Các chỉ tiêu quan sát vi khuẩn bao gồm: hình dạng, kích thƣớc, khả năng di chuyển và loại Gram dựa vào phƣơng pháp nhuộm Gram (Cao Ngọc Điệp & Nguyễn Hữu Hiệp,
Nguyên tắc nhuộm Gram: Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào vi khuẩn nên vi khuẩn Gram dƣơng (+) nên không bị tẩy màu của alcohol mà vẫn giữ đƣợc màu của phức hợp Crystal violet. Khi đó, Vi khuẩn Gram âm (-) không giữ đƣợc màu của phức này sau khi xử lý bằng alcohol.
Các bước tiến hành nhuộm Gram
- Lấy một ít vi khuẩn cho lên giọt nƣớc cất đã đƣợc nhỏ sẵn trên lame, Trãi mẫu thật đều và mỏng, để khô tự nhiên và cố định mẫu bằng cách hơ nóng lame trên ngọn đèn cồn.
- Nhỏ 1 – 2 giọt crystal violet cho phủ đều bề mặt vi khuẩn cần nhuộm và để yên trong một phút.
- Rửa nhanh với nƣớc và để khô tự nhiên.
- Nhỏ 1 – 2 giọt Lugol cho phủ đều bề mặt nhuộm và để yên một phút. - Rửa nhanh vơi nƣớc và để khô tự nhiên.
- Rửa bằng alcohol thật nhanh cho đến không còn màu tím. - Rửa nhanh với nƣớc và để khô tự nhiên.
- Nhỏ 1 – 2 giọt Safranin cho phủ đều bề mặt nhuộm và để yên trong một phút. - Rửa nhanh với nƣớc, để khô tự nhiên.
- Quan sát hình dạng, kích thƣớc, và loại Gram dƣới kính hiển vi ở vậy kính 40.
Kết quả và biện luận:
- Nếu vi khuẩn bắt màu tím xanh của Crystal violet là vi khuẩn Gram dƣơng. - Nếu vi khuẩn bắt màu hồng đỏ của Safranin là vi khuẩn Gram âm.
3.3.4. Khảo sát khả năng phân giải CMC (Carboxy methyl cellulose) của các chủng
vi khuẩn đã tách ròng
Mục đích thí nghiệm: nhằm đánh giá bƣớc đầu khả năng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ ruột mối. Chọn ra những chủng phân giải cellulose mạnh để làm các thí nghiệm tiếp theo.
Nguyên tắc thí nghiệm: sau khi chủng trên các chủng vi khuẩn trên môi trƣờng CMC và nhuộm với congo red thì xung quanh khuẩn lạc sẽ tạo ra vòng không màu.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí một cách ngẫu nhiên, mỗi nhân tố là một chủng vi khuẩn với 3 lần lặp lại.
Các bước tiến hành: thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng CMC, lấy đầy một vòng que cấy vi khuẩn cho vào 1 tube có chứa 30µl nƣớc cất đã khử trùng sau đó vortex. Hút 10µl dung dịch vi khuẩn nhỏ vào đĩa Petri đã chứa sẵn môi trƣờng CMC, mỗi đĩa 3 giọt. Ủ ở 320C ở tủ ủ 3 ngày, sau đó xác định khả năng phân hủy CMC bằng phƣơng pháp nhuộm Congo Red (1/l) lên đĩa thạch 15 phút, tiếp đó rữa lại bằng dung dịch NaCl 1M. Vi khuẩn phân hủy đƣợc CMC sẽ tạo vòng tròn halo không màu xung quanh khuẩn lạc.
Công thức tính khả năng phân hủy CMC (%):
(Đƣờng kính halo – đƣờng kính khuẩn lạc) / Đƣờng kính halo x 100
Biện luận kết quả: dựa vào phần trăm phân hủy để đánh giá khả năng phân giải CMC. Chủng vi khuẩn nào có phần trăm phân giải CMC lớn nghĩa là chúng có khả năng phân giải cellulose mạnh và ngƣợc lại. Chọn ra các chủng phân giải CMC tốt nhất để làm thí nghiệm tiếp theo.
3.3.5. Khảo sát mật số của tế bào vi khuẩn nuôi trong môi trƣờng MRS lỏng
Để đánh giá sự phân hủy CMC một cách chính xác giữa các chủng vi khuẩn cần đảm bảo số lƣợng tƣơng đối đồng đều. Vì vậy phải tiến hành đếm mật số tế bào và điều chỉnh lƣợng vi khuẩn trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Dùng que cấy lấy một phần sinh khối vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng MRS lỏng đã khử trùng sau đó để ở nhiệt độ phòng trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 3 ngày sau đó tiến hành pha loãng và đếm mật số vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp, 2010)
Pha loãng mẫu: mỗi mẫu pha loãng đƣợc pha thành 10 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp với 10 ống nghiệm 20ml. Ghi sẵn kí hiệu độ pha loãng lên thành ống nghiệm và sắp xếp theo thứ tự từ 1 đến 10, trộn đều mẫu, hút 1ml dịch vi khuẩn gốc cho vào ống nghiệm 1chứa 9ml nƣớc cất đã đƣợc khử trùng. Lúc này mẫu đƣợc pha loãng 10 lần và nồng độ pha loãng là 101. Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm 1 cho vào 9ml nƣớc cất vô trùng ở ống nghiệm 2 thì mẫu dung dịch gốc đƣợc pha loãng 100 lần, và nồng độ pha loãng là 102
. Tiếp tục cho đến ống nghiệm 10 thì dung dich pha loãng đạt nồng độ pha loãng là 1010
.
Nhỏ giọt: sử dụng micropipette hút 1µl dung dịch mẫu ở từng độ pha loãng khác nhau nhỏ vào các vị trí đã đánh dấu trên môi trƣờng MRS thạch, mỗi đĩa chia thành 4 vùng tƣơng ứng với 4 nồng độ pha loãng mỗi vùng đánh dấu 5 vị trí để nhỏ 5 giọt), mỗi nồng độ pha loãng làm với 3 lần lặp lại. Ủ đĩa trong tủ ủ vi sinh ở 320C trong 48h.
Tính toán kết quả: đếm số khuẩn lạc ở 5 vị trí nhỏ giọt và tính trung bình số khuẩn lạc trên 1µl dịch khuẩn và tính số tế bào vi khuẩn trên 1ml dịch vi khuẩn theo công thức:
CFU/ml = số khuẩn lạc trung bình/ µl x độ pha loãng x 103
Sau khi số lƣợng tế bào ở các mẫu tƣơng đối đồng đều khoảng 109CFU/ml thì tiếp tục tiến hành thí nghiệm.
3.3.6. Kiểm tra khả năng phân hủy rơm, trấu và giấy của từng chủng vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mục đích thí nghiệm:
- Định lƣợng lƣợng đƣờng glucose tạo ra do vi khuẩn phân giải cơ chất.
- So sánh khả năng phân hủy cellulose thành glucose giữa các chủng vi khuẩn trên cùng một cơ chất và giữa 3 cơ chất trên cùng một chủng vi khuẩn.
- Chọn các chủng vi khuẩn phân hủy cellulose thành glucose cao nhất.
Nguyên tắc thí nghiệm: Tiến hành kiểm tra lƣợng glucose tạo ra để đánh giá đƣợc khả năng phân giải cellulose thành glucose của từng chủng vi khuẩn. Lƣợng đƣờng khử sinh ra sẽ kết hợp với phenol, methanol và acid sunfuric đậm đặc tạo đƣợc phức hợp màu vàng nâu và đƣợc hấp thụ với bƣớc sóng 490nm.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên và đƣợc lặp lại 3 lần với lần lƣợc các nghiệm thực là các chủng vi khuẩn so với thí nghiệm đối chứng không vi khuẩn.
Các bước tiến hành thí nghiệm:
- Ủ các chủng vi khuẩn vào cơ chất là rơm, trấu và giấy. - Xây dụng đƣờng chuẩn glucose.
- Xác định hàm lƣợng đƣờng glucose đƣợc tạo ra.
3.3.6.1. Ủ các chủng vi khuẩn vào rơm, trấu và giấy
Chuẩn bị vi khuẩn: Chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải CMC tố để tiến hành thí nghiệm. Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn cho vào ống nghiệm có nắp đã chứa 5ml môi trƣờng MRS lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 3 ngày.
Chuẩn bị vơ chất: Rơm, trấu, giấy đƣợc xay nhỏ, cân 1g mỗi loại cơ chất sau đó cho vào bình tam giác dung tích 500ml. Đậy kính nút gòn và hấp khủ trùng nhiệt ƣớt ở 1210C để đảm bảo độ sạch của cơ chất không có sự tồn tại của các vi khuẩn khác có sẵn trong cơ chất.
Ủ vi khuẩn vào cơ chất: ủ lần lƣợt 20 chủng vi khuẩn phân giải CMC cao vào từng loại cơ chất là rơm, trấu và giấy theo công thức sau:
Lắc đều mẫu trên máy lắc trong 24h với tốc độ 150 vòng/phút sau đó bọc giấy bạc bao kín và cho vào thùng giấy đậy kín để trong điều kiện phòng thí nghiệm ban ngày nhiệt độ dao động từ 25 –280C, ban đêm nhiệt độ dao động từ 28 – 320C, pH của mẫu khoảng 5,5 – 6 sau đó khảo sát khả năng phân hủy cellulose tạo ra glucose theo thời gian là 5, 10 và 15 ngày bằng phƣơng pháp đo OD với bƣớc sóng cực đại 490nm.
3.3.6.2. Xây dựng đường chuẩn glucose
Pha dung dịch đƣờng chuẩn glucose với nồng độ 1000ppm (1000µg/ml) từ đó pha dung dịch gốc có nồng độ là 100ppm. Từ dung dịch gốc pha ra dãy đƣờng chuẩn glucose có nồng độ từ 0 – 100ppm theo bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần của dãy đƣờng chuẩn glucose
Nồng độ Thể tích Thể tích Thể tích Thể tích
STT Glucose Glucose CH3OH Phenol H2SO4
(µg/ml) (µl) (µl) (ml) (ml) 1 0 0 1000 1 5 2 10 100 900 1 5 3 20 200 800 1 5 4 30 300 700 1 5 5 40 400 600 1 5 6 50 500 500 1 5 7 60 600 400 1 5 8 70 700 300 1 5 9 80 800 200 1 5 10 90 900 100 1 5 11 100 1000 0 1 5
Sau khi pha xong dãy dung dịch đƣờng chuẩn glucose, ta lắc đều các ống nghiệm bằng máy vortex, để cho dung dịch nguội và đo OD ở bƣớc sóng 490nm. Dựa vào giá trị đo OD của dãy đƣờng chuẩn ta xây dựng đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn y = a.x + b.
3.3.6.3. Xác định lượng đường tạo ra từ cơ chất Chuẩn bị mẫu đo OD: Chuẩn bị mẫu đo OD:
Hút 2ml dung dịch từ các lọ ủ cơ chất với vi khuẩn cho vào các ống khác nhau, sau đó đem ly tâm dung dịch với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút và thu phần dịch lỏng trong phần trên của ống.
Hút 1ml dịch lỏng cho vào ống khác, sau đó thêm tiếp 9ml dung dịch methanol 80% trộn đều lên ta đƣợc dung dịch A. Hút 50µl dung dịch A cho vào ống nghiệm khác thêm tiếp vào 450µl dung dịch methanol 80% + 500µl dung dịch phenol 5% + 2.5ml dung dịch H2SO4đậm đặc.
Lắc đều dung dịch trên bằng máy vortex và để nguội, dung dịch thu đƣợc sẽ tạo phức màu nâu. Sau đó đem dung dịch đi đo OD ở bƣớc sóng cực đại 490nm và so sánh với mẫu trắng.
Mẫu trắng bao gồm 500µl dung dịch methanol 80% + 500µl dung dịch phenol 5% + 2.5ml dung dịch H2SO4đậm đặc.
Tính toán kết quả:
Dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn glucose đã xây dựng và giá trị OD của mẫu (sau khi đã trừ đi giá trị của mẫu trắng) suy ra nồng độ glucose: x = (y-b)/a. Từ đó tính ra lƣợng đƣờng đƣợc khử theo công thức sau:
X = C x 10 -3 x K x V x 1000 (mg) v x 10-3 x m Trong công thức:
Vx10-3 : thể tích dung dịch đem đi phân tích (ml) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cx10-3 : nồng độ đo đƣợc quy đổi từ phƣơng trình đƣờng chuẩn (mg/ml)
v : thể tích dung dịch pha loãng ban đầu (ml) 1000: tính trên 1000ml mẫu dung dịch
K : hệ số pha loãng
m : khối lƣợng cơ chất (mg)
Biện luận kết quả: lƣợng glucose tạo ra nhiều chứng tỏ vai trò của vi khuẩn trong việc phân giải cellulose thành glucose.
Định tính lƣợng đƣờng tạo ra: Hút 1ml dung dịch vi khuẩn ủ với cơ chất từ bình tam giác cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 3 giọt Trommer, lắc nhẹ cho đều dung dịch sau đó đun trên ngọn lửa đền cồn. Nếu có glucose tạo ra, glucose sẽ kết hợp với Cu(OH)2 và kết tủa màu đỏ gạch.
Thu mẫu mối
Xác định thành phần loài mối
Phân lập và tách ròng các chủng vi khuẩn trên môi trƣờng MRS Quan sát, ghi nhận đặc điểm khuẩn lạc và vi khuẩn
Kiểm tra khả năng phân hủy CMC
Kiểm tra khả năng phân hủy rơm rạ, trấu và giấy Trữ mẫu vi khuẩn
CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Mô tả hình thái và xác định thành phần loài mối
4.1.1. Mối thợ (mối lao động)
Cơ thể chia là 3 phần bào gồm phần đầu, phần ngực và phần bụng. Phần đầu có thể chuyển động và mang bộ phận miệng, mắt, và đôi râu. Ngực có 3 đốt tƣơng ứng với 3 đôi chân. Bụng có 10 đốt, mức độ kitin hóa ở miệng là cao nhất. Cơ thể có màu nâu nhạt, đầu hơi vàng và chiếm số lƣợng đông đảo nhất trong tổ mối. Toàn bộ mối thợ trong tổ đều bị mù, mọi sự di chuyển hay làm việc của mối thợ đều đƣợc điểu khiển bởi pheromone đƣợc tiết ra bởi mối chúa tiết ra.
Hình 4.1. Mối thợ 4.1.2. Mối lính (mối bảo vệ)
Có cấu tạo gần giống nhƣ mối thợ, nhƣng phần trán kéo dài thành dạng ống nhƣ một cái dùi phần đỉnh nhọn hàm trên rất phát triển và cứng có độ kitin hóa rất cao. Có lỗ thông ra ngoài và có khả năng tiết một số chất độc. Tuy phần miệng mối lính đƣợc chuyên hóa để bảo vệ tổ mối lính lại bị mù hoàn toàn và mọi hoạt động của mối lính đều đƣợc kiểm soát bởi pheromone do mối chúa tiết ra vì vậy mối lính mất đi khả năng tự kiếm thức ăn, thức ăn chủ yếu của mối lính là do mối thợ cung cấp.
1 cm 1cm
Hình 4.2. Mối lính
4.1.3. Mối chúa
Có màu xám đậm, cơ thể thắt eo từng đốt, trọng lƣợng lớn hơn nhiều lần trọng lƣợng mối thợ, đảm nhiệm chức năng sinh sản chính trong tổ, có số lƣợng ít nhất trong tổ, 1 tổ mối chỉ có 1 hoặc 2 con mối chúa.
1cm 1cm
4.1.4. Mối non
Hình dáng nhƣ mối thợ nhƣng khác là mối non có màu trắng sữa, kích thƣớc nhỏ hơn mối thợ, mềm hơn, dễ chết khi va chạm nhẹ. Chiếm số lƣợng nhiều trong tổ mối.Mối non khi lớn lên sẽ biệt hóa thành mối lính hay mối thợ.
Hình 4.4. Mối non
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn
Từ 6 tổ mối thu ở vƣờn quốc gia U Minh Thƣợng, Kiên Giang đã phân lập và tách ròng đƣợc 30 chủng vi khuẩn (bảng 4.1). Tất cả các chủng vi khuẩn đều phát triển tốt sau 1 – 2 ngày ủ ở 32oC.
4.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Thời gian để các chủng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc là 48h trong tủ ủ vi sinh ổn định ở 320C. Đa số các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc có khuẩn lạc hình tròn, mô lài hoặc lồi, bìa nguyên, màu trắng đục và có kích thƣớc từ 0.5 đên 3cm.
Bảng 4.1. Đặc điểm khuẩn lạc của 30 chủng vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Chủng Hình dạng Bìa khuẩn lạc Độ nỗi Màu sắc
Kích thƣớc (mm) 1 1Q1 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1.5 2 1Q2 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2 3 1Q3 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2.5 1cm
4 1Q4 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2 5 1Q5 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1 6 2Q1 Tròn Nguyên lài trắng đục 1.5 7 2Q2 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2 8 2Q3 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1 9 2Q4 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 0.5
10 2Q5 Tròn răng cƣa Lồi trắng đục 2
11 3Q1 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1
12 3Q2 Bầu dục Nguyên lài trắng đục 1
13 3Q3 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 0.5 14 3Q4 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1.5 15 3Q5 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2.5 16 4Q1 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1.5 17 4Q2 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1 18 4Q3 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2 19 4Q4 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 0.5 20 4Q5 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1 21 5Q1 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2
22 5Q2 Bầu dục Nguyên Lồi trắng đục 1.2
23 5Q3 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2 24 5Q4 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2.5 25 5Q5 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 2 26 6Q1 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1 27 6Q2 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1.5 28 6Q3 Tròn Nguyên lài trắng đục 3 29 6Q4 Tròn Nguyên Lồi trắng đục 1.5 30 6Q5 Tròn Nguyên lài trắng đục 2
Về bìa khuẩn lạc: có 29 chủng vi khuẩn có bìa nguyên chiếm 96,7%, 1 chủng vi khuẩn có bìa răng cƣa chiếm 3,3%.
Về độ nổi khuẩn lạc: có 26 chủng vi khuẩn mô lồi chiếm 86,7%, 4 chủng vi khuẩn có mô lài chiếm 13,3%.
Về màu sắc khuẩn lạc: có 30 chủng vi khuẩn có màu trắng đục chiếm 100%.
Ngoài ra chủng 6Q3 còn có màng nhày bao quanh khuẩn lạc, màng nhày này là nơi dự trữ chất dinh dƣỡng, giúp cho vi khuẩn có thể sinh tồn đƣợc ngay cả khi sống trong môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng. Ngoài ra màng nhày còn giúp cho vi khuẩn có thể bám vào các giá thể (Trần Cẩm Vân, 2005).
Hình 4.5. Đặc điểm khuẩn lạc
A: Chủng 3Q2, khuẩn lạc bầu dục, trắng đục, bìa nguyên, mô lài. B: Chủng 1Q2, khuẩn lạc tròn, trắng đục, bìa nguyên, mô lồi.