Thu nhận và xác định đặc tính của b agarase sản xuất prebiotic

NGUYỄN TRỌNG HẢI BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN TRỌNG HẢI CÔNG NGHỆ SINH HỌC THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA β - AGARASE SẢN XUẤT PREBIOTIC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2014A Hà Nội - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN TRỌNG HẢI THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA β - AGARASE SẢN XUẤT PREBIOTIC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐỖ BIÊN CƯƠNG Hà Nội - 2016 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy cô giáo, gia đình bạn bè Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS ĐỖ BIÊN CƯƠNG Phòng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình định hướng, hướng dẫn, cấp kinh phí truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm 401 C4 Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè người thân động viên, khuyến khích giúp vượt qua khó khăn suốt trình nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Nguyễn Trọng Hải Nguyễn Trọng Hải i Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu hướng dẫn khoa học TS Đỗ Biên Cương Các kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, số liệu, tính toán hoàn toàn xác chưa công bố công trình nghiên cứu (ngoại trừ báo thầy hướng dẫn có nội dung liên quan đến luận văn) Mọi liệu, hình ảnh, biểu đồ trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Nguyễn Trọng Hải Nguyễn Trọng Hải ii Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Agar 1.1.1 Cấu tạo 1.1.2 Nguồn agar 1.1.3 Tính chất hóa lý 1.2 Agarase 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Cấu tạo agarase 1.2.3 Cơ chế tác dụng 1.2.4 Tính chất 1.2.5 Nguồn thu nhận agarase 1.2.6 Tinh đánh giá tính chất β - agarase 11 1.2.7 Ứng dụng 12 1.3 Agaro - oligosaccharide (AOS) 14 1.3.1 Cấu tạo 14 1.3.2 Tính chất 15 Nguyễn Trọng Hải iii Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 1.3.3 Hoạt tính sinh học 16 1.3.4 Phương pháp sản xuất agaro - oligosaccharide 17 1.3.5 Ứng dụng agaro - oligosaccharide 20 1.4 Tình hình nghiên cứu agarase AOS Việt nam 21 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị máy móc 22 2.1.1 Chủng vi sinh vật 22 2.1.2 Môi trường 22 2.1.3 Hóa chất 23 2.1.4 Các loại dung dịch đệm 23 2.1.5 Máy móc thiết bị 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 25 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 27 2.2.3 Định tên vi sinh vật sinh học phân tử 33 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 37 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp agarase 38 3.1.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp agarase 38 3.1.2 Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt độ agarase cao 39 3.2 Định tên chủng 43 3.2.1 Định tên phương pháp sinh học phân tử 43 3.2.2 Định tên đặc điểm hình thái 45 Nguyễn Trọng Hải iv Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp agarase từ chủng Penicillium sp HL28 47 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 48 3.3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 49 3.3.3 Ảnh hưởng NaCl 50 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 51 3.3.5 Ảnh hưởng pH môi trường 52 3.3.6 Động thái sinh trưởng chủng Penicillium sp HL28 53 3.4 Làm agarase chủng Penicillium sp HL28 55 3.4.1 Khảo sát nồng độ ammonium sulfate kết tủa agarase 55 3.4.2 Làm enzyme agarase 55 3.5 Đặc tính enzyme agarase tinh thu nhận từ Penicillium sp HL28 57 3.5.1 Tính đặc hiệu chất 57 3.5.2 Nhiệt độ tối ưu 58 3.5.3 pH tối ưu 58 3.5.4 Ảnh hưởng ion kim loại 59 3.5.5 Xác định thông số động học phản ứng 60 3.6 Thăm dò khả chuyển hóa agarose tạo AOS 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 74 Nguyễn Trọng Hải v Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng việt Tiếng Anh BLAST Basic local alignment search tool bp Base pair BSA Bovine serum albumin CMC Carboxymethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2’-Deoxynucleoside 5’- triphosphate Cặp bazơ nitơ cs CYA Cộng Môi trường CYA Czapek Yeast Agar DTP Dịch thủy phân ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EGTA Ethylene glycol tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide FDA Food and drug administration Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa kỳ FAO Food and agriculture organization Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc GALT Gut-associated lymphoid tissue LBG Locust Bean Gum M Marker Nguyễn Trọng Hải vi Viêm mô bạch huyết Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học MRS Man Rogosa Sharpe Môi trường MRS MEA Malt Extract Agar Môi trường MEA NB Nutrient Broth Môi trường NB kb Kilo base kDa Kilo Dalton OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi tổng hợp RNA Ribonucleic acid rpm Revolutions per minute SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate Điện di gel polyacrylamide gel electrophoresis polyacrylamide có SDS Taq Thermus aquaticus TBE Tris-boric-acid EDTA TE Tris - EDTA TEMED N,N,N’,N’- Số vòng/phút Tetramethylethylenediamine TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng v/v Volume/volume Thể tích/thể tích v/v/v Volume/volume/volume Thể tích/thể tích/thể tích WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích Nguyễn Trọng Hải vii Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các hóa chất 23 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch 23 Bảng 2.3 Máy móc, thiết bị 24 Bảng 3.1 Số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nghiên cứu 38 Bảng 3.2 Giá trị D/d chủng nấm mốc phân lập 40 Bảng 3.3 Hoạt độ agarase chủng nấm thử nghiệm 41 Bảng 3.4 Đặc điểm sinh lý chủng HL28 46 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ ammonium sulfate bão hòa đến hiệu suất thu nhận agarase 55 Bảng 3.6 Thông số kỹ thuật bước tinh agarase từ chủng Penicillium sp HL28 57 Bảng 3.7 Đặc hiệu chất agarase từ Penicillium sp HL28 57 Bảng 3.8 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt độ agarase từ Penicillium sp HL28 60 Nguyễn Trọng Hải viii Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học C D Hình 3.19 Phổ khối LC-MS mẫu thủy phân A: Chuẩn galactose, B: giờ; C: giờ; D: 24 Nguyễn Trọng Hải 64 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Quá trình nghiên cứu rút số kết luận sau: 64 chủng vi sinh vật (trong có 26 nấm mốc) sinh agarase phân lập Kết hợp sàng lọc theo hoạt tính thủy phân agar, agarose khả tạo prebiotic chọn chủng HL28 sinh tổng hợp agarase cho mục tiêu tạo AOS Trên sở trình tự ITS đặc điểm hình thái, chủng HL28 xác định Penicillium oxalicum HL28 Quá trình nghiên cứu chọn điều kiện thích hợp nuôi cấy chủng Penicillium sp HL28 sinh agarase: môi trường ASW2 có agar 0,2%, cao nấm men 0,05%, NaCl 4%, MgSO4.7H2O 2,522%, KCl 0,074%, CaCl2.2H2O 0,014%, nhiệt độ 37°C, pH 5,5, tỷ lệ cấp giống 3%, thời gian nuôi cấy ngày, lắc 150 vòng/phút Hoạt độ agarase đạt 140,38 U/L Agarase sinh tổng hợp từ chủng Penicillium sp HL28, làm qua lọc màng Cut - off 10 kDa, tủa muối ammonium sulfate 60 - 70%, lọc gel Sephadex G-50 Hoạt độ riêng thu 0,415 U/mg, số lần 11,4 lần, hiệu suất thu hồi đạt 2,06% Đã xác định số đặc tính enzyme tinh sạch: Khối lượng phân tử khoảng 44 kDa, endoagarase, phân cắt tốt liên kết β-glycoside chất CMC, guar gum, agarose Hoạt động tối ưu 50oC pH 7, bị kìm hãm EDTA ion Mg2+, Cu2+, EDTA, Fe2+ (1 mM), hoạt hóa ion Zn2+, Na+, K+, Mn2+, Ba2+, Ca2+ (1 mM) Giá trị động học enzyme tinh với chất agarose Km: 2,23 mg/ml; Vmax: 1,1 U/mg Agarase từ Penicillium sp HL28 thủy phân agarose tạo prebiotic KIẾN NGHỊ Xác định cấu tạo β - agarase từ chủng Penicillium sp HL28 Tạo chủng đột biến tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp agarase cao Tinh sạch, xác định cấu trúc agarase hoạt tính prebiotic sản phẩm oligosaccharide tạo thành từ agarose xúc tác agarase Nguyễn Trọng Hải 65 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Chu Văn Mẫn (2001), Ứng dụng tin học sinh học,Hà Nội, Nxb Đại học Quốc gia Nguyễn Lân Dũng et al (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật Tập 3, Hà Nội, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Phạm Thị Trân Châu Phan Tuấn Nghĩa (2006), Công nghệ sinh học tập - Enzyme ứng dụng, Hà Nội, Nxb Giáo dục Tiếng Anh Araki C.H (1937), Acetylation of agar like substance of Gelidium amansii, J Chem Soci, 58, pp 1338 - 1350 Armisén R (1995), Worldwide use and importance of Gracilaria, J Appl Phycol, 7, pp 231-243 Armisen R., Galatas F (1987), Production, properties and uses of agar In production and utilization of products from commercial seaweeds, FAO Fisheries Technical Paper, Food and Agriculture Organization of the United NationsRome, Italy, pp 1-57 Armisén R., Galatas F., Hispanagar S.A (2000), Agar In Handbook of Hydrocolloids, Phillips G.O., Williams P.A., & Eds.Cambridge, UK, Woodhead Publishing Ltd, pp 21–40 Bartosz K., Chorng L.P (2008), Separation and quantification of neoagaro- and agaro-oligosaccharide products generated from agarose digestion by β-agarase and HCl in liquid chromatography systems, Carbohyd Res, 343, pp 2443–2450 Chan H.L., Hee T.K., Eun J.Y., Kim J.H., Choi I.G., Kim K.H (2014), A novel agarolytic β-galactosidase acts on agarooligosaccharides for complete hydrolysis of agarose into monomers, Appl Environ Microb, 80, pp 5965-5973 10 Chulhong O., Chamilani N., Youngdeuk L., Ilson W., Kim S.J., Kang D.H., Jehee L (2010), Cloning, purification and biochemical characterization of beta - Nguyễn Trọng Hải 66 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học agarase from the marine bacterium Pseudoalteromonas sp AG4, J Ind Microbiol Biotechnol, 37, pp 483 - 494 11 Da Y.P., Chi W.J., Park J.S., Chan Y.K., Hong S.K (2015), Cloning, expression and biochemical characterization of a GH16 β-Agarase AgaH71 from Pseudoalteromonas hodoensis H7, Appl Biochem Biotechno, 175, pp 733–747 12 David B W., Vuong V.T (2010), Review: Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile diversity, Biotechnol Bioeng, 107(2), pp 195-205 13 De V.M., Scherezenmeir J (2008), Probiotics, prebiotics, and synbiotics, Adv Biochem Eng Biotechnol, 111, pp 1-66 14 Dewapriya P., Kim S (2014), Marine microorganisms: An emerging avenue in modern nutraceuticals and functional foods, Food Res Int, 56, pp 115-125 15 Dong J., Hashikawa S., Konishi T., Araki T (2006), Cloning of the novel gene encoding β-agarase C from a marine bacterium, Vibrio sp strain PO-303, and characterization of the gene product, Appl Environ Microb, 72(9), pp 6399–6401 16 Eikolaeva N.V., Usov A.I., Sinitsyn A.P., Tambiev A.H (1999), Degradation of agarophytic red algal cell wall components by new crude enzyme preparations, J Appl Phycol, 11, pp 385 - 389 17 Emiko T., Yuji H., Masatake A., Yukari O., Gaku Y., Takatsugu M., Atsushi N., Takashi T (2015), Crystal structure of the catalytic domain of a GH16 β-agarase from a deep-sea bacterium, Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94, Biosci Biotech Bioch, 79(4), pp 625-632 18 Fangyuan C., Sujie D., Xiaochong S., Zhang S.H (2014), Overexpression and characterization of a novel thermostable β - agarase YM01 - 3, from marine bacterium Catenovulum agarivorans YM01 T, Mar Drugs, 12, pp 2731 - 2747 19 Fu X.T., Lin H (2008), Purification anh characterization of a novel β -agarase, AgaA34, from Agarivorans albus YKW-34., Appl Microbiol Biot, 78, pp 265-273 Nguyễn Trọng Hải 67 Luận văn thạc sỹ khoa học 20 Công nghệ sinh học Fu X.T., Pan C.H., Hong L., Kim S.M (2009), Gene cloning, expression, and characterization of a β-agarase, agaB34, from Agarivorans albus YKW-34, J Microbiol Biotech, 19(3), pp 257–264 21 Gullón P., Gullón B., Moure A., Domínguez H., Parajó J.C (2009), Manufacture of prebiotics from biomass sources In: Prebiotics and probiotics science and technology, Springer Science and Business Media, pp 535- 564 22 Hai M.C., Li Z., Yan X.J (2005), The preparation and bioactivity research of agaro-oligosaccharides, Food Technol Biotechnol, 43(1), pp 29-36 23 Hamer G.K., Bhattacharjee S S (1977), Analysis of the enzymic hydrolysis products of agarose by 13C-NMR spectroscopy, Carbohyd Res, 54, pp 7-10 24 Hiroaki M., Yasuhiro S., Akinobu E., Yukari O., Yuji H., Masahiro K., Tadashi M., Ron U (2013), Thermophilic and halophilic b-agarase from a halophilic archaeon Halococcus sp 197A, Extremophiles, 17, pp 931–939 25 Hu Z., Lin B.K., Xu Y., Zhong M.Q., Liu G.M (2009), Production and purification of agarase from a marine agarolytic bacterium Agarivorans sp HZ105, J Appl Microbiol, 106, pp 181–190 26 Hu Z., Lin B.K., Xu Y., Zhong M.Q., Liu G.M (2008), Production and purification of agarase from a marine agarolytic bacterium Agarivorans sp HZ105., J Appl Microbiol, 106, pp 181-190 27 Huebner J., Wehling R.L., Hutkins R.W (2007), Functional activity of commercial prebiotics, Int Dairy J, 17, pp 770-777 28 Ji M.H (1997), Agar, Seaweed Chemistry, pp - 26 29 Jianfeng M., Zhongxiu T., Yu Y., Hong W., Qi W., Guoqing Y (2014), Purification and characterization of β-agarase from Paenibacillus sp., Food Sci Biotech, 23(5), pp 1605-1609 32 Jing J., Wang L.C., Hao W., Luan H.M (2011), Bio-function summary of marine oligosaccharides, Int J Biol, 3(1), pp 451-459 Nguyễn Trọng Hải 68 Luận văn thạc sỹ khoa học 31 Công nghệ sinh học Jingbao L., Feng H., Xinzhi L., Xiaoyan F., Cuiping M., Yan Ch., Wengong Y (2007), A simple method of preparing diverse neoagaro-oligosaccharides with βagarase, Carbohyd Res, 342, pp 1030-1033 32 Kim J., Hong S.K (2012), Isolation and characterization of an agarase - producing bacterial strain, Alteromonas sp GNUM - 1, from the West sea, Korea, J Microbiol Biotech, 22(12), pp 1621 - 1628 33 Jonnadula R., Ghadi S.C (2011), Purification and characterization of β- agarase from seaweed decomposing bacterium Microbulbifer sp strain CMC-5, Biotech Biopro, 16, pp 513-519 34 Julie A., Murielle J., William H., Tristan B., Bernard K., Bernard H., Mirjam C (2003), The three-dimensional structures of two β-agarases, The J Biol Chem, 278, pp 47171–47180 35 Kang N.Y., Choi Y.L., Cho Y.S., Kim B.K., Jeon B.S., Kim C.H., Lee Y.C (2003), Cloning, expression and characterization of a beta-agarase gene from a marine bacterium, Pseudomonas sp SK38, Biotechnol Lett, 25, pp 1165-1170 36 Kang O L., Yong P F., Ma’aruf A G., Osman H., Nazaruddin R (2014), Physicochemical and antioxidant studies on oven-dried, freeze-dried and spray-dried agaro-oligosaccharide powders, Int Food Res J, 21(6), pp 2363-2367 37 Kim D.K., Jang Y.R., Kim K.H., Lee M.N., Kim A.R., Jo E.J., Byun T.H., Jeong E.T., Kwon H.J., Kim B.W., Lee E.W (2011), Isolation and culture properties of a thermophilic agarase-producing strain, Microbulbifer sp SD - 1, Can J Fish Aquat Sci, 14(3), pp 246-253 38 Kim H., Lee S., Lee D., Kim H.S., Bang W.G., Kim K., Choi I.G (2010), Overexpression and molecular characterization of Agar50D from Saccharophagus degrandans 2-40: An exo-type β-agarase producing neoagarobiose, Appl Microbiol Biotech, 86, pp 227-234 39 Kim S., Ravichandran Y.D (2008), Prospective of the cosmeceuticals derived from marine organisms, Biotechnol Biopro Eng, 13, pp 511-523 Nguyễn Trọng Hải 69 Luận văn thạc sỹ khoa học 40 Công nghệ sinh học Kurtzman C.P., Robnett C.J (1997), Identification of clinically important ascomycetous yeast based on nucleotide divergence in the 5’ end of the large - subunit (26S) ribosomal DNA gene, J Clinical Microbiol, 35, pp 1216-1223 41 Laemmli U.K (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of Bacteriophage T4, Nature, 227(5259), pp 680 - 685 42 Lakshmikanth M., Manohar S., Lathitha J (2009), Purification and characterization of β -agarase from agar-liquefying soi bacterium Acinetobacter sp., AG LSL-1, Process Biochem, 44, pp 999-1003 43 Li L., Xu X.W., Jiang X.W., Yi C., Na Y., Huo Y.Y., Wu Y.H., Zhu X.F., Zhang X.Q., Min W (2011), Cloning, expression and characterization of a new βAgarase from Vibrio sp strain CN4Ͳ, Appl Environ Microbiol, 77, pp 7077–7079 44 Long M.X., Yu Z.N., Xu X.A (2009), Novel β-Agarase with high pH stability from marine Agarivorans sp LQ48, Marin Biotech, 34, pp 379-184 45 Lowry O.H., Rosebrough N.H., Farr A.L., Randall R (1951), Protein measurement with the Folin phenol reagent, The J Biol Chem, 193, pp 265 - 275 46 Ma C., Lu X., Shi C., Li J., Gu Y., Ma Y., Chu Y., Han F., Gong Q., Yu W (2007), Molecular cloning and characterization of a novel beta-agarase, AgaB, from marine Pseudoalteromonas sp CY24, J Biol Chem, 282, pp 3747–3754 47 Miller G.L (1959), Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal Chem, 31, pp 426 - 428 48 Kyung M., Lee D.G., Kim N.Y., Yu D., Jang H.J., Lee S.H., Jang H.J., Lee Y.J., Lee S.H (2009), Purification and characterization of neoagarotetraose from hydrolyzed agar, J Microbiol Biotech, 19(10), pp 1197–1200 49 Nan L., Xiangzhao M., Zongjun D., Bozhong M., Dongzhi W (2014), Cloning and characterisation of a novel neoagarotetraose-forming-β-agarase, AgWH50A from Agarivorans gilvus WH0801, Carbohyd Res, 388, pp 147–151 Nguyễn Trọng Hải 70 Luận văn thạc sỹ khoa học 50 Công nghệ sinh học Ohta Y., Hatada Y., Miyazaki M., Nogi Y., Ito S., Horikoshi K (2005), Purification and characterization of a novel α-agarase from a Thalassomonas sp., Curr Microbiol, 50, pp 212-216 51 Ohta Y., Hatada Y., Nogi Y., Li Z., Ito S., Horikoshi K (2004), Cloning, expression, and characterization of a glycoside hydrolase family 86 β-agarase from a deep-sea Microbulbifer-like isolate, Appli Microbiol Biotech, 66, pp 266-275 52 Okuda T., Klich M.A., Seifert K.A., Ando K (2000), Media and incubation effects on morphological characteristics of Penicillium and Aspergillus Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification, ed Pitt J.I., In: Samson R.A., Amsterdam, Harwood Academic Publishers 53 Oon L.K., Maaruf G., Osman H., Shahrooz R., Nazaruddin R (2014), Novel agaro-oligosaccharide production through enzymatic hydrolysis: Physicochemical properties and antioxidant activities, Food Hydrocolloid, pp 1-5 54 Pang H.H., Wei C.H., Lu W.J., Fen S., Pan C.L., Victor L.H.T (2015), Extracellular production of a novel endo-β-Agarase AgaA from Pseudomonas vesicularis MA103 that cleaves agarose into neoagarotetraose and neoagarohexaose, Int J of Mol Scien, 16, pp 5590-5603 55 Pitt J.I., Hocking A.D (1997), Fungi and Food Spoilage, Aspen Publishers Inc, Maryland 56 Takara Agarose Gel DNA Purification Kit product protocol 57 Ravichand J., Sanjeev C.G (2011), Purification and characterization of β- agarase from seaweed decoposing bacterium Microbulbfer sp strain CMC-5, Biotechnol Biopro Eng, 16, pp 513-519 58 Rhee Y.J., Han C.R., Kim W.C., Jun D.Y., Rhee I.K (2010), Isolation of a novel freshwater agarolytic Cellvibrio sp KY-YJ-3 and characterization of its extracellular β-agarase, J Microbiol Biotech, 20, pp 1378-1385 Nguyễn Trọng Hải 71 Luận văn thạc sỹ khoa học 59 Công nghệ sinh học Suzuki H., Sawaim Y., Suzuki T., Kawai K (2003), Purification and characterization of an extraccellular β -agarase from Bacillus sp MK03, J Biosci Bioeng, 93, pp 456-463 60 Tatsuji E., Shinji O., Yoko K., Fuyuko T., Hiroaki S., Kato I (2010), Oligosaccharides from agar inhibit pro-inflammatory mediator release by inducing heme oxygenase 1, Biosci Biotechnol Biochem, 74(4), pp 766-770 61 Tatsuji E., Takanari T., Fuyuko T., Hiromu O., Hiroaki S., Ikunoshin K (2012), Anti-tumor-promoting activities of agaro-oligosaccharides on two-stage mouse skin carcinogenesis, Biol Pharm Bull, 35(7), pp 1145–1149 62 Thomas N.V., Kim S (2013), Beneficial effects of marine algal compounds in cosmeceuticals, Marin Drugs, 11, pp 146-164 63 Tiwari K.L., Jadhav S.K., Kumar A (2011), Morphological and molecular study of different Penicillium species, Middle East J Scient Rev, 7(2), pp 203-210 64 Uyangaa T., Chi W.J., Chang Y.K., Hong S.K (2011), Identification and biochemical characterization of Sco3487 from Streptomyces coelicolor A3 (2), an Exo- and Endo-type β-agarase-producing neoagarobiose, J Bacteriol, pp 142 - 149 65 Wang J.X., Mou H.J., Jiang X.L., Guan H.S (2006), Characterization of a novel β-agarase from marine Alteromonas sp SY37–12 and its degrading products, Appl Microbiol Biot, 71, pp 833–839 66 Wang L., Liu L., Wang Y.M., Yuan Q.Y., Li Fan., Xu Z.H (2001), Comparative research on the structures and physical-chemical properties of agars from several agarophyta, Ocean Etlimno Sinica, 36, pp 658-664 67 Wei Z., Li Sun (2007), Cloning characterization and molecular application of a beta-agarase gene from Vibrio sp strain V134, Appl Environ Microbiol, 73(9), pp 2825–2831 68 Xiao T.F., Kim S.M (2010), Agarase: Review of major sources, categories, purification method, enzyme characteristics and applications, Marin Drugs, 8, pp 200-218 Nguyễn Trọng Hải 72 Luận văn thạc sỹ khoa học 69 Công nghệ sinh học Xiaochong S., Min Y., Shulin Y., Sujie D., Zhang X.H (2012), Genome sequence of the thermostable-agarase-producing marine bacterium Catenovulum agarivorans YM01T, which reveals the presence of a series of agarase-encoding genes, J Bacteriol, 194, pp 5484 70 Yukari O., Yuichi N., Masayuki M., Li Z., Yuji H., Koki H (2004), Enzymatic properties and nucleotide and amino acid sequences of a thermostable β-agarase from the novel marine isolate, JAMB-A94, Biosci Biotech Bioch, 68(5), pp 1073–1081 71 Zhang Z., Jiang X (2003), Bioactivities of oligosaccharides and the potential application of marine oligosaccharides, Chinese J Mari Drugs, 22(3), pp 51-56 Trang Web: 72 http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html 73 http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=3380 74 http://www.cbs.know.nl/database/index.htm 75.http://hoachat-visinh.blogspot.com/2013/08/moi-truong-vi-sinh-mrs-agar-deman.html 76 http://documents.tips/documents/moi-truong-na-nb-copy.html 77 https://vi.wikipedia.org/wiki/Nước_biển Nguyễn Trọng Hải 73 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học PHỤ LỤC Bảng PL3.1 Đặc điểm chủng vi sinh vật phân lập STT Nguồn Ký hiệu phân lập chủng Hạ Long Loại Đặc điểm hình thái khuẩn lạc HL5A Vi khuẩn Tròn, màu xanh nhạt, bề mặt bóng HL5B Vi khuẩn Màu hồng nhạt, bề mặt bóng HL1 Vi khuẩn Trắng sữa, bề mặt nhăn HL2 Vi khuẩn Trắng sữa, bề mặt nhăn lồi HL31 Vi khuẩn Hơi vàng, bề mặt nhẵn HL41A Nấm mốc Trắng xanh, bề mặt nhẵn bóng HL53B Vi khuẩn Trắng hồng, bề mặt nhẵn bóng, viền cưa HL29B Vi khuẩn Trắng đục, bề mặt nhẵn HL55B Vi khuẩn Trắng, nhẵn bóng 10 HL4 Vi khuẩn Trắng ngà, bề mặt nhẵn, viền cưa 11 HL39B Vi khuẩn Hơi vàng, bề mặt nhẵn 12 HL37 Vi khuẩn Trắng hồng, bề mặt nhăn 13 HL47 Nấm mốc Trắng vàng 14 HL51 Nấm mốc Hồng nhạt, bề mặt bóng 15 HL49 Nấm mốc Trắng đục, bề mặt nhẵn 16 HL50 Nấm mốc Trắng bóng xanh, bề mặt nhẵn 17 HL45 Nấm mốc Trắng đục, bề mặt nhăn, lồi 18 HL48 Nấm mốc Hơi vàng, bề mặt nhẵn 19 HL3 Vi khuẩn Trắng, bề mặt phẳng không bóng 20 HL17 Vi khuẩn Trắng trong, bề mặt lồi, nhăn xù xì 21 HL39 Vi khuẩn Hơi vàng, bề mặt nhẵn Nguyễn Trọng Hải 74 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 22 HL36 Vi khuẩn Trắng đục, bề mặt nhẵn 23 HL17B Vi khuẩn Trắng đục, bề mặt nhẵn lồi 24 HL55 Vi khuẩn Hơi vàng, bề mặt nhẵn 25 HL18 Vi khuẩn Hơi vàng, bề mặt nhẵn 26 HL32B Vi khuẩn Trắng trong, bề mặt nhẵn lồi 27 HL8 Nấm mốc Trắng, sợi mảnh 28 HL13 Vi khuẩn Trắng ngà, bề mặt trắng bóng, viền nhăn 29 HL43B Vi khuẩn 30 HL56 Nấm mốc Màu xanh đen 31 HL13B Vi khuẩn Hơi vàng, bề mặt nhẵn 32 HL13B1 Vi khuẩn Trắng phớt hồng, bề mặt bóng 33 HL54 Nấm mốc Màu nâu, đen 34 HL59 Nấm mốc Màu trắng xanh 35 HL17A Vi khuẩn 36 HL46 Nấm mốc Màu xám xanh 37 HL58 Nấm mốc Mùa trắng xanh nhạt 38 HL52 Nấm mốc Trắng vàng 39 HL28 Nấm mốc Màu xanh rêu 40 HL34 Nấm mốc Trắng vàng 41 HL35 Nấm mốc Màu xanh mốc 42 HL53 Nấm mốc Trắng, sợi mảnh 43 HL44 Nấm mốc Màu xám đậm 44 HL32 Vi khuẩn 45 HL42 Nấm mốc Màu xanh xám Nguyễn Trọng Hải Trắng trong, bề mặt nhẵn lồi bóng Tròn, màu xanh nhạt, bề mặt bóng Hơi vàng, bề mặt nhẵn 75 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 46 HL32A Vi khuẩn Trắng sữa, bề mặt lồi 47 HL1B Vi khuẩn Trắng ngà, bề mặt nhẵn bóng 48 HL2B Vi khuẩn Trắng đục, bề mặt nhẵn lồi, viền nhăn 49 HL41 Vi khuẩn Trắng sữa, bề mặt nhăn lồi 50 HL43 Nấm mốc Trắng xanh 51 HL13A Vi khuẩn Tròn, màu xanh nhạt, bề mặt bóng 52 HL5 Vi khuẩn Trắng trong, bề mặt nhẵn bóng 53 HL56A Nấm mốc Trắng, sợi mảnh SS1A Vi khuẩn Trắng sữa, bề mặt nhăn lồi 55 SS2A Vi khuẩn Trắng sữa, bề mặt lồi 56 SS3A Vi khuẩn Trắng đục, bề mặt nhẵn 57 SS7 Vi khuẩn Trắng phớt hồng, bề mặt bóng 58 SS3 Nấm mốc Sợi màu nâu trắng, kích thước bé 59 SS2 Nấm mốc Mùa vàng xanh 60 SS4A Vi khuẩn Tròn, màu xanh nhạt, bề mặt bóng 61 SS6 Vi khuẩn Trắng đục, bề mặt nhẵn 62 SS5 Vi khuẩn Trắng đục, bề mặt nhẵn 63 SS4 Nấm mốc Màu xám 64 SS1 Nấm mốc Màu nâu nhạt 54 Sầm Sơn Nguyễn Trọng Hải 76 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Bảng PL3.2 Điểm hoạt tính prebiotic dịch thủy phân từ chủng nấm Chủng nấm HL-28 Vi khuẩn Glucose DTP HL-43 Glucose DTP HL-46 Glucose DTP HL-59 Glucose DTP Số lượng khuẩn lạc Ban đầu Sau 24 h (*104) (*105) L9 369 290 E coli 4100 2900 L9 354 428 E coli 4200 2510 L9 316 277 E coli 2000 3870 L9 306 307 E coli 1800 3560 L9 336 257 E coli 1600 2860 L9 368 328 E coli 1700 2740 L9 420 289 E coli 6600 3420 L9 460 267 E coli 7300 3640 PASL9 PASE.coli 1,2089 0,9139 77 0,295 1,06218 1,00738 0,055 1,07518 0.96411 0,111 0,91178 0,97662 -0,065 Hình PL3.1 Hình ảnh chủng Penicillium sp HL28 Nguyễn Trọng Hải PAS Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hình PL 3.2 Sự phát triển chủng Lactobacillus acidophillus L9 môi trường chứa dịch thủy phân Hình PL 3.3 Sự phát triển chủng Escherichia coli O157: H7 môi trường chứa dịch thủy phân Nguyễn Trọng Hải 78 .. .B GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC B CH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN TRỌNG HẢI THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA β - AGARASE SẢN XUẤT PREBIOTIC CHUYÊN NGÀNH... loại β - agarase Các enzyme xác định tính chất lý hóa [69] β - agarase YM0 1-3 từ vi khuẩn biển Catenovulum agarivorans YM01T nhân dòng, biểu xác định đặc tính chịu nhiệt Gen YM0 1-3 biểu tế b o... hợp agarase cao cho chủng lựa chọn - Tinh agarase - Xác định tính chất agarase - B ớc đầu thăm dò khả ứng dụng agarase thủy phân agarose tạo prebiotic agaro - oligosaccharide (AOS) Nguyễn Trọng