Bước 1: Vớt mẫu màng, rửa qua bằng nước cất. Tiến hành phân lập vi khuẩn Acetobacter trên môi trường 1 theo phương pháp của Winogradski 1, [2].
Kết quả phân lập được 14 chủng, trong đó: - 3 chủng từ rượu vang ký hiệu R1, R2, R3.
- 5 chủng từ bia Hà Nội ký hiệu B1, B2, B3, B4, B5 - 4 chủng từ chuối ký hiệu C1, C2, C3, C4
- 2 chủng từ nguồn vô cơ ký hiệu VC1, VC2
Nhận thấy nhóm vi khuẩn acetic có khả năng hình thành màng trên môi trường dịch thể, do đó khi vớt mẫu màng rửa bằng nước cất vô trùng đã loại bỏ phần lớn vi sinh vật không mong muốn 11.Mặt khác môi trường 1 dùng để phân lập được acid hoá bằng acid acetic cũng góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác 11.
Bước 2: Từ các chủng đã phân lập được tiếp tục sơ tuyển Acetobacter
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
trong môi trường do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Cấy các chủng đã phân lập được lên môi trường 2, sau 5-7 ngày chọn những chủng có khả năng hình thành vòng phân giải canxi xung quanh khuẩn lạc ( kết quả thu được 11 chủng có khả năng phân giải CaCO3 là: R1, R2, R3,
C1, C2, B1, B3, B4, B5, VC1, VC2 )
Bước này chưa thể khẳng định được các chủng phân lập được này là vi khuẩn acetic. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic. (bước 3)
Bước 3: Từ các chủng đã chọn được ở bước 2 tiếp tục tiến hành tuyển chọn Acetobacter theo phương pháp của Carr 11.
Theo Bergey 11 vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter. Cả hai chi đều có khả năng oxy hoá rượu ethanol thành acid acetic. Acid acetic làm môi trường có chứa Blue Bromophenol 0.04% chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng (hình 3.3). Các chủng thuộc chi Acetobacter có khả năng phân giải tiếp tục acid acid acetic thành CO2 và H2O phục hồi màu xanh của môi trường. Ngược lại, các chủng thuộc chi Gluconobacter không có khả năng phân giải acid acetic nên môi trường vẫn giữ màu vàng.
Hình 3. 3 Chuyển hóa ethanol thành acid acetic của vi khuẩn acetic
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN
Hầu hết các chủng vi khuẩn đã phân lập được đều có khả năng oxy hoá rượu ethanol thành acid acetic (hình 3.3). Khả năng này mạnh yếu khác nhau tuỳ chủng. Hơn nữa các chủng đã phân lập được gồm 2 nhóm có tốc độ sinh trưởng khác nhau (nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh trưởng chậm) do đó việc theo dõi khả năng phục hồi màu xanh của môi trường để phân biệt 2 chi Acetobacter và Gluconobacter rất khó khăn, thiếu chính xác. Vì thế, sau bước 3 lựa chọn các chủng làm môi trường chuyển màu vàng và tiếp tục khảo sát khả năng oxy hoá acetate. ( Kết quả thu được 9 chủng có khả năng làm môi trường chuyển màu vàng là: R1, R2, R3, B1, B3, B4, B5, VC1, C1 )
Bước 4: Cấy các chủng đã tuyển chọn ở bước 3 lên môi trường có chứa canxi acetate (phương pháp 2.2.3.3). Theo Bergey, cả 2 chi Acetobacter
và Glucobacter đều có khả năng oxy hoá lactate nhưng chỉ có các vi khuẩn thuộc chi Acetobacter mới có khả năng oxy hoá acetate. Vì thế trong môi trường có chứa canxi acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cácbon hay nói cách khác chúng có khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O; giải phóng ATP cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào đồng thời giải phóng Ca2+ tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc 11 theo phương trình sau:
Ca(CH3COO)2 + O2 CaCO3 + CO2 + H2O
Kết quả thu được 8 chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter, họ
Acetobacteriaceae trong số 9 chủng vi khuẩn đã phân lập ở trên. Cụ thể là: R1, R2, R3, B1, B4, B5, VC1, C1.
Khóa luận tốt nghiệp K33 Khoa Sinh – KTNN