Luận văn thu nhận và mô tả đặc tính của enzyme chitosanasse từ vi khuẩn bacilus licheniforrmis NN1

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------  --------- NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NHUNG THU NHẬN VÀ MÔ TẢ ðẶC TÍNH CỦA ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS NN1 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I ---------  --------- NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NHUNG THU NHẬN VÀ MÔ TẢ ðẶC TÍNH CỦA ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS NN1 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH Mã số: 60.54.10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGÔ XUÂN MẠNH HÀ NỘI - 20112 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện khoá luận này ñã ñược cảm ơn và các thông tin ñược trích dẫn trong khoá luận này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Phương Nhung Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự ñộng viên và giúp ñỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh, Trưởng khoa - Khoa công nghệ thực phẩm - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ, tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy cô trong Khoa Công nghệ thực phẩm, Khoa công nghệ sinh học, Viện ñào tạo sau ñại học trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội, ths. Nguyễn ðức Hạnh - Viện nghiên cứu rau quả ñã tạo mọi ñiều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Mặc dù ñã hết sức cố gắng, nhưng khoá luận của tôi không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế. Vì vậy tôi kính mong nhận ñược sự góp ý, chỉ bảo của thầy cô ñể giúp tôi có thể phát huy kiến thức một cách hiệu quả sau khi ra trường. Tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và tất cả bạn bè ñã ñộng viên giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn này. Hà Nội, ngày 28 tháng 09 năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Phương Nhung Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .vii DANH MỤC BẢNG .viii DANH MỤC HÌNH VÀ ðỒ THỊ .ix PHẦN MỘT: MỞ ðẦU .1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục ñích và yêu cầu .2 1.2.1. Mục ñích .2 1.2.2. Yêu cầu .2 PHẦN HAI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Khái niệm enzyme chitosanase .3 2.2. Một số ñặc tính của enzyme chitosanse .3 2.2.1. Khối lượng phân tử .3 2.2.2. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase .4 2.2.3. Tính ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase .5 2.2.4. Ảnh hưởng nhiệt ñộ và pH tới sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase 6 2.2.5. Ảnh hưởng của ion kim loại ñến hoạt tính của enzyme chitosanse 7 2.3. Ứng dụng của enzyme chitosanse và chitosan oligosaccharide 8 2.3.1. Ứng dụng của chitosanase .8 2.3.2. Ứng dụng của chitosan oligosaccharide .9 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iv 2.4. Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase 17 2.4.1. Nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme chitosanase . 17 2.4.1.1. Các nguồn vi sinh vật ñã ñược nghiên cứu trong sản xuất chitosanase 17 2.4.1.2. Vi khuẩn Baccilus lichenifomis 19 2.4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi sinh vật21 2.4.2.1. Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường 21 2.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 24 2.4.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường .25 2.4.2.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy . 26 2.4.3. Một số phương pháp sử dụng trong thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase . 27 2.5. Các nghiên cứu chitosan, COS, chitosanase ở Việt Nam 29 PHẦN BA: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1. Vật liệu 31 3.1.1. ðối tượng . 31 3.1.2. Vật liệu . 31 3.1.3. Thời gian nghiên cứu 31 3.1.4. ðịa ñiểm nghiên cứu .32 3.2. Quy trình thu nhận enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 . 32 3.3. Nội dung nghiên cứu 32 3.4. Phương pháp nghiên cứu . 33 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 33 3.4.2.Các phương pháp nuôi cấy và làm sạch enzyme 35 3.4.2.1. Giữ giống và bảo quản giống . 35 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. v 3.4.2.2. Nuôi cấy . 35 3.4.2.3. Xác ñịnh ñường cong sinh trưởng của vi khuẩn . 35 3.4.2.4. Làm sạch enzyme chitosanase . 36 3.4.2.5. Phương pháp ñiện di 37 3.4.3. Các phương pháp phân tích . 38 3.4.3.1. Xác ñịnh hoạt tính enzyme chitosanase 38 3.4.3.2. Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein . 39 3.4.4. Các phương pháp xác ñịnh tính chất của enzyme . 39 3.4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH tới hoạt tính của enzyme . 39 3.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH tới tính ổn ñịnh của enzyme .39 3.4.4.3. Ảnh hưởng của một số ion kim loại tới hoạt tính của enzyme .39 3.4.5. Phương pháp xử lý số liệu 39 PHẦN BỐN: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 40 4.1. Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis ñể sinh tổng hợp cao chitosanase . 40 4.1.1. Kết quả thực nghiệm thăm dò ñơn yếu tố .40 4.1.2. Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy tối ưu bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 41 4.1.3 Xác ñịnh ñường cong sinh trưởng của vi khuẩn . 49 4.2.Tinh sạch chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 . 50 4.2.1. Làm sạch sơ bộ bằng phương pháp tủa muối amoni sunphate . 50 4.2.2. Làm sạch bằng phương pháp sắc ký trao ñổi ion .52 4.2.3. Kết quả ñiện di sau các bước làm sạch dịch enzyme chitosanase 54 4.3. Một số tính chất của enzyme chitosanase . 55 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vi 4.3.1. Ảnh hưởng pH ñến hoạt tính của enzyme chitosanase . 55 4.3.2. Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt tính của enzyme chitosanase 56 4.3.3. Ảnh hưởng pH và nhiệt ñộ ñến ñộ bền của enzyme chitosanase . 56 4.3.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại tới hoạt tính của enzyme chitosanase 57 PHẦN NĂM: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ . 59 5.1. Kết luận . 59 5.2. ðề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 60 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên ñầy ñủ COS Chitosan oligosaccharide DA Degree of deacetylation DP Degree of polymerization DNS Acid dinitro salisilic GlcN D- Glucosamine GlcNAc N- acetyl-D- Glucosamine Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khối lượng phân tử của chitosanase từ một số nguồn vi sinh vật 3 Bảng 2.2. Phân loại enzyme chitosanase dựa vào kiểu phân cắt 4 Bảng 2.3. Tính ñặc hiệu cơ chất của chitosanase từ Bacillus sp. strain KCTC 0377BP 5 Bảng 2.4. pH và nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt ñộng của một số enzyme .7 Bảng 2.4. Một số chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chitosanase ñã ñược nghiên cứu 18 Bảng 2.5. ðiều kiện nhiệt ñộ và pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi sinh vật sinh chitosanase .26 Bảng 3.2. Ma trận kế hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai của Doehlert 34 Bảng 3.3. Thành phần bản ñiện di theo phương pháp Schägger và Von Jagow (1987) . 37 Bảng 4.1. Bố trí thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai của Doehlert 42 Bảng 4.2. Kết quả của các thực nghiệm trong ma trận thực nghiệm 43 Bảng 4.3. Hệ số của phương trình hồi quy .44 Bảng 4.4 Bảng biến mã và biến thực tương ứng của ñiều ñiện nuôi cấy tối ưu .48 Bảng 4.5. Hoạt tính của enzyme sau quá trình tủa muối và lọc muối 51 Bảng 4.6. Hoạt tính của enzyme chitosanase sau quá trình sắc ký trao ñổi ion 53 Bảng 4.7. Hoạt tính của enzyme sau quá trình sắc ký trao ñổi ion lần hai .54 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của enzyme chitosanase .55 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới hoạt tính xúc tác của enzyme . 56 . là enzyme chitosanase. Enzyme chitosanase thu nhận ñược từ vi khuẩn, nấm, một số thực vật, ñộng vật…. Nhưng chitosanase thu nhận từ vi khuẩn, xạ khuẩn và. THU NHẬN VÀ MÔ TẢ ðẶC TÍNH CỦA ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS NN1 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH