khảo sát thành phần loài mối và phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong ruột mối ở u minh thượng

Ethanol là loại năng lượng sạch thường được sản xuất chủ yếu từ các loại cây nông nghiệp có có hàm lượng đường cao như bắp, lúa mì, ngô,…Một số công trình nghiên cứu trên thế giới đã cho

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN LOÀI MỐI VÀ PHÂN LẬP

VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE

TRONG RUỘT MỐI Ở U MINH THƯỢNG

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

MSSV: 3112390

CẦN THƠ, THÁNG 12/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

Ts Ngô Thanh Phong Đỗ Minh Quý

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

………

……… Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI BẢN QUYỀN

Tôi xin cam đoan đây là công trình khoa học của bản thân tôi và giáo viên hướng dẫn Các kết quả, số liệu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất cứ một công trình khoa học nào trước đây

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Ngô Thanh Phong đã định

hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn để tôi hoàn thành

luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô trong bộ môn Sinh Học trường Đại

Học Cần Thơ đã tận tình đào tạo, giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi, chu đáo trong

suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Bên cạnh đó tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã

động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả như ngày hôm

nay

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ

quý báu đó !

Cần Thơ ngày….tháng… năm 2014 Sinh viên

Đỗ Minh Quý

TÓM LƯỢC

Từ 6 tổ mối thu được ở U Minh Thượng đã xác định được thành phần loài mối, phân lập và tách ròng, mô tả đặc điểm khuẩn lạc và nhuộm Gram được 30 chủng vi khuẩn Trong đó có 19 chủng có khả năng phân hủy tốt CMC, chủng có phần trăm phân giải CMC cao nhất là chủng 5Q5 đạt 76,19% Chọn 19 chủng phân giải tốt cellulose để chủng vào 3 cơ chất là rơm rạ, trấu, giấy Sau 15 ngày chủng vi khuẩn vào cơ chất, chủng tạo lượng đường cao nhất với cơ chất rơm rạ là 4Q5 (3,802mg/l), cơ chất trấu là chủng 4Q2 (3,081mg/l) và cơ chất giấy là chủng 4Q2 (3,176mg/l) Hàm lượng đường sinh ra cao nhất là sau 5 ngày sau khi chủng vi khuẩn vào cơ chất

Từ khóa: Mối, CMC, phân hủy rơm, phân hủy trấu, phân hủy giấy, vi khuẩn trong ruột mối, 5Q5, 4Q2, 4Q5

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT i

LỜI BẢN QUYỀN ii

LỜI CẢM ƠN iiii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT x

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1.Giới thiệu sơ lươc về U Minh Thượng 2

2.1.1 Vị trí địa lý 2

2.1.2 Đặc điểm khí hậu đất đai 2

2.2.Mối và sự đa dạng về thành phần loài 2

2.2.1 Giới thiệu sơ lược về mối 2

2.2.2 Vị trí của mối trong hệ thống phân loại côn trùng 3

2.2.3 Thành phần loài mối 4

2.3.Cellulose 9

2.4.Enzyme cellulase 11

2.5.Quá trình phân hủy cellulose diễn ra trong ruột mối 13

2.6.Các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã được nghiên cứu 14

2.6.1 Những nghiên cứu nước ngoài 14

2.6.2 Những nghiên cứu trong nước 15

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm 16

3.2 Phương tiện nghiên cứu 16

3.2.2 Các dụng cụ và trang thiết bị 16

3.2.3 Các hóa chất và môi trường sử dụng để nghiên cứu 17

3.3.Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Thu mẫu mối 18

3.3.2 Phân lập vi khuẩn trong ruột mối 21

3.3.2.1 Cấy mẫu vào môi trường phân lập 22

3.3.2.2 Cấy chuyền và kiểm tra độ ròng của vi khuẩn 22

3.3.3 Quan sát đặc điểm của khuẩn lạc và vi khuẩn 23

3.3.3.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc 23

3.3.3.2 Quan sát vi khuẩn 23

3.3.4 Khảo sát khả năng phân giải CMC của các chủng vi khuẩn đã tách ròng 24

3.3.5 Khảo sát mật số của tế bào vi khuẩn nuôi trong môi trường MRS lỏng 25

3.3.6 Kiểm tra khả năng phân hủy rơm, trấu và giấy của từng chủng vi khuẩn 26

3.3.6.1 Ủ các chủng vi khuẩn vào rơm, trấu và giấy 26

3.3.6.2 Xây dựng đường chuẩn glucose 27

3.3.6.3 Xác định lượng đường tạo ra từ cơ chất 28

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Mô tả hình thái và xác định thành phần loài mối 30

4.1.1 Mối thợ (mối lao động) 30

4.1.2 Mối lính (mối bảo vệ) 30

4.1.3 Mối chúa 31

4.1.4 Mối non 32

4.2.Kết quả phân lập vi khuẩn 32

4.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 32

4.2.2 Đặc điểm của 30 chủng vi khuẩn 35

4.3.Kết quả CMC của các chủng vi khuẩn 37

4.4.Khả năng phân hủy cellulose của 19 chủng vi khuẩn 40

4.4.1 Xây dụng đường chuẩn glucose 40

4.4.2 Lượng glucose tạo của các chủng vi khuẩn với các cơ chất theo thời gian 42

4.4.2.1 Lượng glucose tạo ra ở cơ chất rơm rạ 42

4.4.2.2 Lượng glucose tạo ra ở cơ chất trấu 44

4.4.2.3 Lượng glucose tạo ra ở cơ chất giấy 46

4.4.3 Lượng glucose tạo ra của các chủng vi khuẩn theo cơ chất 47

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

5.1.Kết luận 51

5.2.Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của celluose 9

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của CMC 10

Hình 2.3 Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulose 12

Hình 2.4 Cấu tạo ruột mối 13

Hình 2.5 Quá trình biến đổi thức ăn xảy ra trong ruột mối 14

Hình 3.1 Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu 17

Hình 3.2 Tổ mối 1 19

Hình 3.3 Tổ mối 2 19

Hình 3.4 Tổ mối 3 20

Hình 3.5 Tổ mối 4 20

Hình 3.6 Tổ mối 5 21

Hình 3.7 Tổ mối 6 21

Hình 3.8 Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu 29

Hình 4.1 Mối thợ 30

Hình 4.2 Mối lính 31

Hình 4.3 Mối chúa 31

Hình 4.4 Mối non 32

Hình 4.5 Đặc điểm khuẩn lạc 34

Hình 4.6 Đặc điểm các chủng vi khuẩn ở vật kính E40 35

Hình 4.7 Vòng thủy phân CMC của chủng 5Q5 và 2Q5 39

Hình 4.8 Biểu đồ phần trăm phân hủy CMC của các chủng vi khuẩn 40

Hình 4.9 Phương trình đường chuẩn glucose 41

Hình 4.10 Hàm lượng glucose trung bình tạo ra của các chủng vi khuẩn từ cơ chất 49

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Môi trường MRS Error! Bookmark not defined Bảng 3.2 Môi trường CMC Error! Bookmark not defined Bảng 3.3 Thành phần của dãy đường chuẩn glucose Error! Bookmark not defined Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc của 30 chủng vi khuẩn Error! Bookmark not defined Bảng 4.2 Đặc điểm 30 chủng vi khuẩn Error! Bookmark not defined Bảng 4.3 Phần trăm phân hủy CMC của 30 chủng vi khuẩn sau 3 ngày Error! Bookmark not defined

Bảng 4.4 Kết quả đo OD đường chuẩn Error! Bookmark not defined Bảng 4.5 Lượng glucose của các chủng vi khuẩn phân giải rơm theo thời gian Error! Bookmark not defined

Bảng 4.6 Lượng glucose của các chủng vi khuẩn phân giải trấu theo thời gian Error! Bookmark not defined

Bảng 4.7 Lượng glucose của các chủng vi khuẩn phân giải giấy theo thời gian Error! Bookmark not defined

Bảng 4.8 Hàm lượng glucose tạo ra của các chủng vi khuẩn với rơm, trấu và giấy Error! Bookmark not defined

CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

CMC: Carboxyl Methyl Cellulose

CFU: Clony Forming Unit

ATP: Adenosine triphotphate

OD: Optical Density

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

Ngày nay, vấn đề năng lượng là vấn đề đang được cả thế giới quan tâm hàng đầu Các nhà khoa học trên thế giới đã dự báo rằng nếu cứ tiếp tục khai thác như hiện nay thì nguồn nhiên liệu hóa thạch trong lòng đất sẽ cạn kiệt trong trong vòng 40 đến 50 năm tới Việc làm cấp bách hiện nay là tìm ra những nguồn năng lượng mới để đáp ứng cho như cầu sử dụng của con người Ngoài những nguồn năng lượng sạch như năng lượng mặt trời, sóng biển, gió, hạt nhân,…thì năng lượng sinh học đang chiếm ưu thế và đang được các nhà khoa học đẩy mạnh nghiên cứu

Ethanol là loại năng lượng sạch thường được sản xuất chủ yếu từ các loại cây nông nghiệp có có hàm lượng đường cao như bắp, lúa mì, ngô,…Một số công trình nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy rằng các phế phẩm nông nghiệp giàu cellulose có thể chuyển hóa thành ethanol với sự giúp đỡ của những dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose Đối với một quốc gia nông nghiệp như Việt Nam thì khôi lượng các phế phẩm, phụ phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, các xác bả thực vật là rất lớn Đa số các phụ phẩm này không được tận dụng mà được đốt trực tiếp trên đồng ruộng hay các nương rẫy sau khi thu hoạch Chúng tạo ra những chất độc hại cho con người và môi trường như CH4, CO2 ,…Không những ô nhiễm môi trường mà còn làm lãng phí nguồn năng lượng rất giàu cellulose này Một hướng đi mới để khắc phục tình trạng này đó là sử dụng vi khuẩn có khả năng phân hủy các phế phẩm nông nghiệp có nguồn gốc từ cellulose để tạo thành glucose sau đó chuyển hóa thành ethanol

Mối là một loài gây hại nguy hiểm cho các công trình được xây dựng từ gỗ, các vật dụng có nguồn gốc từ cellulose Do trong ruột mối có các vi sinh vật sống cộng sinh có thể tiêu hóa cellulose Vì thế, chúng ta tận dụng đặc điểm này của chúng đề sử dụng phân hủy các phế phẩm, phụ phẩm nông nghiệp để tao thành sản phẩm có lợi thay vì ta tìm cách để tiêu diệt chúng Và đó cũng là giải pháp tuyệt vời cho môi trường cũng như là tạo

ra nguồn nguyên liệu để sử dụng

Vì thế đề tài “Khảo sát thành phần loài mối và phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong ruột mối ở U Minh Thượng” được thực hiện với các mục tiêu:

- Xác định thành phần loài mối ở U Minh Thượng

- Phân lập các dòng vi khuẩn có trong ruột mối

- Xác định khả năng phân giải và chọn ra những chủng vi khuẩn phân giải tốt cellulose

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu sơ lươc về U Minh Thượng

2.1.1 Vị trí địa lý

Tọa độ: Từ 9°31 đến 9°39' vĩ Bắc và từ 105°03' đến 105°07' kinh độ Đông Sông Trẹm chia U Minh thành hai vùng thượng và hạ U Minh Hạ thuộc tỉnh Cà Mau, vườn quốc gia U Minh Thượng thuộc huyện U Minh Thượng tỉnh Kiên Giang Do nhiều nguyên nhân tác động, rừng tập trung ở U Minh Thượng nhiều hơn và loại rừng nguyên sinh chiếm phần lớn ở đây Rừng U Minh Thượng là kiểu rừng rất đặc thù, được xếp hạng độc đáo và quí hiếm trên thế giới

Rừng U Minh Thượng được công nhận là vườn quốc gia vào tháng 1 năm 2002, với diện tích 8053 hécta Rừng nằm trong địa giới của các huyện An Biên, An Minh, Vĩnh Thuận của tỉnh Kiên Giang, thuộc vùng bán đảo Cà Mau Vườn quốc gia U Minh Thượng nằm trong địa giới của huyện U Minh Thượng, tỉnh Kiên Giang; có tọa độ địa lý là: Từ 9°31’ đến 9°39’ vĩ Bắc và từ 105°03’ đến 105°07’ kinh độ Đông (http://vi.wikipedia.org/wiki/Vườn_quốc_gia_U_Minh_Thượng)

2.1.2 Đặc điểm khí hậu đất đai

U Minh Thượng có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm Mưa, bão tập trung vào từ tháng 8 đến tháng 10 với lượng mưa trung bình hàng năm là 2.146,8mm Nhiệt độ trung bình hàng năm từ 26,40C đến 280C, tháng lạnh nhất là tháng 12; không có hiện tượng sương muối xảy ra U Minh Thượng không chịu ảnh hưởng trực tiếp của bão nhưng lượng nước mưa do bão chiếm một tỷ trọng đáng kể, nhất là vào cuối mùa mưa

U Minh Thượng có những điều kiện tự nhiên mà các khu vực khác không có được như: ít thiên tai, không rét, không có bão đổ bộ trực tiếp, ánh sáng và nhiệt lượng dồi dào, nên rất thuận lợi cho nhiều loại cây trồng và vật nuôi sinh trưởng Khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm Mưa, bão tập trung vào từ tháng 8 đến tháng 10 với lượng mưa trung bình hàng năm là 2.146,8mm Nhiệt độ trung bình hàng năm từ 26,40C đến 280C, tháng lạnh nhất là tháng 12 và không có hiện tượng sương muối xảy ra

Đất đai chủ yếu là đất phù sa ngọt và phù sa nhiễm mặn, cây cối xanh tốt quanh năm phát triển mạnh nhất là tràm với những cánh rừng bạt ngàn và cũng là cây chỉ thị sinh học cho vùng này (http://vi.wikipedia.org/wiki/Vườn_quốc_gia_U_Minh_Thượng)

2.2 Mối và sự đa dạng về thành phần loài

2.2.1 Giới thiệu sơ lược về mối

Trong hệ thống phân loại, thì mối là côn trùng nguyên thủy thuộc bộ cánh bằng (

Isoptera), có họ hang gần gũi với gián niên đại tồn tại đến 200 triệu năm (Zalessky 1973),

niên đại tồn tại của nó ước khoảng 70 triệu năm, nên nguời ta gọi mối là tổ tiên của lớp

côn trùng; phương thúc sinh sống của mối (Isoptera) và ong, kiến (Hymenoptera) là rất

giống nhau, chúng là côn trùng xã hội, đều sống thành quần thể, nó đã cùng với niên đại

tồn tại của loài người không đến 1 triệu năm

Do tính đặc thù về phương thức sinh sống của mối, hình thái giữa các cá thể trong một quần thể đồng nhất có những bước biến hóa rất lớn, thời gian tồn tại của một quần thể rất dài, ít cũng mấy năm, thường là mười năm, ở vùng nhiệt đới có khi vược quá một trăm năm Do mối có đời sống kín đáo, nên khi nghiên cứu chúng ở phòng thí nghiệm cũng có những khó khăn khi nuôi chúng để quan sát Do vậy những hiểu biết của con người về mối có những giới hạn nhất định Theo tài liệu thống kê của Emerson (1952) đã phát hiện được 1855 loài, trong đó ước tính có 1762 loài hiện nay đang tồn tại và ước có 93 loài hóa thạch Theo bảng danh lục côn trùng về mối trên thế giới của Snyder (1949) để từ đó bổ sung tu chỉnh cho phong phú thêm Trong thời gian 12 năm từ năm 1952 đến năm 1963 thì trên thế giới đã phát hiện thêm 150 loài mối mới đưa tổng số loài mối lên 2000 loài, trong đó bao gồm cả các loài hóa thạch Đại bộ phận mối phân bố ở các vùng á nhiệt đới, một số ít phân bố đến phía Bắc của châu Á, Bắc Phi, các nước ven biển Đại Trung Hải, Bắc Mỹ giáp với Canada, Bắc của châu Mỹ, châu Úc Nói về toàn cầu thì châu Phi là đại bản doanh phân bố của các loài mối ( Thái Bang Hoa 1964) Ở nước ta, Phú Thọ là một tỉnh có nhiều loài mối phân bố, còn các tỉnh khác thì ít nhiều cũng có sự phân bố của loài mối Gần đây theo thống kê chưa đầy đủ đã có 83 loài mối phân bố trến khắp nước ta ( Nguyễn Đức Khảm 1976, 1989)

2.2.2 Vị trí của mối trong hệ thống phân loại côn trùng

Vị trí phân loại của mối đã trãi qua một thời gian dài và không ổn định Linné

năm1758 đã xếp mối như giống Termes trong bộ không cánh (Aptera) Lúc ấy tác giả chỉ

thấy mối lính và mối thợ, chưa thấy được cá thể mối cánh Fabricius lúc đầu xếp mối vào

bộ cánh màng (Hymenoptera) coi như một loài kiến, nhưng đến năm 1781, lại xếp mối vào bộ cánh mạch (Neuroptera) Latreille năm 1802 đã xem loài mối thuộc bộ không cánh của Linné và côn trùng cánh răng nhập vào một, thiết lập một họ Termitina Đến

năm 1832, Brulle lại đem mối từ bộ cánh mạch tách ra và nhập vào cùng với bộ cánh tơ

thành một bộ khác, lấy tên là Isopteres Đến 1854 Hagen mới chỉ ra mối (Isopteres) và dán (Blattoidea) có quan hệ mật thiết với nhau Nhưng mãi đến năm 1895 Comstock, J.H

và Comstock, A.B mới xác lập bộ cánh bằng Isoptera Về sau này sự phát hiện loài mối rất nguyên thủy Mastotermes darwiniensis Froggatt, thì những kết quả nghiên cứu của

loài mối này càng được xác định rằng mối và dán trên một hệ thống phát dục là rất gần gũi với nhau

Vị trí phân loại của bộ cánh bằng có thể phân chia các họ theo hệ thống thường dùng sau đây:

Đẳng cấp loại hình của mối và tác dụng của nó

Đặc tính sinh vật học của loài mối là sinh sống thành quần thể và quần thể này là một đơn nguyên tổ thành quần thể mối Trong quần thể mối trưởng thành bao gồm rất

nhiều cá thể Ở trong quần thể mối đẳng cấp thấp như mối gỗ họ Kalotermitidae thì có từ

100 đến mấy nghìn cá thể, còn trong quần thể mối có đẳng cấp cao hơn như mối đất cánh

đen Odontotermes formosanus Shiraki (Termitidae) thì có đến trên 2 triệu cá thể Sự lớn

nhỏ của quần thể và sự ít nhiều của cá thể trong quần thể không những phụ thuộc và từng chủng loại khác nhau, mà ngay cả trong một quần thể đồng nhất cũng thay đổi khác nhau tùy theo thời tiết, các chất dinh dưỡng và điều kiện sống không giống nhau, dẫn đến sự suy vong và sự phát triển của quần thể mối cũng thay đổi Như nói ở trên, một quần thể mối nói chung là một đơn nguyên sinh sống, thì nếu như mối sống đơn lẻ hoặc sống với

số lượng quá ít thoát ly khỏi quần thể thì không thể tồn tại, đó là sự khác nhau rõ ràng

giữa côn trùng sống đơn lẻ như côn trùng cánh cứng (Coleoptera) và mối sống quần thể (Isoptera)

Trong quần thể mối có 2 loại hình lớn: Mối sinh sản và mối không sinh sản, mỗi loại hình lại chia ra nhiều đẳng cấp mối khác nhau

Loại hình sinh sản hoặc gọi là mối sinh sản

Loại hình này có thân hình tương đối lớn, nhất là mối chúa có phần bụng cực kỳ

to Cơ thể chúng có cơ quan sinh sản phát dục hoàn chỉnh, nên trong quần thể mối chúa

có chức năng giao phối và đẻ trứng, về nguồn gốc và hình thái không giống nhau, nên mối sinh sản có thể chia ra làm ba đẳng cấp như sau:

Mối vua và mối chúa nguyên thủy

Mối cánh trưởng thành sau khi bay giao hoan, rụng cánh đã ghép đôi và sinh sản gọi là mối vua hay là mối chúa nguyên thủy, chúng là kẻ sáng lập đầu tiên một quần thể mối, cho nên trong quần thể mối phần lớn có đẳng cấp này Đặc điểm về mặt hình thái, màu sắc thân hơi thẫm và rắn hơn, có mắt kép và mắt đơn phát triển, mặt lưng ngực giữa

và trước sau còn giữ lại vẫy cánh, sức sinh sản lớn Phần lớn trong một quần thể mối chỉ

có một đôi mối vua, mối chúa nguyên thủy, nhưng trong một quần thể đồng nhất của một

số loài mối có khi phát hiền 2 hoặc 3 đôi mối vua, mối chúa nguyên thủy ví dụ như giống

mối đất Odontotermes và Macrotermes thường có hiện tượng này Loài mối cánh đen Odontotermes formosanus Shiraki thì hiện tượng nhiều mối vua và mối chúa trong một

quần thể đồng nhất là rất phổ biến, có khi nhiều đến 5 vua 8 chúa, trong đó thường đếm được mối vua ít hơn mối chúa Cái đó là kết quả của hiện tượng mối vua chết sớm hơn mối chúa hoặc sự trốn chạy của mối vua khi xây dựng tổ mối, hiện tượng này còn chưa khẳng định một cách chính xác

Mối vua, mối chúa bổ sung cánh ngắn

Loại mối này có thể là đẳng cấp tồn tại phổ biến Về đặc trưng hình thái thì màu sắc của thân thì hơi nhạt và thân hơi mềm, có mắt kép, tấm lưng ngực giữa và ngực sau có mầm cánh nhỏ, ngắn giống như con cào cào còn non Sức sinh đẻ của nó kém hơn mối vua và mối chúa nguyên thủy như đã nói ở trên, về mặt số lượng nói chung là nhiều hơn

so với mối vua và mối chúa nguyên thủy, ví dụ trong một quần thể mối Globitermes audax Silvestri cùng một lúc thấy được 43 mối chúa cánh ngắn Mối vua, mối chúa cánh

ngắn này sau khi mối vua và mối chúa nguyên thủy chết thì chúng mới xuất hiện, nhưng cũng có khi chúng tồn tại đồng thời cùng với mối vua và mối chúa nguyên thủy (Thái Bang Hoa 1964)

Mối vua mối chúa không cánh

Cũng giống như mối vua mối chúa cánh ngắn, loại này không tồn tại phổ biến trong chủng loại mối, nhưng so với mối vua và mối chúa cánh ngắn càng ít thấy hơn Về mặt hình thái thì màu sắc cơ thể rất nhạt thường thường là màu vàng, thậm chí màu trắng, thân thể so với mối vua chúa cánh ngắn càng mềm, không có mắt kép, và đặc biệt trên tấm lưng của ngực giữa và ngực sau không có mầm cánh Đẳng cấp này thường thường chỉ tồn tại khi trong quần thể mối khi mối vua và mối chúa nguyên thủy mất đi Ngoài 3 loại đẳng cấp trên có khi còn có loại trung gian giữa 3 loại đẳng cấp trên Mối vua, mối chúa cánh ngắn và mối vua, mối chúa không cánh không bao giờ bay ra khỏi tổ vì không

có cánh đầy đủ để giao hoan phân đàn như mối cánh trưởng thành đồng loại

Loại hình không sinh sản

Mối lính (mối bảo vệ)

Mối lính thuộc đẳng cấp thứ 2 trong loại hình không sinh sản Trong chủng loại

mối, ngoài giống Anoplotermes không có mối lính ra, những chủng loại còn lại đều có

mối lính Theo Thái Bang Hoa (1964) thì mối lính có con đực và con cái nhưng không sinh sản được Đặc trưng hình thái của chúng tương đối rõ ràng, trừ phân họ mối mũi dài

Nasutitermitinae Hare (Termitidae) ra, còn mối lính của các họ khác đều có hàm trên phát triển và dài Hàm trên của mối lính trong phân họ Nasutitermitinae rất nhỏ, nhưng phần

trán đột nhiên kéo dài ra thành ống hoặc dạng cái dùi, gọi là ống trán, ở đỉnh nhọn của ống trán này có lỗ thông ra ngoài có thể tiết ra một số chất dịch độc có tính acid Do mối lính có hàm trên phát triển hoặc ống trán có khả năng tiết ra chất độc, nên vai trò của mối lính là kẻ bảo vệ quần thể mối Do sự chuyên hóa bộ phận miệng dùng để bảo vệ, nên mối lính đã mất đi năng lực tự lấy thức ăn cho mình, để cho mối lính tồn tại, mối thợ phải mớm thức ăn cho mối lính, một số loài có 2 loại mối lính: mối lính to và mối lính nhỏ

Mối thợ (mối lao động)

Mối thợ là đẳng cấp chiếm đông nhất trong loại hình không sinh sản của quần thể

mối Đối với họ mối gỗ tương đối nguyên thủy như Kalotermitidae và Termospsidae thường thiếu mối thợ, còn các họ Termitidae và Rhinotermitidae tương đối tiến hóa thì

mối thợ chiếm tuyệt đại đa số trong quần thể Mối thợ cũng giống như mối lính có chia ra đực, cái nhưng cơ quan sinh sản và phát dục không hoàn chỉnh, do vậy chúng không thể

đẻ trứng trong quần thể mối Mối thợ chỉ đảm nhiệm vụ kiếm thức ăn, xây tổ, làm đường mui, mớm thức ăn, chăm sóc mối non, vận chuyển trứng mối,… để duy trì sinh sống trong quần thể Về mặt hình thái mối thợ gần giống như mối non, nhưng thân hình to hơn mối non, các bộ phận của mối thợ khác với mối non: mối thợ thân có màu thẫm hơn, nhất

là phần miệng, hai hàm trên của mối thợ được kitin hóa cao, có màu nâu hoặc màu thẫm Đại đa số trong chủng loại mối, mối thợ chỉ có một loại Mối thợ trong một quần thể thống nhất là không khác biệt trên chức năng hoạt động, điều đó chưa khẳng định, nhất ít nhất về mặt hình thái thì nhất trí Cũng không ít chủng loại mối có 2 loại mối thợ: mối thợ

to và mối thợ nhỏ trong một quần thể thống nhất như: Macrotermes annandalei Silvestri

và Macrotermes barneyei Light Về hình thái của mối thợ to và mối thợ nhỏ có sự sai

khác về kích thước rõ ràng, nhưng giữa mối thợ to và mối thợ nhỏ có chức năng khác nhau hay không vẫn chưa được nghiên cứu Trong quần thể mối có đẳng cấp thấp thiếu thợ thì việc kiến thiết tổ nói chung là do mối non đảm nhiệm

Thời kỳ bay giao hoan và sự phát triển quần thể mối

Thời kỳ bay giao hoan của một quần thể mối tùy thuộc vào chủng loại mối và vùng phân bố Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Đức Khảm, Vũ Văn Tuyển (1985) và Nguyễn Chí Thanh (1996) thì ở nước ta mối bay giao hoan từ tháng 4 đến tháng 8 Nhưng mạnh nhất vào tháng 4, 5, 6 và 7 Trước đó và sau đó cũng gặp mối bay giao hoan nhưng rải rác không tập trung

Trong quá trình phát triển của quần thể mối thì mối cánh trưởng thành là khâu chủ yếu để mối tiến hành phân đàn sinh sản Thiếu trùng (mối cánh ngắn) sau khi hoàn thành lần lột xác cuối cùng thì thành mối cánh trưởng thành, đôi khi mối cánh trưởng thành cùng lưu lại trong quần thể mà nó sống, đợi đến khi điều kiện ngoại cảnh bên ngoài thích nghi mới bay khỏi quần thể bay ra ngoài, hiện tượng này gọi là hiện tượng “phân đàn”,

“bay giao hoan”,… Theo tài liệu của Thái Bang Hoa và Trần Ninh Sinh (1964) thì ở trung

quốc, mối Reticulitermes speratus Kolbe bay giao hoan sau mùa xuân, khi trời ấm áp,

nhiệt độ không khí đạt đến 200C, áp suất không khí vào lúc trưa và chiều đạt tới 760mm/Hg Mối cánh trưởng thành trong một quần thể có thể bay ra toàn bộ một lần, và cũng có thể vì một nguyên nhân nào đó không bay ra cả đàn mà giữ lại một số cá thể đợi bay vào một lần sau Do vậy cùng một loài mối, trong cùng một vùng, một năm có thể phát sinh nhiều lần bay giao hoan

Sức bay lượn của mối cánh trưởng thành cũng yếu, do vậy hướng bay và cự ly bay cũng thường thường tùy theo sức gió và hướng gió quyết định, nói chung sau khi bay một

số mét đến mấy chục mét thì rơi xuống đất Sau khi rơi xuống đất thì con đực đi tìm con cái, sau một lúc tiếp xúc thì 4 cánh rụng ngay, muốn vậy cần phải kinh qua phương thức

tự vỗ cánh với tốc độ nhanh hoặc lấy 4 cánh ma sát vào một vật thể khác làm cho 4 cánh rụng đi, lúc này con cái cong phần bụng lên để dụ dỗ, còn con đực thì qua thăm dò để tìm kiếm con cái, sau khi gặp nhau bắt đầu tìm chổ để trú ngụ xây dựng phòng mới, trong thời gian bay hoặc khi rơi xuống thường bị kẻ địch tấn công, nên tỉ lệ mối bị diệt vong tương đối cao, do vậy số lượng mối cánh trưởng thành tuy lớn, nhưng thực tế lượng mối sống sót chỉ chiếm một phần rất ít Sau khi hôn phối khoảng một tuần thì mối bắt đầu đẻ trứng Khả năng sinh sản của mối chúa nguyên thủy, lúc đầu tốc độ đẻ trứng thấp và số trứng đẻ lần đầu rất ít, về sau tùy theo sự trưởng thành của quần thể mà tốc độ đẻ trứng tăng dần Theo Grassé (1949) thì ở điều kiện 250C trứng của K.flavicollis phát triển trong 50 ngày, còn trứng của K.minor ở 210C cần tới 60 – 70 ngày Còn theo tài liệu của Thái Bang Hoa (1964) thì thời kỳ trứng nở ra mối non khoảng gần một tháng, mối non có màu trắng

và rất mềm, hình dạng rất giống mối thợ trưởng thành Mối non trong mấy tuổi ban đầu chưa có hiện tượng phân hóa rõ ràng, lúc này rất khó phân biệt mối lình hay mối thợ,…

Có người cho rằng căn cứ vào độ dài, rộng của đầu mối non để phân biệt đẳng cấp mối

non, điều đó hãy còn chưa khẳng định Trước một tuổi của mối non mà tương lai là mối lính đến mối lính trưởng thành mới biểu hiện đặc trưng rõ ràng, lúc này đã có kiểu dáng của mối lính hoàn toàn, nhưng còn là màu trắng, đầu và chân con mềm như mối non, những cá thể kiểu này gọi là “mối lính mô phỏng” hay “mối lính trắng” sau đó lại qua một lần lột xác sẽ trở thành mối lính Mối non mà trong tương lai trở thành mối cánh trưởng thành khi trên lưng ngực giữa và ngực sau sinh ra mầm cánh mới dễ dàng phân biệt với mối non khác, sau đó cứ tăng thêm một tuổi thì mầm cánh lại dài thêm ra rõ ràng, sau đó sinh ra mắt kép, thân thể cũng to ra so với mối lính, mối thợ trưởng thành và mối non khác, nhưng xung quanh thân vẫn màu trắng và mềm yếu, sau lần lột xác cuối cùng, 4 cánh mới phát triển hoàn toàn, thân thể mới có màu và rắn hơn Mối non của mối thợ từ đầu tới cuối không có biểu hiện đặc trưng rõ ràng Đó là quá trình phân đàn và sinh sống phát triển của quần thể mối

Tổ mối

Phần lớn tổ mối ở trong đất, nhưng cũng có một số loài tổ tiên của chúng ở trong

gỗ Tổ là đại bản doanh của sinh hoạt tập trung của mối, tùy theo loài, điều kiện ngoại cảnh mà tổ của mối thay đổi và trong một trình độ nhất định cũng phản ánh đặc tính sinh vật học của loài mối, nói chung người ta chia làm 3 loại mối (Thái Bang Hoa 1964)

Mối sống trong gỗ

Những loài mối này thường làm tổ trong gỗ khô như mối gỗ khô Cryptotermes,

hoàn toàn không có liên hệ với đất, hoặc ở trong cành khô của cây sống như mối

Glyptotermes cũng không liên hệ với đất Ngoài ra, cũng có thể tìm thấy loài mối nguyên thủy Hodotermopsis tổ của chúng trong gỗ mục ẩm tiếp xúc với đất Tổ của những giống

mối ở trên thuộc đẳng cấp thấp, nên thường kết cấu đơn giản, quần thể không lớn, tổ thường là những khe rỗng, và có những lỗ nhỏ thông từ hang này sang hang khác và thông với bên ngoài

Mối trong đất

Tổ của những loài mối này dựa vào đất mà làm tổ, có thể ở gần phần gỗ của cây hoặc gỗ chôn trong đất, nói chung là tổ của chúng không tách rời khỏi đất, tổ của nhóm mối này có thể chìm trong đất hoặc nửa nổi nửa chìm trong đất như: Odontotermes, Macrotermes, Capritermes,…

Mối sống trong gỗ, đất

Tổ của những loài mối này có thể ở trong gỗ khô, hoặc sống trong thân cây sống hoặc tổ của chúng trong gỗ được chôn trong đất, thậm chí tổ của chúng trong đất Việc chọn nơi xây tổ không khắc khe như 2 nhóm trên có 2 giống mối Coptotermes và

Reticulitermes thuộc loại này Đương nhiên tổ của chúng xây trong gỗ thì vẫn có đường giao thông nối liền với đất và nước

Thức ăn của mối

Mối sử dụng rất nhiều loại thức ăn, nhưng chủ yếu là thực vật Khi khan hiếm nguồn thức ăn mối ăn cả da, xác động vật, len có khi ăn cả trứng mối thậm chí chúng còn

ăn cả mối non (Nguyễn Đức Khảm 1976) Việc nuôi dưỡng quần thể mối chủ yếu do mối thợ đảm nhiệm Thoạt tiên thức ăn qua miệng vào ruột mối thợ, sau đó mối thợ đem thể dịch thức ăn có trong cơ thể nó đã được tiêu hóa hoặc được tiêu hóa một phần ứa ra đường mồm hoặc bài tiết ra từ cuối đường tiêu hóa để mớm cho mối vua, mối chúa, mối lính, mối non mà tự chúng không thể tự lấy thức ăn được, chất bả viên được tống ra ngoài, những chất này thường được dùng để xây tổ Thức ăn của mối có mấy dạng như: thể thực vật sống, gỗ và thực vật khô, các loại nấm, nước và nước có trong thức ăn

2.3 Cellulose

Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật Trong bông nó chiếm đến 90%, còn trong gỗ hơn 50% Ngoài ra, người ta còn thấy chúng tồn tại ở tế bào một số loài vi sinh vật Ở tế bào thực vật và một số loài vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi Khi đun sôi với acid sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disaccharide cellobiose

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các các glucose này và bằng liên kết β-1,4 glucoside Điểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân nhánh Các gốc glucose trong cellulose trong cellulose thường lệch một gốc 1800 và có dạng như một chiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như sau:

(Nguồn: http://sci.waikato.ac.nz/)

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của celluose

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-250000 Dalton Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vandervan và liên kết hydro Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành

vi sợi Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất, chúng tồn tại 2 vùng:

Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên

kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch carbon của mạch khác Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài Enzyme cellulose chỉ có tác dụng bề mặt hệ sợi ở vùng này

Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vandervan Ở vùng này

cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước, chúng dễ trương phồng lên, enzyme cellulose rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng

Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên dẫn xuất ete hoặc este của cellulose Một trong những dẫn xuất được ứng dụng nhiều nhất đố là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc - OCH2COOH

(http://www.foodnk.com/)

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của CMC

Trong tự nhiên celulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi hấp thụ nước Celulose bị thủy phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở nồng độ khá cao, hoặc phân giải dưới tác dụng của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật

2.4 Enzyme cellulase

Giới thiệu về enzyme cellulase

Enzyme cellulose là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ trong thiên nhiên có ý nghĩa rất quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, chế biến thức ăn chăn nuôi và đặc biệt trong việc bảo vệ môi trường Trong tự nhiên, lượng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulose là rất lớn và phong phú Chúng thuộc nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm men và ngay cả trong một số loại côn trùng

Phân loại enzyme cellulose

Enzyme cellulase được chia ra làm 3 nhóm chủ yếu:

- 1,4β-D-glucan cellobiodrolase Enzyme cắt đầu chứ không cắt chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose

- 1,4D-glucan 4 glucanodydrolase Enzyme này tham gia phân giải liên kết 1,4glucosid trong cellulose trong lichenin và β-D-glucan Tham gia tác động đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh

β B-D-glucoside glicohydrolase Tham gia phân giải cellobiose, tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy

Tính chất của enzyme cellulose

Dựa vào đặc tính phân giải cơ chất, các enzyme tham gia phân giải cellulose được chia ra làm 3 nhóm chủ yếu: endocellulase, exocellulase và β-1,4-glucosidase

Endocellulase xúc tác quá trình cắt liên kết β-1,4-glucosidase trong cellulose, lignin và β-D-glucan một cách ngẫu nhiên

Sản phẩm của quá trình phân giải các cellulose từ phân tử nhỏ, cellobiose, glucose Nhiệt độ, pH hoạt động của endocellulase từ vi sinh vật khác nhau cũng có sự khác nhau, nhưng nói chung là hầu hết các enzyme này đều có nhiệt độ hoạt động khá cao Các endocellulose của các sinh vật thường có tính chất khác biệt nhau nhiều

Exocellulase cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellulose dạng kết tinh mà có tác dụng làm thay đổi tính chất lý hóa của chúng, giúp cho endocellulase phân giải chúng

Cellobiose tham gia phân giải cellobiose và cellotetrose thành glucose Chúng không có khả năng phân giải cellulose dạng nguyên thủy enzyme này còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase, β-1,4-glucosidase

Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

- Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự phân giải cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của phức hệ cellulose xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu:

- Trong giai đoạn thứ nhất: dưới tác dụng của cellulose và các tác nhân của môi trường làm thay đổi tính chất lý hóa của cellulose, làm cho phân tử cellulose từ dạng tinh thể thành dạng hoạt động Thực tế, cho đến nay người ta cũng chưa rõ enzyme nào, tác nhân nào tham gia vào quá trình này, người ta gọi các yếu tố này

là C1 Khi phân tử cellulose ở dạng hoạt động, các endocellulose dễ dàng và tác động và phân giải chúng thành cellulose hòa tan (polysaccharide), cellotertrose, cellobiose, glucose, mà chủ yếu của giai đoạn này là tạo thành các cellulose hòa tan

- Giai đoạn thứ hai: các cellulose đã biến đổi sau giai đoạn một bị phân giải các cellobiose (disaccharide) và cellotetrose dưới tác dụng của exocellulase

- Giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của cellobise (β-1,4-glucosidase),các đoạn cellobiose bị thủy phân thành glucose, β-1,4-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệu thủy phân cellobiose thành D-glucose

Quá trình phân giải cellulose chỉ có thể tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loại enzyme trong hệ enzyme cellulose

Hình 2.3 Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulose

Hoạt động xúc tác phân giải cellulose của phức hệ cellulose chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, cơ chất Các cellulose từ các vi sinh vật khác nhau cũng có nhiệt độ, pH, hoạt động không giống nhau Ở cùng một giá trị pH thích hợp (tối thích) với một loại cơ chất dưới các điều kiện nhiệt độ khác nhau, hoạt tính phân hủy cơ chất của cellulose cũng khác nhau

Enzyme tham gia tiêu hóa trong ruột mối chủ yếu là enzyme cellulose có bản chất

là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-, tuy nhiên trong cấu trúc có gắn các phần phụ khác Cấu trúc không gian Cellulase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này từ trung tâm xúc tác nhưng được gắng them vùng glycoside hóa và cuối đuôi này được gắn với cellulose Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường –CO-NH- của protein và việc thay đổi chiều dài của glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xác tác enzyme

2.5 Quá trình phân hủy cellulose diễn ra trong ruột mối

Khi thức ăn (cellulose) được đưa tới đoạn ruột đầu, mối sẽ tiết ra các loại enzyme cellulase làm thay đổi một phần cấu trúc của cellulose Sau đó lượng thức ăn này sẽ được chuyển tới phần ruột sau Tại nơi đây có sự hiện diện của của các vi sinh vật cộng sinh nên quá trình phân giải và chuyển hóa cellulose thành các hợp chất khác xãy ra nhanh chóng và hiệu quả hơn ruột trước (Hoàng Đức Nhuận, Nguyễn Đức Khảm, 1993)

(Nguồn: http://microbewiki.kenyon.edu/)

Hình 2.4 Cấu tạo ruột mối

A: Ảnh phần trên bên phải là ruột sau nơi sống của hệ vi khuẩn cộng sinh

B: Chi tiết ruột mối E: thực quản, SG: tuyến nước bọt, FG: ruột trước, MG: ruột giữa MT: ống Malpigi, HG: ruột sau

Vùng ruột sau của mối được xem là nơi tiêu hóa và lên men cellulose thành các chuỗi acid béo ngắn sau đó được hấp thu và oxy hóa (Brune, Andreasw, 2000) Vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối sản sinh ra các loại enzyme cellulase khác nhau để phá vỡ cellulose để chuyển hóa thành đường và một số hợp chất khác Bên cạnh đó sản phẩm này còn được tiếp tục lên men tạo thành CO2, H2, acetate,…Trong quá trình lên men, ATP cũng được tạo ra dưới dạng có sẵn cho cả vi khuẩn và mối (Ohkuma, 2006)

Hình 2.5 Quá trình biến đổi thức ăn xảy ra trong ruột mối

Một điểm đáng chú ý là mối và các vi sinh vật sống riêng lẻ nên chúng không thể cộng sinh một cách tự nhiên qua các thế hệ Vì vậy mối trưởng thành tiết ra chất dịch chứa các vi sinh vật qua lỗ hậu môn, mối non sẽ liếm các chất dịch này để có được hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột của chúng Ngoài ra mối còn có tập tính ăn phân lẫn nhau nên vi sinh vật cộng sinh cũng chuyển từ ruột mối con này qua ruột mối con khác (Phan Văn Cự, 1998)

2.6 Các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã được nghiên cứu

2.6.1 Những nghiên cứu nước ngoài

Viện nghiên cứu Genome thuộc Bộ năng lượng Mỹ đã xác định những enzyme của

vi khuẩn trong ruột mối có chứa chất tiêu hoá gỗ, chuyển chất thải cây trồng như là cùi bắp trở thành ethanol, nguyên liệu dùng làm năng lượng sinh học và rất thân thiện với môi trường

Nghiên cứu của Wasmann (1893) về phân loại 4 loài Ternmes redemani, Termes azarelli, Termes feae và Termes xenotermitis được tìm thấy ở Ấn Độ và Ceylon trong khu

hệ mối Đông Phương và vài loại thuộc khu hệ Brazil

Tối ưu hóa quá trình lên men rắn để sản sinh cellulose từ Trichoderma koningii (Pei-Jun et al.,2004)

Clostridium papyrosolens cũng được phát hiện khả năng tổng hợp cellulase Clostridium papyrosolens được nuôi cấy 48h trong điều kiện k khí ở 35oC cho dịch trích hoạt tính CMCase cao CMCase có nhiệt độ tối thích là 35oC và PH tối thích là 6.5 đến 7.5 (Rani, 2004)

Các nghiên cứu gần đây về hệ vi sinh vật và sinh vật nguyên sinh sống cộng sinh

trong ruột mối họ Rhinotermitidae đã cho thấy vi khuẩn nội cộng sinh trong các sinh vật nguyên sinh có khả năng phân hủy được cellulose trong ruột mối của Noda et al năm

2007

2.6.2 Những nghiên cứu trong nước

Xủ lý mạt dừa sau trồng nấm bào ngư bằng xạ khuẩn Kết quả của thí nghiệm đã chọn ra được dòng V4 có khả năng phân hủy lignin, cellulose và tăng hàm lượng nitơ cao nhất (Lương Bảo Uyên và Phạm thì Hồng Ánh, 2008)

Sàng lọc vi sinh vật cellulose sử dụng thủy phân bã agar, đã chọn được 2 chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulose ngoại bào có hoạt tính cao và mạnh hơn 18% so với chế phẩm enzyme cellulose thương mại (Võ Hoài Bắc, 2008)

Khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn từ con mối để thủy phân bột giấy (Nguyễn Châu Tuấn, 2010)

Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Phượng Hải (1996) đã tuyển chọn vi sinh vật tổng hợp enzyme cellulose cao để xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm

- Đĩa Petri, đèn cồn, que cấy

- Lame, kẹp, đũa thủy tinh

- Máy đo OD Beckman Coulter DU 640B (Đức)

- Máy ly tâm Mikro 1224 (Trung Quốc)

- Tủ ủ vi sinh vật Memmert (Đức)

- Tủ cấy vi sinh vật Laminar Flow (Việt Nam)

- Cân điện tử Mettler Toler (Switzerland)

- Tủ lạnh trữ vi khuẩn

- Máy vi tính để phân tích và lưu trữ số liệu

Hình 3.1 Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu 3.2.3 Các hóa chất và môi trường sử dụng để nghiên cứu

Hóa chất

- Alcohol 30%

- Hóa chất nhuộm Gram: crystal violet, lugol, safranin, ethanol 70%

- Dung dịch congo red, dung dịch NaCl

- Glyceral 10%, methanol, phenol, H2SO4 đậm đặc, Glucose

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Bảng 3.1 Môi trường MRS

(Nguồn Ulrich et al 2008)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thu mẫu mối

Mẫu mối được thu và giữ tại các địa điểm khác nhau tại U Minh Thượng ghi nhận tọa độ thu mẫu, môi trường sinh thái ( nhiệt độ, địa hình, thảm thực vật,…) cho vào hộp

nhựa và đánh số tạm thời, ghi chép các đặc điểm quan sát đƣợc trong quá trình thu mẫu

vào sổ nhật ký Sau đó, mang về phòng thí nghiệm để ở nhiệt độ phòng

Trong ruột mối có nhiều vi sinh vật cộng sinh, các chủng vi khuẩn được tách ròng không hẳn phân hủy được cellulose Vì thế, việc kiểm tra khả năng phân hủy cellulose tương đối tốn thời gian, công sức và hóa chất nên cần có một bước sàng lọc các chủng vi

khuẩn có khả năng phân giải cellulose trước khi tiến hành kiểm tra khả năng này CMC là chất có nguồn gốc từ cellulose nhưng việc thủy phân phân tử này dễ dàng hơn nhiều với cellulose Do đó việc kiểm tra khả năng phân giải CMC được xem là bước trung gian cần thiết trong quá trình chọn ra các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose

Các bước tiến hành

- Xử lý mẫu và cấy mẫu vào môi trường

- Cấy chuyền và kiểm tra độ ròng của vi khuẩn

- Chủng CMC và chọn các chủng có khả năng phân hủy cao CMC

- Sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

3.3.2.1 Cấy mẫu vào môi trường phân lập

Chuẩn bị môi trường phân lập: hấp khử trùng nhiệt ướt môi trường MRS và đĩa

Petri ở 1210C Sau đó rót môi trường vào đĩa (khoảng một phần ba đĩa), khi môi trường khô đậy nắp và lật ngược đĩa lại, các thao tác trên đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng

Chuẩn bị mẫu: dùng dao nhỏ hoặc kim mũi giáo tách ổ mối để thu được phần mối

bên trong Nhẹ nhàng lấy mối ra khỏi ổ và cho mối chạy trên đĩa Petri đã có sẵn giấy lọc

Khử trùng mẫu cấy: mỗi ổ mối chọn ra 20 con (mối thợ) làm mẫu cấy, cho mẫu

vào cồn 70 độ khoảng 30 giây, lấy mẫu ra và rửa nhanh trong nước cất sau đó để mẫu lên

tờ giấy lọc cho ráo nước, các thao tác trên thực hiện trong tủ cấy vô trùng

Cấy mẫu vào môi trường: dùng bút lông tạo sẵn các điểm phía dưới đĩa Petri,

dùng kẹp nhỏ kẹp nhẹ vào bụng mối cho đến khi phần dịch trong bụng mối chảy ra và chấm dịch này vào các điểm đã đánh dấu trước Sau mỗi lần chấm đều hơ kẹp trên đèn cồn Mỗi đĩa chấm 10 chấm mỗi chấm tương ứng với một con mối Đậy nắp đĩa lại và lật ngữa đĩa cho vào túi nilon cột kín và ủ ở tủ ủ vi sinh 320C Sau 48h, quan sát thấy các đóm màu vàng hoặc màu trắng xuất hiện trên bề mặt môi trường và ngay những điểm đã làm dấu, điều này chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn trong ruột mối

3.3.2.2 Cấy chuyền và kiểm tra độ ròng của vi khuẩn

Cấy chuyền vi khuẩn: từ những đĩa cấy mẫu ban đầu chọn những những khuẩn lạc

ở vị trí đánh dấu Mỗi khuẩn lạc cấy chuyền nhiều lần trên môi trường MRS theo phương pháp cấy ria để tách ròng các chủng vi khuẩn

Thao tác cấy chuyền: Khử trùng đầu que cấy bằng cách hơ đỏ đầu que cấy trên

ngọn lửa đèn cồn, hơ nhanh mép ngoài của đĩa mẫu để làm sạch môi trường xung quanh đĩa, đưa que cấy đã khử trùng vào đĩa mẫu, lầm nguội que cấy bằng cách chấm vào phần thạch không có vi khuẩn sau đó chấm vào một khuẩn lạc và rút que cấy ra đậy nắp đĩa lại

Hơ nhanh mép đĩa môi trường, mở nắp hé đĩa và đưa que cấy đã chứa vi khuẩn vào bên trong đĩa Đặt đầu que cấy vào một góc đĩa chấm vài chấm để loại bỏ bớt vi khuẩn, từ

vị trí này trượt nhẹ đầu que cấy trên môi trường theo đường zích zắc, đậy nắp đĩa và khử trùng que cấy Xoay đĩa mở nắp và làm nguội đầu que cấy Bắt đầu từ một điểm của đường cấy thứ nhất và cấy đường cấy thứ hai vuông góc với đường cấy thứ nhất Xoay đĩa, hé mở nắp đĩa và làm nguội que cấy, bắt đầu từ một cành của đường cấy thứ hai cấy đường cấy thứ ba vuông góc với đường cấy thứ hai sau đó đậy nắp đĩa và úp ngược đĩa lại Bịt kín bằng túi nilon ủ trong tủ ủ vi sinh ở 320

C trong 48h

Kiểm tra độ ròng của vi khuẩn: cấy chuyền đến khi thấy được các khuẩn lạc rời

nhau trên đường cấy thứ ba và các khuẩn lạc trên môi trường đã đồng nhất về hình dạng, kích thước, màu sắc,…Tiến hành quan sát kiểm tra độ ròng của vi khuẩn dưới kính hiển

vi

Nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên kính mang vật, dùng kim cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn chấm vào khuẩn lạc sau đó trãi đều lên giọt nước trên kính mang vật và đậy bằng kính đậy vật và quan sát dưới kính hiển vi quang học Mỗi khuẩn lạc chỉ chứa một loại tế bào giống nhau về hình dạng và kích thước chứng tỏ chủng vi khuẩn đã ròng

Trữ mẫu: chọn mỗi chủng là một khuẩn lạc rời để trữ mẫu Các chủng vi khuẩn đã

ròng dự trữ ở 40C sử dụng trong 30 ngày Khi cần trữ lâu hơn thì các chủng vi khuẩn sẽ được phủ lên bề mặt một lớp glycerol 10% trước khi trữ đông với cách này có thể trữ vi khuẩn từ 6 đến 12 tháng

3.3.3 Quan sát đặc điểm của khuẩn lạc và vi khuẩn

3.3.3.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc

Các chỉ tiêu để quan sát bao gồm: màu sắc, độ nổi, dạng bìa, hình dạng và kích thước sau khi đã nuôi cấy sau 48h

- Hình dạng: dạng tròn, dạng tròn, dạng không đều, dạng thoi,…

- Độ nổi: dạng phẳng, dạng lài, dạng mô

- Dạng bìa: bìa nguyên, gợn sóng, bìa thùy, bìa răng cưa,…

- Màu sắc: Trắng trong, trắng đục, xám, vàng, lục,…

- Kích thước: nhỏ, lớn,

3.3.3.2 Quan sát vi khuẩn

Các chỉ tiêu quan sát vi khuẩn bao gồm: hình dạng, kích thước, khả năng di chuyển

và loại Gram dựa vào phương pháp nhuộm Gram (Cao Ngọc Điệp & Nguyễn Hữu Hiệp,

Nguyên tắc nhuộm Gram: Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào vi khuẩn nên vi

khuẩn Gram dương (+) nên không bị tẩy màu của alcohol mà vẫn giữ được màu của phức hợp Crystal violet Khi đó, Vi khuẩn Gram âm (-) không giữ được màu của phức này sau khi xử lý bằng alcohol

Các bước tiến hành nhuộm Gram

- Lấy một ít vi khuẩn cho lên giọt nước cất đã được nhỏ sẵn trên lame, Trãi mẫu thật đều và mỏng, để khô tự nhiên và cố định mẫu bằng cách hơ nóng lame trên ngọn đèn cồn

- Nhỏ 1 – 2 giọt crystal violet cho phủ đều bề mặt vi khuẩn cần nhuộm và để yên trong một phút

- Rửa nhanh với nước và để khô tự nhiên

- Nhỏ 1 – 2 giọt Lugol cho phủ đều bề mặt nhuộm và để yên một phút

- Rửa nhanh vơi nước và để khô tự nhiên

- Rửa bằng alcohol thật nhanh cho đến không còn màu tím

- Rửa nhanh với nước và để khô tự nhiên

- Nhỏ 1 – 2 giọt Safranin cho phủ đều bề mặt nhuộm và để yên trong một phút

- Rửa nhanh với nước, để khô tự nhiên

- Quan sát hình dạng, kích thước, và loại Gram dưới kính hiển vi ở vậy kính 40

Kết quả và biện luận:

- Nếu vi khuẩn bắt màu tím xanh của Crystal violet là vi khuẩn Gram dương

- Nếu vi khuẩn bắt màu hồng đỏ của Safranin là vi khuẩn Gram âm

3.3.4 Khảo sát khả năng phân giải CMC (Carboxy methyl cellulose) của các chủng

vi khuẩn đã tách ròng

Mục đích thí nghiệm: nhằm đánh giá bước đầu khả năng phân giải cellulose của

các chủng vi khuẩn phân lập được từ ruột mối Chọn ra những chủng phân giải cellulose mạnh để làm các thí nghiệm tiếp theo

Nguyên tắc thí nghiệm: sau khi chủng trên các chủng vi khuẩn trên môi trường

CMC và nhuộm với congo red thì xung quanh khuẩn lạc sẽ tạo ra vòng không màu

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên, mỗi nhân tố là một

chủng vi khuẩn với 3 lần lặp lại

Các bước tiến hành: thí nghiệm được thực hiện trên môi trường CMC, lấy đầy

một vòng que cấy vi khuẩn cho vào 1 tube có chứa 30µl nước cất đã khử trùng sau đó vortex Hút 10µl dung dịch vi khuẩn nhỏ vào đĩa Petri đã chứa sẵn môi trường CMC, mỗi đĩa 3 giọt Ủ ở 320C ở tủ ủ 3 ngày, sau đó xác định khả năng phân hủy CMC bằng phương pháp nhuộm Congo Red (1/l) lên đĩa thạch 15 phút, tiếp đó rữa lại bằng dung dịch NaCl 1M Vi khuẩn phân hủy được CMC sẽ tạo vòng tròn halo không màu xung quanh khuẩn lạc

Công thức tính khả năng phân hủy CMC (%):

(Đường kính halo – đường kính khuẩn lạc) / Đường kính halo x 100

Biện luận kết quả: dựa vào phần trăm phân hủy để đánh giá khả năng phân giải

CMC Chủng vi khuẩn nào có phần trăm phân giải CMC lớn nghĩa là chúng có khả năng phân giải cellulose mạnh và ngược lại Chọn ra các chủng phân giải CMC tốt nhất để làm thí nghiệm tiếp theo

3.3.5 Khảo sát mật số của tế bào vi khuẩn nuôi trong môi trường MRS lỏng

Để đánh giá sự phân hủy CMC một cách chính xác giữa các chủng vi khuẩn cần đảm bảo số lượng tương đối đồng đều Vì vậy phải tiến hành đếm mật số tế bào và điều chỉnh lượng vi khuẩn trước khi tiến hành thí nghiệm Dùng que cấy lấy một phần sinh khối vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường MRS lỏng đã khử trùng sau đó

để ở nhiệt độ phòng trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 3 ngày sau đó tiến hành pha loãng và đếm mật số vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp, 2010)

Pha loãng mẫu: mỗi mẫu pha loãng được pha thành 10 độ pha loãng bậc 10 liên

tiếp với 10 ống nghiệm 20ml Ghi sẵn kí hiệu độ pha loãng lên thành ống nghiệm và sắp xếp theo thứ tự từ 1 đến 10, trộn đều mẫu, hút 1ml dịch vi khuẩn gốc cho vào ống nghiệm 1chứa 9ml nước cất đã được khử trùng Lúc này mẫu được pha loãng 10 lần và nồng độ pha loãng là 101 Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm 1 cho vào 9ml nước cất vô trùng ở ống nghiệm 2 thì mẫu dung dịch gốc được pha loãng 100 lần, và nồng độ pha loãng là 102

Tiếp tục cho đến ống nghiệm 10 thì dung dich pha loãng đạt nồng độ pha loãng là 1010

nhau nhỏ vào các vị trí đã đánh dấu trên môi trường MRS thạch, mỗi đĩa chia thành 4 vùng tương ứng với 4 nồng độ pha loãng mỗi vùng đánh dấu 5 vị trí để nhỏ 5 giọt), mỗi nồng độ pha loãng làm với 3 lần lặp lại Ủ đĩa trong tủ ủ vi sinh ở 320C trong 48h

Tính toán kết quả: đếm số khuẩn lạc ở 5 vị trí nhỏ giọt và tính trung bình số khuẩn

lạc trên 1µl dịch khuẩn và tính số tế bào vi khuẩn trên 1ml dịch vi khuẩn theo công thức:

CFU/ml = số khuẩn lạc trung bình/ µl x độ pha loãng x 10 3

Sau khi số lượng tế bào ở các mẫu tương đối đồng đều khoảng 109CFU/ml thì tiếp tục tiến hành thí nghiệm

3.3.6 Kiểm tra khả năng phân hủy rơm, trấu và giấy của từng chủng vi khuẩn

Mục đích thí nghiệm:

- Định lượng lượng đường glucose tạo ra do vi khuẩn phân giải cơ chất

- So sánh khả năng phân hủy cellulose thành glucose giữa các chủng vi khuẩn trên cùng một cơ chất và giữa 3 cơ chất trên cùng một chủng vi khuẩn

- Chọn các chủng vi khuẩn phân hủy cellulose thành glucose cao nhất

Nguyên tắc thí nghiệm: Tiến hành kiểm tra lượng glucose tạo ra để đánh giá được

khả năng phân giải cellulose thành glucose của từng chủng vi khuẩn Lượng đường khử sinh ra sẽ kết hợp với phenol, methanol và acid sunfuric đậm đặc tạo được phức hợp màu vàng nâu và được hấp thụ với bước sóng 490nm

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần với lần

lược các nghiệm thực là các chủng vi khuẩn so với thí nghiệm đối chứng không vi khuẩn

Các bước tiến hành thí nghiệm:

- Ủ các chủng vi khuẩn vào cơ chất là rơm, trấu và giấy

- Xây dụng đường chuẩn glucose

- Xác định hàm lượng đường glucose được tạo ra

3.3.6.1 Ủ các chủng vi khuẩn vào rơm, trấu và giấy

Chuẩn bị vi khuẩn: Chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải CMC tố để

tiến hành thí nghiệm Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn cho vào ống nghiệm có nắp đã chứa 5ml môi trường MRS lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 3 ngày

Chuẩn bị vơ chất: Rơm, trấu, giấy được xay nhỏ, cân 1g mỗi loại cơ chất sau đó

cho vào bình tam giác dung tích 500ml Đậy kính nút gòn và hấp khủ trùng nhiệt ướt ở

1210C để đảm bảo độ sạch của cơ chất không có sự tồn tại của các vi khuẩn khác có sẵn trong cơ chất

Ủ vi khuẩn vào cơ chất: ủ lần lượt 20 chủng vi khuẩn phân giải CMC cao vào

từng loại cơ chất là rơm, trấu và giấy theo công thức sau:

5ml dịch vi khuẩn + 25ml nước cất + 1g cơ chất

Lắc đều mẫu trên máy lắc trong 24h với tốc độ 150 vòng/phút sau đó bọc giấy bạc bao kín và cho vào thùng giấy đậy kín để trong điều kiện phòng thí nghiệm ban ngày nhiệt độ dao động từ 25 –280C, ban đêm nhiệt độ dao động từ 28 – 320C, pH của mẫu khoảng 5,5 – 6 sau đó khảo sát khả năng phân hủy cellulose tạo ra glucose theo thời gian

là 5, 10 và 15 ngày bằng phương pháp đo OD với bước sóng cực đại 490nm

3.3.6.2 Xây dựng đường chuẩn glucose

Pha dung dịch đường chuẩn glucose với nồng độ 1000ppm (1000µg/ml) từ đó pha dung dịch gốc có nồng độ là 100ppm Từ dung dịch gốc pha ra dãy đường chuẩn glucose

3.3.6.3 Xác định lượng đường tạo ra từ cơ chất

Chuẩn bị mẫu đo OD:

Hút 2ml dung dịch từ các lọ ủ cơ chất với vi khuẩn cho vào các ống khác nhau, sau

đó đem ly tâm dung dịch với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút và thu phần dịch lỏng trong phần trên của ống

Hút 1ml dịch lỏng cho vào ống khác, sau đó thêm tiếp 9ml dung dịch methanol 80% trộn đều lên ta được dung dịch A Hút 50µl dung dịch A cho vào ống nghiệm khác thêm tiếp vào 450µl dung dịch methanol 80% + 500µl dung dịch phenol 5% + 2.5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc

Lắc đều dung dịch trên bằng máy vortex và để nguội, dung dịch thu được sẽ tạo phức màu nâu Sau đó đem dung dịch đi đo OD ở bước sóng cực đại 490nm và so sánh với mẫu trắng

Mẫu trắng bao gồm 500µl dung dịch methanol 80% + 500µl dung dịch phenol 5% + 2.5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc

Tính toán kết quả:

Dựa vào phương trình đường chuẩn glucose đã xây dựng và giá trị OD của mẫu (sau khi đã trừ đi giá trị của mẫu trắng) suy ra nồng độ glucose: x = (y-b)/a Từ đó tính ra lượng đường được khử theo công thức sau:

Vx10-3 : thể tích dung dịch đem đi phân tích (ml)

Cx10-3 : nồng độ đo được quy đổi từ phương trình đường chuẩn (mg/ml)

v : thể tích dung dịch pha loãng ban đầu (ml)

1000: tính trên 1000ml mẫu dung dịch

K : hệ số pha loãng

m : khối lượng cơ chất (mg)

Biện luận kết quả: lượng glucose tạo ra nhiều chứng tỏ vai trò của vi khuẩn trong

việc phân giải cellulose thành glucose

Định tính lượng đường tạo ra: Hút 1ml dung dịch vi khuẩn ủ với cơ chất từ bình

tam giác cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 3 giọt Trommer, lắc nhẹ cho đều dung dịch sau đó đun trên ngọn lửa đền cồn Nếu có glucose tạo ra, glucose sẽ kết hợp với Cu(OH)2

và kết tủa màu đỏ gạch

Thu mẫu mối

Xác định thành phần loài mối

Phân lập và tách ròng các chủng vi khuẩn trên môi trường MRS

Quan sát, ghi nhận đặc điểm khuẩn lạc và vi khuẩn

Kiểm tra khả năng phân hủy CMC

Kiểm tra khả năng phân hủy rơm rạ, trấu và giấy

Trữ mẫu vi khuẩn

Hình 3.8 Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu