường dịch thể của 6 chủng vi khuẩn trên. Nếu màng có bản chất là cellulose nó sẽ chuyển hoá thành màu xanh (phản ứng của hemicellulose).
Hình 3. 5. Khả năng tạo cellulose của các chủng
A.xylinum
Hình 3. 4. Một số loại màng do các chủng vi khuẩn hình thành trên bề mặt môi trường dịch thể
Mỏng Váng màng
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
Kết quả trong 6 chủng Acetobacter có 3 chủng có khả năng hình thành màng BC. Cụ thể:
- Rượu vang: R1 - Bia Hà Nội: B4. - Nguồn vô cơ : VC1
Ngoài ra, kiểm tra thêm một số đặc tính sinh hoá khác của 3 chủng
Acetobacter nói trên như hoạt tính catalase, chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton, khả năng sinh sắc tố nâu... 11 có thể tạm khẳng định các chủng này đều là Acetobacter xylinum.
3. 2. Tuyển chọn các chủng có khả năng tạo màng BC dai, mỏng
Chúng tôi sử dụng môi trường 3 để khảo sát khả năng tạo màng của 3 chủng: Đây là môi trường dùng nước dừa để thay thế cho nước thường là môi trường sinh dưỡng rất thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như khả năng tạo màng của các chủng Acetobacter xylinum vì nó chứa nhiều yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng của tế bào (vitamin, acid amin và các nhân tố khoáng).
Nuôi cấy các chủng R1, B4, VC1 trên môi trường dịch thể có chứa nước dừa (MT3) ở nhiệt độ phòng (mùa hè), quan sát khả năng tạo màng của các chủng. Sau 5 ngày quan sát một số đặc tính của màng. Kết quả thu được ở bảng 3.1.
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
Sự hình thành màng BC của 3 chủng vi khuẩn này là khác nhau. Màng BC của 3 chủng có độ dày mỏng và đặc tính rất khác nhau. Trong thực tiễn, chúng được dùng với nhiều mục đích khác nhau. Song mục đích của chúng tôi là nghiên cứu màng BC trong điều trị bỏng, cần lựa chọn được loại màng có độ mỏng và dai tốt nhất phù hợp với việc điều trị. Chính vì thế loại màng do chủng VC1 tạo ra sẽ không được lựa chọn. Chỉ còn B4 và R1 được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hai chủng này đem so sánh với BHN2 thì hiệu quả tạo màng và đặc điểm màng gần giống nhau.
Bảng 3. 1. Một số đặc tính của màng BC Màng BC Khối lượng (g/l) (**) Độ dày (mm) Khả năng thấm nước (g/100cm3) Đặc điểm màng VC1 5,90 0,6 – 0,7 10,01 Màng mỏng, dễ rách, màng hình thành từ ngày thứ 3 B4 3,67 0,8 - 1,3 11,03 Màng mỏng, dai, bề mặt nhẵn ẩm, màng hình thành từ ngày thứ 3 R1 4,50 1,2 - 1,5 12,40 Màng khá dày, dai, màng hình thành từ ngày thứ 2 BHN2 6,80 2,0 - 4,0 14,06 Màng dày, dai, nhẵn, màng hình thành từ ngày thứ 2
(**) Khối lượng khô trung bình của màng BC
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
Hình 3. 7 Các loại màng bacterial cellulose (BC)
B4
R1 VC1
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
3. 3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng Acetobacter xylinum đã tuyển chọn
3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào học của các chủng Acetobacter xylinum
Quan sát hình dạng tế bào của 2 chủng A.xylinum đã phân lập ở trên kính hiển vi LABOMED với độ phóng đại 100 lần. Kết quả nghiên cứu cho thấy hình dạng tế bào của 2 chủng vi khuẩn như sau:
Nhận thấy, các chủng B4, V1 và BHN2 đều có hình que đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động, bắt màu hồng của Fucshin. Mặt khác, các tế bào vi khuẩn dài, có kích thước khoảng 1 - 2m. Điều này có thể giải thích do chúng cùng thuộc loài Acetobacter.
B4
Hình 3. 8. Hình dạng tế bào của các chủng vi khuẩn A.xylinum
R1
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
3.3.2. Đặc điểm nuôi cấy của các chủng Acetobacter xylinum
Khi phát triển trên bề mặt các môi trường đặc thì vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng sẽ hình thành các khuẩn lạc đặc trưng của loài đó. Vì vậy việc miêu tả khuẩn lạc là một trong những việc cần thiết khi nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn. Đặc điểm của khuẩn lạc của 2 chủng được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3. 2. Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum
Đặc điểm
khuẩn lạc Hình dạng
Đặc tính
quang học Màu sắc Bề mặt Cấu trúc
B4 Tròn có vành Đục Vàng sẫm Bóng Dạng hạt nhỏ R1 Tròn Bán trong Vàng sẫm Bóng Dạng hạt nhỏ BHN2 Tròn có vành Đục Vàng sẫm Bóng Dạng hạt lớn
Hình 3. 9 Khuẩn lạc vi khuẩn A.xylinum
CHỦNG R1 CHỦNG B4
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
Khi sinh trưởng trên bề mặt môi trường đặc 2 chủng vi khuẩn
A.xylinum đã phân lập hình thành các khuẩn lạc khác nhau: khuẩn lạc của chủng B4 có dạng hạt lớn, tròn có vành, màu vàng sẫm và bề mặt nhẵn bóng. Chủng R1 khuẩn lạc lại có dạng hạt nhỏ, tròn, màu vàng sẫm và bề mặt nhẵn bóng. Tốc độ sinh trưởng của 2 chủng này cũng khác nhau: R1 (5- 7 ngày), B4 (3- 4 ngày). Nguyên nhân của sự khác nhau này có thể giải thích là do các chủng nghiên cứu được phân lập từ đa dạng các nguồn vật liệu khác nhau (R1 phân lập từ rượu vang, B4 phân lập từ bia do vậy chủng B4 có đặc điểm khuẩn lạc khá giống với BHN2 chỉ khác là cấu trúc khuẩn lạc nhỏ hơn).
3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng Acetobacter xylinum 3.3.3.1. Khả năng đồng hoá nguồn cacbon của các chủng Acetobacter xylinum
Vi sinh vật được đặc trưng bởi khả năng sử dụng không giống nhau các loại hydrat carbon và rượu khác nhau. Khi nghiên cứu đa số các vi sinh vật dị dưỡng cần phải xác định những nguồn hydrat carbon và rượu nào đảm bảo được cho loại vi sinh vật cần nghiên cứu phát triển và những biến đổi gì sẽ xảy ra trong môi trường khi chúng phát triển 11.
Để khảo sát khả năng đồng hoá nguồn cacbon của các chủng
Acetobacter xylinum đã phân lập chúng tôi sử dụng các nguồn sau đây: Glucose, saccharose, ethanol. Tiến hành thí nghiệm trên 2 chủng Acetobacter xylinumR1, B4. Nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn nói trên trong môi trường dịch thể (môi trường 3) có thay đổi nguồn carbon khác nhau. Nuôi trong điều kiện tĩnh ở nhiệt độ 300C, sau 3-4 ngày kiểm tra sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn, pH môi trường sau lên men. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3.
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
Bảng 3. 3. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng R1 và B4 so sánh
với chủng BHN2
Chủng Glucose Saccharose Ethanol
R1 + + +
B4 + + +
BHN2 + + +
(+) : sinh trưởng rất tốt
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy khả năng đồng hoá nguồn cacbon của các chủng nghiên cứu là giống nhau.
Theo dõi sự biến đổi pH môi trường trước và sau lên men ta thấy hầu hết các chủng đều làm acid hoá môi trường, pH môi trường sau lên men giảm do lượng acid acetic tích luỹ trong dịch lên men 11.
3.3.3.2. Khả năng đồng hoá nguồn nitơ của các chủng Acetobacter xylinum
Tiếp tục khảo sát khả năng đồng hoá nguồn nitơ của 2 chủng A.xylinum
kể trên.
Nguồn Nitơ sử dụng bao gồm: + Nguồn nitơ hữu cơ: pepton.
+ Nguồn nitơ vô cơ: Amon ( (NH4)2SO4); Nitrat ( NaNO3); Nitrit ( NaNO2). Cấy 2 chủng nghiên cứu lên môi trường dịch thể (môi trường 3) có thay đổi nguồn nitơ khác nhau. Nuôi trong điều kiện tĩnh ở nhiệt độ 300C. Sau 3-4 ngày kiểm tra sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn trong mỗi mẫu thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4.
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
Bảng 3.4. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của 2 chủng R1 và B4 so sánh với chủng BHN2
Chủng Pepton Amon Nitrat Nitrit
R1 ++ + - -
B4 ++ + + -
BHN2 ++ + + -
Chú thích: + + : Sinh trưởng rất tốt + : Sinh trưởng yếu - : Không sinh trưởng
Nhận thấy 2 chủng phân lập được và củng BHN2 đều sinh trưởng rất tốt trong môi trường có chứa nitơ hữu cơ, sinh trưởng yếu hơn trong môi trường có chứa nitơ vô cơ. Hầu hết 2 chủng nghiên cứu đều không có khả năng sử dụng nguồn nitơ là nitrit. Kết quả cho thấy không có sự khác nhau nhiều về khả năng sử dụng nguồn nitơ của 2 chủng A.xylinum phân lập từ các nguồn vật liệu khác nhau cũng như các chủng A.xylinum có hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc khác nhau.
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng R1 và B4
Tiến hành cấy 2 chủng trên trên môi trường thạch nghêng. Nuôi ở nhiệt độ 27 – 350C ( nhiệt độ phòng), 200C ( điều hòa), 450C (tủ ấm). ( mỗi chủng sử dụng 2 ống nghiệm / 1 nhiệt độ). Sau 4 – 5 ngày ta lấy ra để quan sát bằng mắt thường mức độ phát triển của các chủng. Sau đó lại cấy trên thạch nghiêng lần thứ 2, nguyên liệu dùng để cấy là các tế bào của lần cấy thứ nhất. Sau đó lại nuôi ở các nhiệt độ khác nhau kể trên. Sau 4 – 5 ngày tiếp tục lấy ra quan sát mức độ sinh trưởng bằng mắt thường. Theo dõi các mức độ: không
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
sinh trưởng, sinh trưởng yếu, sinh trưởng tốt. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3. 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng R1 và B4 so vói BHN2
Chủng 200C 27 - 350C 450C
R1 + ++ -
B4 - ++ -
BHN2 + ++ -
(-): không sinh trưởng (+): sinh trưởng yếu (++): sinh trưởng tốt
Nhận thấy 2 chủng phân lập và chủng BHN2 đối chứng trên đều sinh trưởng tốt ở nhiệt độ phòng (27- 350C), không thể sinh trưởng được ở nhiệt độ 450C. Ở nhiệt độ 200C chỉ có chủng R1 và BHN2 sinh trưởng được nhưng với tốc độ rất chậm.
Như vậy, có thể kết luận được: các chủng A.xylinum phân lập được thuộc loại ưa ấm, sinh trưởng tốt nhất trong khoảng nhiệt độ từ 27- 350C.
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Từ 4 nguồn nguyên liệu đã phân lập được 6 chủng có khả năng hình thành màng trên môi trường lỏng.
- Trong 6 chủng phân lập được 2 chủng ( R1; B4) có khả năng hình tạo màng BC dai, mỏng.
- Hai chủng này có các đặc điểm hình thái: tế bào có dạng hình que, hoặc hình elip, đứng độc lập hay xếp thành từng chuỗi. Khuẩn lạc có hình tròn, màu vàng sẫm, bề mặt nhẵn bóng. Chúng có thể sinh trưởng tốt trên môi trường có nguồn cacbon là glucose, saccharose , ethanol và ở nguồn nitơ hữu cơ thì sinh trưởng tốt hơn nguồn nitơ vô cơ. Chúng có thể sinh trưởng tốt ở nhiệt độ từ 27 – 350C.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy tới khả năng tạo màng BC của hai chủng R1 và B4.
- Nghiên cứu đặc điểm màng BC từ 2 chủng R1 và B4 bước đầu ứng dụng chế tạo màng trị bỏng.
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Lân Dũng (1976). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1- 2- 3, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội.
2.Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990).Thực hành vi sinh vật. Nxb giáo dục, tr. 17-34, 63-74, 89-92.
3.Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990).Thực hành vi sinh vật. Nxb giáo dục, tr. 17-34, 63-74, 89-92.
4.Vũ Thị Minh Đức (2001). Thực tập vi sinh vật. Nxb ĐHQG Hà Nội, tr. 1- 50.
5. Đặng Thị Hồng (2007), phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học, Luận văn thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội.
6. Huỳnh Thị ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh. Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng. số 361, Tạp chí dược học số 361, 2006.
7. Nguyễn Thị Nguyệt, Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da. Luận văn Thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2008.
8. Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng chúng trong lên men acidacetic theo phương pháp chìm, Luận án Tiến sỹ Sinh học. Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội.
9. Lương Đức Phẩm. Công nghệ vi sinh vật. Nxb Nông nghiệp, 2004, tr. 1 – 143.
10. Trần Linh Thước (2006). Phương pháp phân tích vi sinh vật. Nxb giáo dục, 2006, tr. 1- 29, 40- 69.
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
11.Nguyễn Thị Thùy Vân(2009).Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSP Hà Nội.
12. Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005). Polysaccharides and polyamides in the food industry, www.wiley..vch. pp. 31-85.
13.Alina Krystynowicz, Marianna Turkiewicz, Stanislaw Bielecki, Emilia Klemenska, Aleksander Masny, Andrzej Plucienniczak (2005). Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum, Acta biochimica polonica, Vol. 52, pp. 691-698.
14. Barbara Surma – S’lusarska, Sebastion, Presler, Dariusz Danielewicz (2008) Characteristics of Bacterial Cellulose Obtained from Acetobacter xylinum culture
for applycation in papermarking. FIBRES TEXTILES in Eastem Europe, vol.16, No.4,pp.108 – 111.
15. Breed R.S., Murray E.G.D, Smith N.R (1957). Bergey’s manual of determinative bacteriology. The Williams and Wilkins company, Baltimore.
16. Brown R.M. (1999), “Cellulose structure and biosynthesis”, Pure Appl. Chem. 71 (5), p. 765-775.
17 . Brown R.M. (1999), Microbial c as a building block resource for specialty product and processes there fore, PCT Int. Appl. Wo 8912107 Al.
18. Bungay H.R, Improved production of microbial cellulose, Email:
bungah@rpi.edu
19. Bworn E. (2007) Bacterial Cellulose – Thermoplastic polime nanocomposites, Master of scien in chemical engineering, Washington state university.
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
20. Coucheron D.H. (1991), “An Acetobacter xylinum insertion sequence element associated with inactivation of cellulose production”, Journal of bacteriology, pp.5723 – 5731.
21. Coucheron D.H. (1993), “A family of IS 1030 element in the genome of
Acetobacter xylinum: nucleotide sequences and strain distribution”, Molecular microbiology, Vol. 9(1), pp. 211-218.
22. Elvie Escoro Brown (2007). Bacterial cellulose thermoplastic polymer nanocompositer. Master of science in chemical engneering, Washington state university, Department of chemical engineer,pp.1-6.
23. Frateur J. (1950). Essai sur la systématique des Acétobacter. La cellule, Vol. 53, pp. 278-398.
24. Gromet Z., Hestrin S. (1962), “Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum”, J. Bacieriol, Vol.85, No. 2, pp. 284 – 292.
25. Jonas and Farah, 1998 R. Jonas and L.F. Farah, Production and application of microbial cellulose, Polymer Degradation and Stability 59 (1998), pp. 101–106. ...
26. Kadebe T.T., Miyanmoto T., Oniang K. R., Kutima M.P.O., Njoroge