Thu nhận và khảo sát đặc tính của một số enzyme hydrolase ứng dụng trong dược phẩm

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ tận tình, chu đáo với tinh thần trách nhiệm của các Thầy Cô, Cha Mẹ, bạn bè cũng như các đồng nghiệp. Tác giả xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình tới: PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu – Cô đã hướng dẫn tôi lựa chọn đề tài, động viên và truyền đạt những ý kiến, những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học. TS. Lê Phi Nga – Trưởng bộ môn Sinh hóa – Khoa Sinh học, Cô đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tại bộ môn và phòng thí nghiệm tại cơ sở Linh Trung, Thủ Đức. Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Sinh hóa - Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM đã truyền đạt cho tôi các kiến thức chuyên ngành, giúp tôi thêm hiểu biết, yêu quý và trân trọng ngành học mà mình đã lựa chọn. Th.S Trần Quốc Tuấn, Th.S Vòng Bính Long, các bạn học viên cao học K17 và các em sinh viên đã hỗ trợ nhiệt tình trong quá trình làm thí nghiệm ở bộ môn. Cha mẹ, các anh chị em, bạn bè và các đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Kính gởi đến Quý Thầy Cô, các đồng nghiệp, bạn bè lời chúc sức khỏe và thành công trong lĩnh vực công tác của mình. Trân trọng! Tác giả Nguyễn Ngọc Sương Mai MỞ ĐẦU Enzyme đã được ứng dụng từ rất lâu trong nhiều ngành nghề truyền thống như: làm bánh mì, bánh kẹo, chế biến thức uống như rượu, bia, nước ép trái cây, dầu ăn, phômai, mỹ phẩm, các ứng dụng khác trong ngành công nghiệp giấy, dệt may Trong những thập niên gần đây, enzyme còn được sử dụng hiệu quả trong lĩnh vực y dược để điều trị bệnh và điều chế dược phẩm. Ở Việt Nam, trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích chế tạo thuốc điều trị bệnh cũng đã được tiến hành. Tuy nhiên, việc thu nhận và sử dụng enzyme làm nguồn nguyên liệu trong sản xuất một số dược phẩm vẫn còn khá hạn chế; mặc dù sự phát triển mạnh mẽ của nhiều ngành công nghiệp đã và đang tạo nên một lượng lớn các phế phụ liệu, đây chính là nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc sản xuất các enzyme có giá trị. Theo thông tin từ Hội nghị trực tuyến ngành Dược toàn quốc ngày 23/6/2009, 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước phải nhập khẩu từ nước ngoài trong khi thuốc sản xuất trong nước chủ yếu là các thuốc điều trị thông thường, bào chế ở dạng đơn giản và hiệu quả kinh tế chưa cao. Như vậy, việc nhanh chóng tìm được nguồn nguyên liệu ổn định với giá cả hợp lý đang trở thành vấn đề thách thức đối với ngành Dược phẩm Việt Nam nói chung. Hơn thế nữa, việc tận dụng được các phế phụ phẩm của một số ngành công nghiệp chế biến để sản xuất enzyme ứng dụng trong dược phẩm sẽ mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và xã hội cho nước ta trong giai đoạn hiện nay. Xuất phát từ một số thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Thu nhận và khảo sát đặc tích của một số enzyme hydrolase ứng dụng trong dược phẩm” với mục tiêu: - Thu nhận một số enzyme hydrolase có ứng dụng trong Dược phẩm, - Khảo sát đặc tính enzyme của các chế phẩm thu nhận và so sánh với các enzyme có trong thành phần của một số Dược phẩm đang lưu hành trên thị trường. Trên cơ sở các kết quả đạt được và so sánh với tiêu chuẩn quy định của Dược điển Việt Nam, đề tài có thể làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về một số nguyên liệu (enzyme) phục vụ cho lĩnh vực dược phẩm tại Việt Nam. Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi chỉ đi sâu hướng thu nhận và khảo sát đặc tính của các enzyme sau: pancreatin, pepsin và papain. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1: Tỷ lệ hấp thu một số enzyme trong cơ thể 9 Bảng 1.2: Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý 11 Bảng 1.3: Thành phần dinh dưỡng của trái đu đủ chín 13 Bảng 1.4: Thành phần amino acid của papain 16 Bảng 1.5: Thành phần amino acid của pepsin 22 Bảng 1.6: Lượng enzyme của tuyến tụy 29 Bảng 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ albumin và giá trị ∆OD 750nm 62 Bảng 3.2: Hàm lượng protein trong chế phẩm papain thu nhận và Dược phẩm 63 Bảng 3.3: Mối tương quan giữa nồng độ tyrosin và giá trị ∆OD 660nm . 63 Bảng 3.4: Hoạt độ enzyme papain của chế phẩm thu nhận và Dược phẩm 64 Bảng 3.5: Hoạt độ riêng của enzyme papain từ chế phẩm và Dược phẩm 66 Bảng 3.6: Hoạt độ của chế phẩm papain ở nhiệt độ 30 – 40 o C 67 Bảng 3.7: Hoạt độ của chế phẩm papain ở các giá trị pH khảo sát 68 Bảng 3.8: Hiệu suất thu nhận chế phẩm pepsin từ dạ dày heo 69 Bảng 3.9: Hàm lượng protein hòa tan trong CP enzyme thu nhận và trong Dược phẩm 70 Bảng 3.10 : Hoạt độ của chế phẩm pepsin thu nhận và pepsin Dược phẩm 71 Bảng 3.11 : Hoạt độ riêng của chế phẩm pepsin thu nhận và Dược phẩm 72 Bảng 3.12: Hoạt độ của chế phẩm pepsin ở nhiệt độ 30 – 40 o C 73 Bảng 3.13: Hoạt độ của chế phẩm pepsin ở pH 1,5 – 4,0 74 Bảng 3.14: Hiệu suất thu nhận chế phẩm pancreatin từ tụy heo 75 Bảng 3.15: Mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị ∆OD 560nm 77 Bảng 3.16: Hàm lượng protein hòa tan của CP pancreatin thu nhận và các Dược phẩm 78 Bảng 3.17: Hoạt độ trung bình các enzyme của chế phẩm pancreatin thu nhận và Dược phẩm 79 Bảng 3.18: Hoạt độ riêng của chế phẩm pancreatin thu nhận và Dược phẩm 80 Bảng 3.19: Hoạt độ của các enzyme các enzyme của CP pancreatin ở pH 7,0 – 8,5…81 Bảng 3.20: Hoạt độ các enzyme của CP pancreatin ở nhiệt độ 30 – 40 o C 81 Bảng 3.21: Khả năng tiêu đạm của các chế phẩm protease 83 Bảng 3.22: Hàm lượng Nitơ tổng số (g/100g) của các nguyên liệu dùng thủy phân 84 Bảng 3.23 : Lượng N F (g/100g) tạo thành và hiệu suất quá trình thủy phân bởi papain 85 Bảng 3.24: Lượng N F (g/100g) tạo thành và hiệu suất quá trình thủy phân bởi pepsin 87 Bảng 3.25: Lượng N F (g/100g) tạo thành và hiệu suất quá trình thủy phân bởi pancreatin 88 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Vườn đu đủ sai trái ở Bắc Giang 12 Hình 1.2: Giải phẫu tuyến tụy 28 Hình 1.3: Cấu trúc của chuỗi glucose liên kết α-1,4 và 1,6 35 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1: Đường chuẩn albumin 62 Đồ thị 3.2: Đường chuẩn tyrosin 64 Đồ thị 3.3: Hoạt độ của CP papain tại nhiệt độ và pH khảo sát 68 Đồ thị 3.4: Hoạt độ của chế phẩm pepsin ở pH và nhiệt độ khảo sát 74 Đồ thị 3.5: Đường chuẩn tinh bột 77 Đồ thị 3.6: Hoạt độ các enzyme của chế phẩm pancreatin tại pH và nhiệt độ khảo sát 82 Đồ thị 3.7: Hiệu suất quá trình thủy phân các protein khác nhau bởi CP papain 86 Đồ thị 3.8: Hiệu suất quá trình thủy phân các protein khác nhau bởi CP pepsin 87 Đồ thị 3.9: Hiệu suất quá trình thủy phân các protein khác nhau bởi CP pancreatin 89 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Tóm tắt quy trình tách chiết và khảo sát đặc tính các enzyme 40 Sơ đồ 2.2: Quy trình trích ly enzyme từ Dược phẩm 41 Sơ đồ 2.3: Quy trình thu chế phẩm papain 43 Sơ đồ 2.4: Quy trình thu chế phẩm pepsin 45 Sơ đồ 2.5: Quy trình thu chế phẩm pancreatin 46 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Hoạt độ của enzyme papain từ mủ đu đủ và Dược phẩm 65 Biểu đồ 3.2: Hoạt độ của chế phẩm pepsin thu nhận và Dược phẩm 71 Biểu đồ 3.3: Hoạt độ của các enzyme trong chế phẩm pancreatin thu nhận và Dược phẩm 79 DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CP Chế phẩm E Enzyme CPE Chế phẩm enzyme Hđ Hoạt độ HđR Hoạt độ riêng N F Nitơ formol N T Nitơ tổng số Pr Protein SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) TB Trung bình ∆OD Hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng UI Đơn vị hoạt độ enzyme -1- Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về ứng dụng của enzyme: Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, gluco-oxydase… được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử". [5] 1.1.1. Ứng dụng trong y dược: Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học. Đặc biệt là các phương pháp định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn đoán. Do đó, hiện nay trong y học đã xuất hiện lĩnh vực mới gọi là chẩn đoán enzyme, có nhiệm vụ: [5] • Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự hỗ trợ của enzyme. • Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật. • Xác định nồng độ cơ chất với sự hỗ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu. Dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc chống tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa protein và một số loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm… -2- Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu 1.1.2. Ứng dụng trong hóa học: Một trong những ứng dụng chế phẩm enzyme đáng được chú ý nhất trong thời gian gần đây là dùng chất mang để gắn cố định enzyme nhằm xúc tác cho phản ứng nhiều giai đoạn và tái sử dụng, ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone…Cũng bằng cách tạo phức, người ta gắn cố định vi sinh vật lên chất mang để sử dụng trong công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid…Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta cũng sử dụng enzyme, ví dụ dùng protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid … Dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích. [5] 1.1.3. Ứng dụng trong công nghiệp: Việc sử dụng enzyme trong công nghiệp rất đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn. Các lĩnh vực sử dụng enzyme protease có thể kể đến: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học…Enzyme amylase đã được dùng trong sản xuất bánh mì, công nghiệp bánh kẹo, công nghiệp rượu, sản xuất bia, sản xuất mật, glucose, sản xuất các sản phẩm rau, chế biến thức ăn cho trẻ em, sản xuất các mặt hàng từ quả, sản xuất nước ngọt, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy… [5] 1.1.3.1. Công nghiệp thực phẩm: Protease với công nghiệp thực phẩm: Việc sử dụng protease trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống. Nhân dân ta từ rất lâu đã dùng thơm để chế biến thịt bò, nấu chân giò với đu đủ xanh, kết hợp thức ăn nhiều thịt với đu đủ để trị chứng khó tiêu hóa và táo bón…mà thực chất là sử dụng các enzyme papain, bromelain, ficin. Người Nga còn dùng protease từ hạt đậu tương nẩy mầm để làm mềm thịt. [5] -3- Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu Ngoài khả năng phân giải để làm mềm thịt, tạo thức ăn dễ tiêu hóa, công nghệ sản xuất các loại dịch thủy phân giàu protein đã được áp dụng một cách có hiệu quả bởi tính năng của protease. Enzyme là một công cụ để chế biến các phế liệu của công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người và vật nuôi. Người ta còn khai thác tính đông tụ sữa của renin, pepsin vào công nghiệp sản xuất phomat. Enzyme pectinase đã được dùng trong một số ngành công nghiệp thực phẩm sau: sản xuất rượu vang, sản xuất nước quả và nước uống không có rượu, sản xuất các mặt hàng từ quả: quả cô đặc, mứt, sản xuất nước giải khát, sản xuất cà phê. Cellulase với công nghiệp thực phẩm: Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em và nói chung làm cho chất lượng thực phẩm được tăng lên. Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển…[5] Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa. Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Amylase với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm amylase đã được dùng phổ biến trong một số lĩnh vực của công nghiệp thực phẩm như sản xuất bánh mì, glucose, rượu , bia Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylase đã làm thay đổi hoàn toàn chất lượng của bánh mì cả hương vị, màu sắc, độ xốp sử dụng chế [...]... quản,… hoặc một số loại thực phẩm có chứa các chất ức chế enzyme như các loại đậu: đậu hà lan, đậu phộng, đậu nành,…cần bổ sung thêm nhiều enzyme cho cơ thể 1.3 Một số enzyme hydrolase có ứng dụng trong công nghiệp Dược phẩm: 1.3.1 Enzyme papain: 1.3.1.1 Nguồn thu nhận: a) Phân bố của cây đu đủ: Đu đủ, Carica papaya L., là một trong những loại trái cây phổ biến của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Sản lượng... các enzyme sử dụng trong liệu pháp enzyme hệ thống cần được bảo vệ khi đi qua các điều kiện môi trường này Thông thường, người ta sử dụng một số kỹ thu t như bao áo, vi bao hoặc thiết lập công thức đặc biệt cho enzyme với tá dược đi kèm Theo cách này, enzyme được bảo vệ an toàn cho tới khi đi vào ruột non Tại đây, lớp áo bao thu c bị phân giải và enzyme được hấp thu vào máu [14] Theo GS J Seifert và. .. qua mạch bạch huyết và đi vào máu [14] Những cơ chế hấp thu này áp dụng cho tất cả các phân tử lớn, không phải chỉ riêng với enzyme Vì thế, có một vấn đề hạn chế trong hấp thu enzyme, đó là khả năng các phân tử lớn khác được hấp thu vào máu trước và enzyme bị bỏ lại Vì lý do này, cần đảm bảo có đủ enzyme ở vị trí hấp thu để hiệu quả hấp thu enzyme đạt cực đại Đây cũng là lý do vì sao enzyme dùng theo... dày Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin Pepsin heo thô chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin (E.C.3.4.4.22) [8] 1.3.2.2 Cấu tạo, đặc tính và ứng dụng của pepsin trong y học: Năm 1713, Reaumur và Spallanzaai đã chứng minh bằng kết quả thí nghiệm là có ”sự tồn tại một nguyên lý tiêu hóa thịt trong dịch vị” Sau này, Braconnol và đặc biệt Paulo... trọng của protein - enzyme, làm thay đổi cấu trúc protein dẫn tới sự biến tính của enzyme Các dung môi hữu cơ ít phân cực, cũng như các chất hoạt động bề mặt có tác dụng phá vỡ cấu trúc bậc ba và làm tăng độ xoắn của mạch polypeptide trong phân tử pepsin (Tizgensons và cộng sự), do đó làm giảm hoạt tính của pepsin Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu -28- g) Ứng dụng: [12] Pepsin có nhiều ứng dụng trong. .. vật: Cơ thể người có nhiều loại enzyme, trong đó, một số loại cũng được tìm thấy ở các động vật khác; ví dụ như enzyme trypsin, do tuyến tụy tiết ra, cũng tìm thấy ở nhiều loài có xương sống khác như côn trùng, tôm và một số vi sinh vật khác như Streptomyces griseus Dù khác nhau từ nguồn thu nhận, nhưng các trypsin này đều là enzyme hydrolase và cùng cơ chế tác dụng Enzyme nguồn gốc động vật thường... trò của enzyme trong công nghiệp dược phẩm: Enzyme có nhiều công dụng kỳ diệu trong việc duy trì, cải thiện sức khỏe con người, trong điều trị bệnh và chữa lành các vết thương Đó là kết quả nghiên cứu từ nhiều công trình trên enzyme thực vật, động vật và vi sinh vật trong những thập niên gần đây Với vai trò là một chất xúc tác sinh học, enzyme được đề cập đến nhiều nhất như là chất trợ tiêu hóa và điều... dụng thu t ngữ papain để diễn tả tính chất phân hủy protein trong nhựa đu đủ Ngày nay, thu t ngữ “papain” được sử dụng để miêu tả mủ đu đủ khô được dùng rộng rãi trong công nghiệp và cả trong chế phẩm enzyme thủy phân dạng kết tinh từ mủ đu đủ [8] Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu -16- a) Cấu tạo hóa học và tính chất của papain: Papain là một endoprotease có chứa 16,1 % N và 1,2% S Papain là một protease... 6.0 [14] Sự hấp thụ enzyme trong cơ thể Enzyme dùng cho mục đích trợ tiêu hóa không cần phải hấp thu vào máu, chúng chỉ hoạt động trong dạ dày hoặc ruột non; nhưng các enzyme sử dụng trong liệu pháp hệ thống cần được hấp thu vào máu và không bị phân hủy trong đường tiêu hóa [14] Có ít nhất ba cơ chế để enzyme được hấp thụ vào ruột non Cơ chế thứ nhất gọi là sự thẩm bào (pinocytosis) Trong cơ chế này,... 14, 25 và 15% Thành phần amino acid hoàn toàn giống nhau giữa các izozymogen của các loại tương ứng, nhưng khác nhau giữa hai loại đặc biệt ở Glx/Asx và Leu/Ile Trọng lượng phân tử của pepsin là 34.500 Dalton Pepsin của heo lớn hơn một chút khoảng 35.000 Dalton [8] b) Đặc tính: Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đục, mùi đặc biệt . dụng trong dược phẩm với mục tiêu: - Thu nhận một số enzyme hydrolase có ứng dụng trong Dược phẩm, - Khảo sát đặc tính enzyme của các chế phẩm thu nhận và so sánh với các enzyme có trong thành. tế và xã hội cho nước ta trong giai đoạn hiện nay. Xuất phát từ một số thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài Thu nhận và khảo sát đặc tích của một số enzyme hydrolase ứng dụng trong. suất thu nhận chế phẩm pepsin từ dạ dày heo 69 Bảng 3.9: Hàm lượng protein hòa tan trong CP enzyme thu nhận và trong Dược phẩm 70 Bảng 3.10 : Hoạt độ của chế phẩm pepsin thu nhận và pepsin Dược