Giấy là một loại vật liệu được làm từ chất xơ dài từ vài mm cho đến vài cm, thường có nguồn gốc thực vật và thường được tạo thành mạng lưới bởi lực liên kết hidro không có chất kết dính. Thông thường giấy được sử dụng dưới dạng những lớp mỏng nhưng cũng có thể dùng để tạo hình các vật lớn. Trên nguyên tắc giấy được sản xuất từ bột gỗ hay bột giấy. Loại giấy quan trọng nhất về văn hóa là giấy viết. Bên cạnh đó giấy được sử dụng làm vật liệu bao bì, trong nội thất như giấy dán tường, giấy vệ sinh hay trong thủ công trang trí, đặc biệt là ở Nhật và Trung Quốc.Các nhà máy giấy và bột giấy sinh ra một lượng lớn nước thải và nếu không được xử lý thì có thể ảnh hưởng rất lớn đến môi trường.
PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 HIỆN TRẠNG SẢN XUẤT GIẤY 1.1.1 Tình hình sản xuất Giấy loại vật liệu làm từ chất xơ dài từ vài mm vài cm, thường có nguồn gốc thực vật thường tạo thành mạng lưới lực liên kết hidro khơng có chất kết dính Thơng thường giấy sử dụng dạng lớp mỏng dùng để tạo hình vật lớn Trên nguyên tắc giấy sản xuất từ bột gỗ hay bột giấy Loại giấy quan trọng văn hóa giấy viết Bên cạnh giấy sử dụng làm vật liệu bao bì, nội thất giấy dán tường, giấy vệ sinh hay thủ công trang trí, đặc biệt Nhật Trung Quốc [http://vietmyiat.vn/services_detail.asp?cat=3&pro=135] Tùy theo mục đích sử dụng khác sản phẩm giấy chia thành nhóm: Nhóm 1: Giấy dùng cho in viết (giấy in báo, giấy in viết, ) Nhóm 2: Giấy dùng cơng nghiệp (giấy bao bì, giấy chứa chất lỏng, ) Nhóm 3: Giấy dùng gia đình(giấy ăn, giấy vệ sinh, ) Nhóm 4: giấy dùng cho văn phòng (giấy fax, giấy in hóa đơn, ) Hiện Việt Nam sản xuất loại sản phẩm giấy in, giấy in báo, giấy bao bì cơng nghiệp thông thường, giấy vàng mã, giấy vệ sinh chất lượng thấp, giấy tissue chất lượng trung bình, loại giấy kỹ thuật điệnđiện tử, giấy sản xuất thuốc lá, giấy in tiền, giấy in tài liệu bảo mật chưa sản xuất [báo cáo tóm tắt ngành giấy ] 1.1.2 Quy trình sản xuất giấy Nguyên liệu thô dùng sản xuất giấy bột giấy Việt Nam gồm hai nguồn từ rừng (tre gỗ mềm) giấy tái chế Bột giấy dùng để sản xuất loại sản phẩm khác giấy viết, giấy bao bì, bìa cactong, khác Tuy ngiên pha trộn bột giấy tạo từ nguyên liệu thơ khác để có đặc tính mong muốn cho thành phẩm Quy trình sản xuất giấy: Hình 1.1: Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất giấy bột giấy kèm theo dòng thải [ ] a Chuẩn bị nguyên liệu thô Nguyên liệu thô sử dụng tre, loại gỗ mềm khác, giấy phế liệu tái chế, Trường hợp gỗ sau cân trọng lượng, gỗ xếp thành đống sân chứa sau mang cắt thành mảnh Với loại tre mỏng dùng máy cắt thành mảnh lưỡi, với loại dày dùng máy cắt có đĩa dao lưỡi Kích cỡ mảnh tạo từ 15 – 35mm Các mảnh to hay nhỏ bị loại Mảnh có khích cỡ phù hợp sau chuyển đến khu vực sản xuất bột giấy để nấu b Sản xuất bột Nấu: Nhìn theo phương diện hóa học, gỗ bao gồm: [ Việt mỹ] 40 – 50% cellulose 10 – 55%hemicellulose 20 – 30% lignin 0,3 – 0,8% hợp chất vô Các xơ tách khỏi lignin cách nấu với hóa chất nhiệt độ áp suất cao nồi nấu Quá trình nấu thực theo mẻ với kiềm NaOH nước Sau nấu, chất năm nồi nấu xả nhờ áp suất vào tháp phóng Bột thường chuyển qua sàng để tách mấu trước rửa Rửa: Trong trình rửa, bột từ tháp phóng sàng mấu rửa nước Dịch đen lỗng từ bột loại bỏ q trình rửa chuyển đến q trình thu hồi hóa chất Bột tiếp tục rửa bể rửa Quá trình rửa kéo dài khoảng – Tẩy trắng: công đoạn thực nhằm tạo độ sáng độ trắng cho bột giấy Loại lượng hẩy tra chất sử dụng phụ thuộc vào loại sản phẩm sản xuất từ bột giấy Có bước tẩy trắng bột truyền thống là: Bước 1: Clo hóa bột giấy khí clo, khí phản ứng với lignin để tạo hợp chất tan nước tan môi trường kiềm Bước 2: Lignin oxi hóa loại bỏ cách hòa tan dung dịch kiềm Bước 3: Tẩy trắng dung dịch hypochlorite c Chuẩn bị bột Bột giấy tẩy trắng trộn với loại bột khác từ giấy phế liệu bột nhập Sự pha trộn phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu loại giấy cần sản xuất Hỗn hợp bột trộn với chất phụ gia chất độn bồn trộn Thơng thường, hóa chất dùng để trộn nhựa thông, phèn, bột đá, thuốc nhuộm, chất tăng trắng quang học chất kết dính, , gồm bước sau: Trộn bột giấy chất phụ gia để tạo dịch bột đồng liên tục Nghiền đĩa để tạo chất lượng mong muốn cho loại giấy cần sản xuất Hồ tạo màu để đạt thông số chất lượng mong muốn d Xeo giấy hoàn thiện Bột giấy trộn lại làm phương pháp ly tâm để loại bỏ chất phụ gia thừa tạp chất, cấp vào máy xeo thông qua hộp đầu Về tách nước xeo giấy máy xeo có bước phân biệt: Bước tách nước tọng lực chân không (phần lưới) Bước tách nước học (phần ép) Bước sấy nhiệt (các máy sấy gián tiếp) Cuối giấy làm khô máy sấy gián tiếp đạt khoảng 94% độ cúng cuộn thành phẩm 1.2 NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SẢN XUẤT GIẤY VÀ BỘT GIẤY 1.2.1 Nguồn gốc phát sinh Các nhà máy giấy bột giấy sinh lượng lớn nước thải không xử lý ảnh hưởng lớn đến môi trường Bảng 1.2 cho thấy nguồn nước thải khác nhà máy giấy bột giấy Bảng 1.1: Các nguồn nước thải từ phận thiết bị khác [SXSH] Phần lớn nước thải phát sinh nước dùng trình tiếp xúc với nguyên liệu thô, với sản phẩm sản phẩm phụ chất dư thừa 1.2.2 Thành phần tình hình nhiễm nước thải nhà máy giấy Theo thống kê nước có gần 500 doanh nghiệp sản xuất giấy, có khoảng 10% doanh nghiệp đạt tiêu chuẩn môi trường cho phép, hầu hết nhà máy khơng có hệ thống xử lý nước thải có chưa đạt u cầu, tình trạng gây nhiễm mơi trường sản xuất giấy vấn đề nhiều người quan tâm So với nhiều ngành công nghiệp sản xuất khác, ngành giấy có mức độ nhiễm cao dễ gây tác động đến người môi trường xung quanh ô nhiễm từ nguồn nước thải xử lý không đạt yêu cầu Công nghệ sản xuất giấy Việt Nam lạc hậu Để sản xuất giấy thành phẩm, nhà máy phải sử dụng từ 3-10 m3 nước, nhà máy giấy đại giới sử dụng 7-15 m3/tấn giấy Sự lạc hậu khơng gây lãng phí nguồn nước ngọt, tăng chi phí xử lý nước thải mà đưa sông, rạch lượng nước thải khổng lồ Trong sở công nghiệp giấy bột giấy, nước thải thường có độ pH trung bình 9-11, số nhu cầu oxy sinh hóa (BOD), nhu cầu oxy hóa học (COD) cao, lên đến 700 mg/l 2500 mg/l Hàm lượng chất rắn lơ lửng cao gấp nhiều lần giới hạn cho phép Đặc biệt nước có chứa kim loại nặng, lignin (dịch đen), phẩm màu, xút, chất đa vòng thơm clo hóa hợp chất có độc tính sinh thái cao có nguy gây ung thư, khó phân hủy mơi trường Có nhà máy giấy, lượng nước thải lên tới 4000-5000 m3/ngày, tiêu BOD, COD gấp 10-18 lần tiêu chuẩn cho phép; lượng nước thải không xử lý mà đổ trực tiếp vào sơng Ngồi công nghiệp xeo giấy, để tạo nên sản phẩm đặc thù tính đặc thù cho sản phẩm, người ta sử dụng nhiều hóa chất chất xúc tác Những chất không thu hồi xử lý mà xả thẳng sơng ngòi vấn đề nhiễm khơng tránh khỏi, làm cân sinh thái môi trường nước Hiện nay, khu vực có sở sản xuất giấy phải chịu sức ép nặng nề ô nhiễm môi trường, để sản xuất bột giấy phải thải 10 dịch đen Riêng khu vực sông Cầu, với 3500 m3 nước xả ngày, ngành giấy thủ phạm số gây nhiễm nặng cho dòng sơng này, nhà máy giấy Hồng Văn Thụ đứng đầu bảng Ở Bắc Ninh, ngày Phong Khê thải sông 4500 m3 nước thải theo thống kê Sở Tài Nguyên Môi Trường, số BOD, COD, coliform cao mức cho phép 4-6 lần Khói bụi giấy làm cho bầu khơng khí Phong Khê bị nhiễm trầm trọng Chính lượng nước thải làm cho nhiều diện tích sản xuất nơng nghiệp thành đất chết Điều đặc biệt việc đặt nhà máy thượng nguồn sông Hậu như: Khu cơng nghiệp Trà Nóc II hay Thốt Nốt, Ơ Mơn, gây ô nhiễm nguồn nước trầm trọng, làm ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản Dưới bảng thành phần nước thải số nhà máy sản xuất giấy bột giấy với nguyên liệu gỗ giấy thải theo cục Môi trường thống kê Bảng 1.2: Thành phần nước thải số nhà máy sản xuất giấy bột giấy với nguyên liệu gỗ giấy thải Dựa vào bảng 1.2 ta thấy nồng độ COD, BOD cao, vượt nhiều lần so với TCCP Vậy nên cần có biện pháp xử lý phù hợp để cải thiện chất lượng môi trường nước trước thải sông, suối, 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SẢN XUẤT GIẤY VÀ BỘT GIẤY 1.3.1 Phương pháp học Phương pháp dùng để loại bỏ vật rắn kích thước lớn bao gồm chất lơ lửng chất lắng đọng có chất vô hữu Để tách hạt lơ lửng khỏi nước thải, thường người ta sử dụng trình thủy (gián đoạn hay liên tục), lọc qua song chắn lưới, lắng tác dụng lực trọng trường lực li tâm hay lọc • Lọc: nước thải qua song chắn lưới chắn: bước xử lí sơ nhằm khử tất tạp chất gây cố q trình vận hành hệ thống xử lí nước thải làm tắc bơm, đường ống hay kênh dẫn • Lắng: q trình dùng để loại bỏ tạp chất dạng huyền phù thô khỏi nước Sự lắng hạt xảy tác dụng trọng lực Để tiến hành trình người ta thường dùng loại bể lắng khác như: bể lắng cát (cấp I) – có nhiệm vụ tách chất rắn hữu chất rắn khác bể lắng (cấp II) – có nhiệm vụ tách bùn sinh học khỏi nước thải 1.3.2 Phương pháp hóa lí Thường dùng cho mục đích loại bớt thành phần lơ lửng nước thải cách kết tủa chúng tạo đám bề mặt nước • Đơng tụ keo tụ: q trình lắng tách hạt rắn huyền phù phù hợp tách chất gây nhiễm bẩn dạng keo hòa tan chúng hạt rắn có kích thước q nhỏ Để tách hạt rắn cách hiệu phương pháp lắng cần tăng kích thước chúng nhờ tác động tương hỗ hạt phân tán liên kết thành tập hợp hạt nhằm tăng tốc độ lắng chúng Việc khử hạt keo rắn lắng trọng lượng đòi hỏi trước hết cần trung hòa điện tích chúng, sau liên kết chúng với Q trình trung hòa điện tích gọi q trình đơng tụ, khác với q trình tạo thành bơng lớn từ hạt nhỏ Các chất keo tụ thường dùng Al2(SO4)3, FeCl3,… • Tuyển nổi: phương pháp tuyển sử dụng để tách tạp chất phân tán không tan, lắng khỏi pha lỏng Trong số trường hợp, q trình dùng để tách chất hòa tan chất hoạt động bề mặt Về nguyên tắc, phương pháp tuyển sử dụng để khử chất lơ lửng làm đặc bùn sinh học Quá trình tuyển thực cách sục bọt khí vào pha lỏng Các bọt khí dính bám với hạt lực tập hợp bóng khí hạt đủ lớn kéo hạt lên bề mặt sau chúng tập hợp lại với thành lớp bọt chứa hàm lượng hạt cao 1.3.3 Phương pháp hóa học Các phương pháp hóa học dùng xử lý nước thải gồm có: trung hòa, oxy hóa khử Tất phương pháp dùng tác nhân hóa học nên phương pháp đắt tiền người ta sử dụng phương pháp để khử chất hòa tan tròn hệ thống cấp nước khép kín Đơi phương pháp dùng để xử lý sơ trước xử lý sinh học hay sau công đoạn phương pháp xử lý nước thải lần cuối để thải vào nguồn nước 1.3.4 Phương pháp sinh học Trong nhiều biện pháp xử lý ô nhiễm, biện pháp sinh học người đặc biệt quan tâm sử dụng So với biện pháp vật lý, hố học, biện pháp sinh học chiếm vai trò quan trọng quy mô giá thành đâu tư, chi phí lượng cho đơn vị khối lượng chất khử Đặc biệt xử lý biện pháp sinh học không gây tái ô nhiễm môi trường - nhược điểm mà biện pháp hoá học hay mắc phải Biện pháp sinh học sử dụng đặc điểm quý vi sinh vật , đặc điểm thu hút ý nhà nghiên cứu nhà sản xuất khả đồng hoá nhiều nguồn chất khác vi sinh vật, từ tinh bột, cellulose, nguồn dầu mỏ dẫn xuất đến hợp chất cao phân tử khác protein, lipid, kim loại nặng chì, thuỷ ngân Thực chất phương pháp nhờ hoạt động sống vi sinh vật (sử dụng hợp chất hữu số chất khống có nước thải làm nguồn dinh dưỡng lượng) để biến đổi hợp chất hữu cao phân tử có nước thải thành hợp chất đơn giản Trong trình dinh dưỡng vi sinh vật nhận chất làm vật liệu để xây dựng tế bào, sinh trưởng sinh sản, nên sinh khối tăng lên Hàm lượng chất hữu phân rã vi sinh vật đánh giá theo số "tiêu thụ sinh học oxy" BOD Đấy số lượng oxy cần cho vi sinh vật để oxy-hoá vật liệu hữu q trình hơ hấp Thí dụ BOD5 có nghĩa số lượng oxy (mg) cần cho vi sinh vật trình phân rã chất hữu thời gian ngày Chỉ số "tiêu thụ hóa học oxy" (COD) biểu thị số lượng oxy cần q trình oxy hóa hóa học hồn tồn chất nói đến CO2 H2O Q trình xử lý sinh học gồm bước sau: - Chuyển hóa hợp chất hữu có nguồn gốc cacbon dạng keo dạng hòa tan thành thể khí thành vỏ tế bào vi sinh - Tạo cặn sinh học gồm tế bào vi sinh vật chất keo vô có nước thải - Loại bơng cặn sinh học khỏi nước thải phương pháp lắng trọng lực Do vi sinh vật đóng vai trò chủ yếu trình xử lý sinh học nên tùy thuộc vào tính chất hoạt động chúng, phương pháp xử lý sinh học chia thành hai loại: phương pháp xử lý kị khí phương pháp xử lý hiếu khí Ngồi số trường hợp, người ta sử dụng kết hợp hai trình khị khí hiếu khí - Phương pháp xử lý kị khí: sử dụng nhóm vi sinh vật kị khí, q trình xử lý diễn điều kiện khơng có oxy Q trình phân hủy kị khí chất hữu trình sinh học phức tạp tạo hàng trăm sản phẩm trung gian phản ứng trung gian Tuy nhiên, phương trình phản ứng sinh hóa điều kiện kị khí biểu diễn đơn giản sau: Chất hữu CH4 + CO2 + H2 + NH3 + H2S + Tế bào vi sinh vật Một cách tổng quát, trình phân hủy kị khí xảy theo giai đoạn: - Giai đoạn 1: thủy phân, cắt mạch hợp chất cao phân tử - Giai đoạn 2: axit hóa - Giai đoạn 3: acetat hóa - Giai đoạn 4: methane hóa Các hợp chất hữu chứa nhiều hợp chất cao phân tử như: protein, chất béo, cacbonhydrate, cellulose, lignin, giai đoạn thủy phân cắt chuyển hóa thành phân tử đơn giản, dễ thủy phân Các phản ứng thủy phân chuyển hóa protein thành amino acid, cacbonhydrate thành đường đơn chất béo thành acid béo Trong giai đoạn acid hóa, chất hữu đơn giản lại tiếp tục chuyển hóa thành acid acetic, H 2, CO2 Vi khuẩn methane phân hủy số loại chất định CO + H2, formate, acetate, methanol, methyl amine CO Các phương trình phản ứng diễn sau: 4H2 + CO2 4HCOOH CH4 + 2H2O CH4 + 3CO2 + 2H2O 10 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE Từ nguồn phân lập khác lựa chọn 20 chủng có khả thủy phân CMC sinh enzyme cellulase Tiến hành nhỏ congo đỏ vào đĩa cấy chấm điểm chủng riêng rẽ thu kích thước khuẩn lạc (d) đường kính vòng phân giải CMC (D) Kết thống kê bảng 3.1 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng phân lập STT Ký hiệu khuẩn lạc D/d P0 Bề mặt nhăn nheo, màu kem, mép nhăn lượn sóng P1 Tròn, mép tròn màu trắng nhạt, có màu trắng kem 2,4 P2 Tròn, có màu trắng kem, khơng lồi 0,4 P3 Màu trắng đục, tâm tròn, lõm, mép lan rộng bề mặt 2,2 thạch P4 Tròn đều, bề mặt nhẵn, màu nâu nhạt, to 1,3 P5 Tròn đều, mép cưa, tâm lõm, màu trắng đục,to P6 Màu vàng, tròn, lồi bóng, nhỏ 1,9 P7 Tròn, mép lan rộng bám chặt bề mặt thạch, có vòng tròn 1,5 đồng tâm, nhăn nheo P8 Tròn, có tâm, màu nâu nhạt, to 10 P9 Khuẩn lạc tròn, bóng, nhỏ, màu trắng, lồi 1,6 11 P10 Khuẩn lạc tròn, khơng bóng, nhỏ, màu trắng, lồi 1,2 12 P11 Tròn, mép lan rộng bám chặt bề mặt thạch, tâm lồi bóng trơn 13 P12 Tròn đều, mép cưa, tâm lõm, màu trắng đục, nhỏ 1,5 14 P13 Bề mặt nhầy, tròn, to, màu nâu nhạt 28 15 P14 Màu trắng đục, tâm tròn, lồi, mép lan rộng bề mặt thạch 1,7 16 P15 Màu trắng đục, mép lan rộng bề mặt thạch 17 P16 Màu trắng ngà, có hình cánh hoa, nhầy, có nhân 18 P17 Màu trắng phớt hồng, tròn, bóng nhày 1,1 19 P18 Màu trắng trong, tròn, trơn bóng, khơng chân 1,6 20 P19 Màu trắng đục, có lõm Từ 20 chủng phân lập ta tuyển chọn chủng có hoạt tính phân giải CMC cao P0, P1, P3, P5 (tỷ lệ đường kính vòng phân giải khuẩn lạc > 2) 3.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE CAO 3.2.1 Phương pháp chấm điểm Từ chủng phân lập tiến hành cấy chấm điểm đĩa thạch chứa môi trường CMC1% Agar 2%, nuôi 37°C thời gian ngày, kết thu theo hình 3.1 Hình 3.1: Hoạt tính cellulase chủng theo phương pháp cấy chấm điểm Từ hình 3.1 ta thấy tỷ lệ vòng phân giải kích thước khuẩn lạc chủng P0 P5 lớn đạt D/d = Tuy nhiên phương pháp có hạn chế khơng kiểm soát số lượng tế bào chấm vào chủng nên tiến 29 hành thí nghiệm để tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao 3.2.2 Phương pháp đục lỗ thạch Nuôi lỏng chủng P0, P1, P3 P5 môi trường thử hoạt tính cellulase NA – CMC 37°C ngày, lắc 150 v/ph Sau lấy canh trường ly tâm loại cặn thu dịch Đĩa thạch có chứa CMC hòa tan đục giếng có kích thước Tiếp nhỏ dịch chủng với thể tích vào giếng Giữ tủ lạnh – 4h để enzyme khuếch tán vào thạch Ủ đĩa thạch 37oC vòng 20- 24h Sau tiến hành nhỏ thuốc thử congo đỏ, so sánh kích thước vòng phân giải để chọn chủng có hoạt tính cao Kết thu theo hình 3.2 Hình 3.2: Hoạt tính cellulase chủng theo phương pháp đục lỗ thạch STT Tên chủng D-d P0 1,5 P1 1,3 P3 1,5 P5 1,6 Bảng 3.2: Tỷ lệ đường kính vòng phân giải kích thước lỗ thạch Từ hình 3.2 bảng 3.2 cho thấy P5 cho tỷ lệ vòng phân giải kích thước lỗ thạch lớn không cao chủng P0, P1, P3 nhiều lên 30 để chọn chủng có khả sinh tổng hợp cellulase cao tiếp tục tuyển chọn phương pháp khác 3.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase Sau q trình ni lỏng môi trường chọn lọc, ta tiến hành thu dich sau thời điểm 16h, 24h 40h, tính lượng đường khử sinh dịch nuôi cấy phản ứng đường khử, đo mật độ quang học bước sóng 540 nm (OD540) Dựa vào đồ thị đường chuẩn ta xác định nồng độ đường giải phóng Kết thu bảng 3.3 Thời gian nuôi 16h 24h 40h P0 0,153 0,660 1,43 P1 0,216 0,576 1,16 P3 0,285 0,409 1,24 P5 0,202 0,867 1,46 Tên chủng Bảng 3.4: Hoạt độ enzym sinh theo thời gian, (đơn vị U/ml) Trong điều kiện nuôi cấy, từ bảng 3.4 ta thấy chủng P5 cho hoạt độ enzym cao Kết hợp với hai phương pháp định lượng đục lỗ thạch cấy chấm điểm ta thấy chủng P5 chủng tốt lên ta sử dụng chủng để nghiên cứu 3.3 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH LÝ, SINH HÓA CỦA CHỦNG T4 3.3.1 Phương pháp nhuộm Gram Khi soi tiêu tế bào vi sinh vật kính hiển vi vật kính dầu với độ phóng đại 1000 lần ta thấy chủng T4 có tế bào trực khuẩn ngắn, bắt màu gram dương 31 Hình 3.3: Ảnh nhuộm Gram chủng P5 3.3.2 Phương pháp xác định hình thành bào từ Sau sốc nhiệt ni chủng 37 oC mơi trường đặc ta thấy có xuất khuẩn lạc, đem khuẩn lạc nhuộm đơn giản ta quan sát hình dạng bào từ hình 3.4 Hình 3.4: Hình dạng bào từ chủng P5 3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính catalase Sau nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc ta thấy có xuất bọt khí xủi lên, chúng tỏ chủng P5 có hoạt tính catalase Bảng 3.5: Đặc điểm sinh lí, sinh hóa chủng P5 phân lập Đặc điểm P5 Hoạt tính catalase + Khả di động + Gram + Bào tử + Tinh bột + 32 3.4 ĐỊNH TÊN CHỦNG T4 THEO PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 3.4.1 Sản phẩm điện di sau tách DNA tổng số Chủng T4 sau tiến hành nuôi môi trường lỏng LB để tăng sinh khối qua đêm tiến hành tách DNA tổng số điện di sản phẩm DNA ta thu kết hình sau: P5 M Hình 3.6: Sản phẩm chạy điện di DNA tổng P5 Giếng 1: Mẫu DNA tổng số chủng P5 sau tách Giếng 3: Mẫu marker (M) Từ kết nhận thấy sản phẩm DNA tổng chủng T4 cho dạng vệt đậm, độ rộng nhỏ dải vệt cuối giếng tạp chất sau trình tách 3.4.2 Kết PCR Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Marker Fementas Tên mẫu M 33 P5 ~1.4 kb Kết luận: Đã khuếch đại thành công đoạn gen 16S rDNA mẫu phân tích Đoạn gen có kích thước mong đợi khoảng 1,4 kb 3.4.3 Kết giải trình tự DNA Sản phẩm PCR tinh xác định trình tự hãng Macrogen Inc, Hàn Quốc Kết thu trình tự DNA chủng P5 sau: CTATAATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTT AGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTG GGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCG CATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGAC CCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACG ATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAAT GGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAG GGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTAT TGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCC CCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGC AGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGA TGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGA CGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGG 34 TAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCC CCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGG TCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTC TTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCAT TCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACG TGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCC AATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACT GCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT GTAACACCCGAAGTCGGTAAGGTAACgTCTA Từ trình tự thu được, chúng tơi tiến hành chạy chương trình Blast để xem mức độ tương đồng với chủng ngân hàng gen ta thu kết sau: 35 Hình 3.7: Các chủng có độ tương đồng cao với chủng P5 Từ kết ta nhận thấy chủng T4 ta có độ tương đồng cao chủng Bacillus amyloliquefaciens lên tới 100% Vì vậy, chủng T4 tơi có khả cao chủng Bacillus amyloliquefaciens 3.5 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CHỦNG T4 3.5.1 Kết khảo sát đường cong sinh trưởng Tiến hành nuôi mẫu thời điểm 0h, 4h, 10h, 12, 18, 20, 24, 28h, 30h, 40h, 44h, 48h nhiệt độ 37oC, xác định giá trị mật độ quang bước sóng 600nm Kết đường cong sinh trưởng Bacillus subtilis thời điểm khác biểu diễn hình 3.7 36 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn tăng trưởng vi khuẩn P5 theo thời gian Dựa vào đồ thị ta nhận thấy chủng P5 bắt đầu tăng trưởng sau 6h nuôi cấy, thời điểm 18h - 28h chủng pha cân thời điểm 30h – 48h giai đoạn suy vong 3.5.2 Yếu tố pH Để nghiên cứu ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng P5, tiến hành nuôi cấy chủng bình tam giác 250ml có chứa 50ml mơi trường lỏng NA + 1%CMC, lắc 150 vòng/phút, 37oC điều chỉnh pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, nuôi 24h Giá trị pH điều chỉnh dung dịch HCl 1N NaOH 1N Mật độ tế bào chủng P5 pH khác thể hình 3.10 đây: Hình 3.9: Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng P5 37 Nhìn vào biểu đồ ta thấy B amyloliquefaciens có khả sinh trưởng mơi trường tốt có pH – 10 đặc biệt pH Vậy nên ta chọn pH = để khảo sát yếu tố 3.5.3 Tốc độ lắc Tốc độ lắc ảnh hưởng lớn chủng vi sinh vật hiếu khí Tốc độ lắc lớn, khả hòa tan oxy vào môi trường lớn, cung cấp oxy cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển tạo sản phẩm trao đổi chất Tuy nhiên, tốc độ lắc bé khả hòa tan oxy làm ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật Khảo sát tốc độ lắc q trình ni cấy khảo sát khả sử dụng oxy chủng Kết ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp cellulase B amyloliquefaciens theo hình 3.10 Hình 3.11: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến phát triển chủng P5 Nhận xét: dựa vào đồ thị khảo sát hình 3.11 ta thấy tốc độ lắc ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển chủng, khơng lắc mật độ vi sinh vật ít, có yếu tố lắc chủng phát triển nhanh hẳn đạt cao tốc độ lắc 200vòng/phút, giảm dần tốc độ lắc lớn 250 vòng/phút Lựa chọn tốc độ lắc 200 vòng/phút để khảo sát cho yếu tố 38 3.5.4 Nồng độ CMC Nồng độ CMC nguồn cảm ứng hệ gen vi sinh vật tổng hợp chất mong muốn Nếu mơi trường hàm lượng chất cảm ứng q ít, q trình tổng hợp chất yếu, nhiều ức chế q trình tổng hợp Chính lựa chọn nồng độ nguồn chất quan trọng Kết khả sát ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả sinh tổng hợp cellulase theo hình 3.12 Hình 3.12: Ảnh hưởng nồng độ CMC đến phát triển chủng P5 Nhận xét: dựa vào đồ thị ta thấy nồng độ CMC 1% cho hàm lượng sinh khối lớn đạt 4,154, cao nhiều so với nồng độ 1,5%CMC (2,73) từ nồng độ 1,5% đến 3% ta thấy chủng phát triển thấp không thay đổi nhiều Chọn nồng độ CMC 1% để nghiên cứu tiếp 3.5.5 Ảnh hưởng nồng độ nguồn cacbon, nito đến phát triển chủng P5 Sau nuôi chủng P5 môi trường môi trường MT (NA + 1%CMC), MT pepton, NaCl, 1%CMC MT Cao thịt, NaCl, 1%CMC Với pH = 8, tốc độ lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 37oC, ni 24 sau đem đo OD600nm ta thu kết sau: 39 MT1: mật độ OD600nm đo 2,223 MT2: mật độ OD600nm đo 1,773 MT3: mật độ OD600nm đo 0,658 Nhận xét: dựa vào kết ta thấy mơi trường có đủ nguồn dinh dưỡng mơi trường chủng P5 phát triển tốt OD600 = 2,223 , thiếu cao thịt mật độ sinh vật sau đo OD600nm giảm xuống 1,773 giảm xuống thấp thiếu pepton (nguồn cung cấp nito chủ yếu) Kết luận môi trường sử dụng để nuôi cấy chủng phải có đầy đủ nguồn cung cấp dinh dưỡng (nguồn nito cacbon) chủng phát triển sinh trưởng tốt 3.5.6 Tỷ lệ giống Tỷ lệ cấp giống yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Khi tỷ lệ cấp giống cao, lượng vi khuẩn ban đầu nhiều, khả tiêu thụ chất lớn, sản sinh nhiều chất gây ức chế trình sinh trưởng vi khuẩn Trong trường hợp tỷ lệ cấp giống thấp dẫn đến kéo dài thời gian lên men, dễ nhiễm tạp Khảo sát tỷ lệ cấp giống ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase B.subtilis B5, kết theo hình 3.13 Hình 3.13: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến phát triển chủng P5 Nhận xét: ta thấy nồng độ cấp giống từ 1% đến 5% chủng P5 phát triển tăng dần đạt cao nồng độ giống 5%, đến tăng nồng độ cấp lên 7% 10% chủng bắt đầu phát triển chậm giảm Do ta lựa chọn nồng độ giống 5% để nghiên cứu 40 MỤC LỤC PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 1.2 1.3 HIỆN TRẠNG SẢN XUẤT GIẤY 1.1.1 Tình hình sản xuất 1.1.2 Quy trình sản xuất giấy NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SẢN XUẤT GIẤY VÀ BỘT GIẤY 1.2.1 Nguồn gốc phát sinh .4 1.2.2 Thành phần tình hình nhiễm nước thải nhà máy giấy .5 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SẢN XUẤT GIẤY VÀ BỘT GIẤY 1.3.1 Phương pháp học .7 1.3.2 Phương pháp hóa lí 1.3.3 Phương pháp hóa học .8 1.3.4 Phương pháp sinh học 1.4 CELLULOSE VÀ CẤU TRÚC 11 1.5 ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP CELLULASE 13 1.5.1 Giới thiệu enzym cellulase 13 1.5.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 15 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 2.1 VẬT LIỆU 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Dụng cụ 18 2.1.3 Hóa chất .18 2.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 18 2.2.1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose .18 2.2.2 Môi trường thử hoạt tính enzym cellulase 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả tổng hợp cellulase 19 2.3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp cellulase cao 20 2.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH LÝ, SINH HĨA CỦA CHỦNG 22 2.4.1 Phương pháp nhuộm Gram 22 2.4.2 Phương pháp xác định hình thành bào tử .23 2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính catalase [1, 7] 23 2.5 ĐỊNH TÊN THEO PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ .23 2.5.1 Tách chiết DNA tổng số 23 2.5.2 Phương pháp điện di gel agarose 24 41 2.5.3 Phản ứng PCR .24 2.5.4 Giải trình tự 26 2.6 KHẢO SÁT MỘT SỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÁC CHỦNG TUYỂN CHỌN .26 2.6.1 Thời gian .26 2.6.2 Yếu tố pH .26 2.6.3 Tốc độ lắc 26 2.6.4 Xác định ảnh hưởng nồng độ chất CMC 27 2.6.5 Xác định ảnh hưởng nguồn nitơ, nguồn cacbon .27 2.6.6 Tỷ lệ cấp giống 27 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE 28 3.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE CAO .29 3.2.1 Phương pháp chấm điểm 29 3.2.2 Phương pháp đục lỗ thạch 30 3.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase 31 3.3 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH LÝ, SINH HĨA CỦA CHỦNG T4 .32 3.3.1 Phương pháp nhuộm Gram 32 3.3.2 Phương pháp xác định hình thành bào từ .32 3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính catalase 32 3.4 ĐỊNH TÊN CHỦNG T4 THEO PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 33 3.4.1 Sản phẩm điện di sau tách DNA tổng số 33 3.4.2 Kết PCR 34 3.4.3 Kết giải trình tự DNA .34 3.5 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CHỦNG T4 .36 3.5.1 Kết khảo sát đường cong sinh trưởng 36 3.5.2 Yếu tố pH .37 3.5.3 Tốc độ lắc 38 3.5.4 Nồng độ CMC 39 3.5.5 Ảnh hưởng nồng độ nguồn cacbon, nito đến phát triển chủng P5 39 3.5.6 Tỷ lệ giống 40 42 ... lượng enzyme…, yếu tố quan trọng tính đồng hệ enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác Q trình thủy phân cellulose tiến hành đến sản phẩm cuối sử dụng đồng ba loại enzyme cellulase Cellulase... thành sau phản ứng phương pháp đo quang phổ theo Miller (1959) [23] Xây dựng đồ thị đường chuẩn: Bảng 2.1: Xây dựng đồ thị chuẩn STT V glucose mg/ml ( 50 75 100 150 250 350 500 1000 V (ul) 950... sinh học sử dụng đặc điểm quý vi sinh vật , đặc điểm thu hút ý nhà nghiên cứu nhà sản xuất khả đồng hoá nhiều nguồn chất khác vi sinh vật, từ tinh bột, cellulose, nguồn dầu mỏ dẫn xuất đến hợp