Tinh sạch và xác định đặc tính của collagen từ da các tra (pangasius hypophthalmus)

MỤC LỤC Trang phụ bìa LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3 1. Tổng quan về cá tra (pangasius hypophthalmus) 3 1.1 Tên khoa học của cá tra [2], [3] 3 1.2 Đặc điểm sinh học [3] 4 1.3 Tình hình phát triển cá tra ở Việt Nam [3] 4 1.4 Thành phần hóa học của cá [1] 4 2. Tổng quan về collagen 5 2.1 Cấu trúc phân tử của collagen [12], [14] 5 2.2 Cấu trúc sợi của collagen [14] 6 2.3 Thành phần hóa học của collagen [1], [14] 7 2.4 Phân loại collagen [14] 11 2.5 Tính chất của collagen [1], [7],[14] 12 2.5.1 Tính chất vật lý 12 2.5.2 Tính chất hóa học 12 2.6 Ứng dụng của collagen [7], [12] 12 2.6.1 Trong y học và dược phẩm 12 2.6.2 Trong công nghiệp thực phẩm 13 2.6.3 Trong mỹ phẩm 14 3. Một số nghiên cứu tách chiết collagen từ phế phụ phẩm cá [13], [15], [16], [17], [19] 15 3.1 Trích ly collagen từ da cá tuyết (Baltic cod) [11] 15 3.2 Tách chiết collagen từ da của các loài cá Pecca Nhật Bản (lacteolabra japonicas), cá Thu (Samber japonus), cá Mập (Heterodonus japonius) 17 3.3 Tách chiết collagen trên da của loài cá ngừ mắt to (Priacanthus tayenus) 19 CHƯƠNG II 21 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 1. Nguyên vật liệu 21 2. Phương pháp nghiên cứu [5], [6], [7], [8], [9], [18] 22 2.1 Phương pháp phân tích thành phần hóa sinh 22 2.1.2 Xác định thành phần acid amin 24 2.1.3 Xác định thành phần và phân tử lượng của các chuỗi trong phân tử collagen bằng phương pháp điện di trên gel SDS-polyacrylamide (SDS- PAGE) 25 2.1.4 Phương pháp xác định thành phần hóa học 26 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc bằng máy chụp SEM 28 2.4 Phương pháp phân tích vi sinh 29 3. Quy trình công nghệ 30 3.1 Nguyên liệu 31 3.2 Loại béo 31 3.3 Tẩy màu 31 3.4 Cắt nhỏ 31 3.5 Chiết collagen 32 3.6 Lọc thu dịch chiết 32 3.7 Kết tủa phân đoạn thu collagen 32 3.8 Phương pháp thẩm tích loại muối ra khỏi dung dịch bằng ống màng cellulose - RCDMB (Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing) . 32 CHƯƠNG III 34 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 34 1. Phân tích thành phần nguyên liệu 34 2. Khảo sát hàm lượng lipid sau khi loại béo 36 3. Khảo sát quá trình chiết 37 4. Phân tích thành phẩm collagen thu được 38 4.1 Thành phần hóa học trong collagen 38 4.2 Thành phần acid amin trong collagen 40 4.3 Phân tử lượng collagen được xác định bằng phương pháp điện di 43 5. Xác định nhiệt độ biến tính bằng phương pháp đo độ nhớt 44 6. Xác định cấu trúc collagen 46 7. Phân tích vi sinh 48 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 PHỤ LỤC 50 MỘT SỐ HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU TÍNH TOÁN 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học của cá (%) 5 Bảng 1.2 So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác (số gốc/1000 gốc) 8 Bảng 1.3 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide 10 Bảng 1.4 Phân loại collagen 11 Bảng 3.1 Hàm lượng các thành phần hóa học trong da cá nguyên liệu 34 Bảng 3.2 Hàm lượng lipid sau khi loại béo 36 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát chiết collagen 37 Bảng 3.4 Hàm lượng các thành phần hóa học trong collagen (phụ lục 2) 38 Bảng 3.5 Thành phần acid amin trong collagen 40 Bảng 3.6 So sánh thành phần acid amin (hydroxyproline, proline) của collagen tách chiết từ da một số loài cá 42 Bảng 3.7 Bảng biểu thị độ nhớt thông qua nhiệt độ 44 Bảng 3.8 So sánh nhiệt độ biến tính collagen da cá tra với các loài khác 45 Bảng 3.9 Kết quả phân tích vi sinh 48 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cá Tra (pangasius hypophthalmus) 3 Hình 1.2 Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix) 6 Hình 1.3 Từng bậc cấu trúc trong chuỗi collagen 7 Hình 1.4 Tổ chức bó sợi collagen 7 Hình 1.5 Công thức cấu tạo của hydroxyproline 10 Hình 1.6 Collagen Blemish Balm Cellio - Mỹ phẩm trắng da, chống nhăn, chống nắng 14 Hình 1.7 Quy trình trích ly collagen từ da cá tuyết 15 Hình 1.8 Quy trình tách chiết collagen từ da cá 17 Hình 1.9 Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của collagen da cá. (Điện di trên 3.5% gel chứa urea 3.5M: (A) Cá Pecca; (B) Cá mập; (C) cá thu 18 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân tích hydroxyproline 24 Hình 2.2 Nhớt kế Ubbelohde 26 Hình 2.3 Quy trình tinh sạch collagen từ da cá Tra (pangasius hypophthalmus) 30 Hình 3.1 Biểu đồ biểu thị hàm lượng các thành phần hóa học trong da cá tra 35 Hình 3.2 Kết quả chiết collagen bằng acid acetic 0.5M ở 4 o C, tỉ lệ 1/50 (w/v) 37 Hình 3.3 Biểu đồ biểu thị hàm lượng các thành phần hóa học trong collagen từ da cá Tra (pangasius hypophthalmus) 39 Hình 3.4 Biểu đồ biểu thị acid amin trong collagen 41 Hình 3.5 Hình chụp điện di của dung dịch tách từ da cá Tra (Pangasius hypophthalmus)collagen trên SDS – PAGE 43 Hình 3.6 Đường cong biến tính nhiệt của dung dịch collagen 44 Hình 3.7 Ảnh chụp SEM cấu trúc collagen từ da cá Tra (pangasius hypophthalmus) 47 LỜI CẢM ƠN Qua khoảng thời gian được học tập và rèn luyện tại nhà trường, chúng tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến tất cả các thầy cô trong nhà trường đã truyền đạt cho chúng tôi nhiều kiến thức bổ ích và cần thiết trong lĩnh vực kĩ thuật và cuộc sống. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn đến: Thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Môi trường đã nhiệt tình hướng dẫn và truyền đạt kiến thức chuyên môn trong suốt thời gian học tập. Th.S Lê Thị Thu Hương đã tận tuỵ hướng dẫn, giúp đỡ chúng tôi hoàn thành bài báo cáo này. Tập thể Lớp 09Sh111, bạn bè đã giúp đỡ trong suốt quá trình học tập. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai và các anh chị trong trung tâm đã tạo mọi điều kiện để chúng tôi hoàn thành tốt bài báo cáo. Cuối cùng, chúng tôi xin biết ơn gia đình và những người thân đã luôn sát cánh, chia sẻ, động viên và hỗ trợ chúng tôi. Xin chân thành cảm ơn! 1 MỞ ĐẦU Trên thế giới, việc nghiên cứu về collagen đã tiến hành từ năm 1930 bởi người Đức; ở thời kỳ đó, người ta tách chiết collagen chủ yếu từ da và xương của trâu, bò, lợn. Tuy nhiên, đến năm 1990 đã bắt đầu một hướng chuyển biến mới: “tách collagen từ da cá”, phát minh này của các nhà khoa học thuộc viện Hóa học Gdansk (Ba Lan) đã gây tiếng vang mạnh mẽ trên toàn cầu. Trong những năm gần đây nhiều quốc gia như: Mỹ, Đức, Pháp, Ba Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc đã đầu tư hàng triệu đôla vào nghiên cứu thu nhận collagen để làm nguyên liệu sản xuất da nhân tạo, chỉ tự tiêu, thuốc mỡ điều trị bỏng và các sản phẩm làm đẹp như mặt nạ, kem dưỡng da, dầu dưỡng tóc,… Ở Việt Nam, trải qua 10 năm phát triển, từ một loài cá bản địa, cá tra đã trở thành sản phẩm chiến lược, đóng góp khoảng 2% GDP của cả nước và chiếm hơn 1/2 tổng sản lượng thủy sản xuất khẩu cả nước. Đặc biệt, đồng bằng sông Cửu Long có điều kiện tự nhiên khá thuận lợi cho việc phát triển cá tra. Theo bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, các tra vẫn đang là mặt hàng chiếm tỉ trọng giá trị xuất khẩu cao nhất trong nhóm thủy sản. Năm 2012, cá tra Việt Nam được xuất khẩu sang 142 quốc gia và vùng lãnh thổ, tăng so với 136 quốc gia và vùng lãnh thổ của năm 2011. Đạt giá trị 1744 tỷ USD. 10 thị trường chiếm thị phần chính gồm: châu Âu, Mỹ, ASEAN, Trung Quốc và Hồng Kông, Mexico, Brazil, Ai Cập, Ảrập Xêut, Colombia, Australia, chiếm tỉ trọng 77,5% tổng giá trị xuất khẩu cá tra năm 2012. Cá tra đa phần được xuất khẩu dưới hình thức philê vì thế mà phế liệu thải ra trong quá trình chế biến sẽ rất nhiều (chiếm 50 - 60%). Hiện nay nước ta đã có nhiều nghiên cứu để dùng da cá làm nguyên liệu sản xuất collagen vì da cá tra chứa hàm lượng collagen khá cao, chất lượng của nó lại không thua kém các loại nguyên liệu khác, vì thế việc sử dụng da cá để sản xuất collagen đã mở một hướng đi mới cho ngành thủy sản. Như vậy, với nhu cầu rất lớn về collagen trên thế giới cũng như ở Việt Nam trong những năm gần đây, thêm vào đó nguồn nguyên liệu da cá để sản xuất collagen ở nước ta khá dồi dào, giá rẻ và có tiềm năng phát triển nên chúng tôi chọn 2 đề tài “Tinh sạch và xác định đặc tính của collagen từ da cá Tra (pangasius hypophthalmus)” với mong muốn tạo ra nhiều sản phẩm có chất lượng từ collagen để phục vụ cho sức khỏe và đời sống con người, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế cho các ngư dân và nhà sản xuất cá; đồng thời cũng góp phần bảo vệ, giảm thiểu ô nhiễm môi trường.  Mục tiêu - Tinh sạch collagen từ da cá tra. - Xác định một số đặc tính hóa lý, hóa sinh của collagen từ da cá tra.  Phương pháp nghiên cứu: phương pháp phân tích tổng hợp tài liệu. Phương pháp phân tích hóa lý, vi sinh, cảm quan. Phương pháp thống kê xử lý số liệu.  Nội dung nghiên cứu - Tìm hiểu về các phương pháp tinh sạch collagen, các phương pháp xác định đặc tính hóa lý của collagen. - Phân tích nguyên liệu (da cá tra): xác định độ ẩm, độ tro, lipid, hàm lượng collagen,… - Xử lý da cá và tinh sạch collagen từ da cá tra: xử lý da cá bằng NaOH, tách béo bằng LASNa, tẩy màu bằng H 2 O 2 , trích ly collagen bằng acid acetic, kết tủa phân đoạn để thu nhận collagen, thẩm tích, đông khô. - Xác định một số đặc tính hóa lý của dịch chiết collagen: xác định phân tử lượng bằng SDS-PAGE, xác định nhiệt độ biến tính, hàm lượng tro, hàm lượng béo, hàm lượng collagen, acid amin, độ nhớt,…  Sản phẩm của đề tài: collagen dạng bột 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về cá tra (pangasius hypophthalmus) 1.1 Tên khoa học của cá tra [2], [3] Cá tra là một trong số 11 loài thuộc họ cá tra (Pangasiidae) đã được xác định ở sông Cửu Long và lưu vực các sông lớn cực nam. Cá tra có tên tiếng Anh là : Shutchi catfish Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus Bộ cá nheo: Siluriformes Họ cá tra: Pangasiidae Giống cá tra dầu: Pangasianodon Loài cá tra: Pangasinodon hypophthalmus Hình 1.1 Cá Tra (pangasius hypophthalmus) [...]... trong collagen và xác định trong đó glycine là acid amin chính chiếm 30% - Về sắc kí điện di xác định chuỗi collagen: tác giả cũng nhận định giống như các bài báo khác, collagen chứa chuỗi α gồm chủ yếu là α1 và α2; còn α3 khó tách ra trong điều kiện điện di Ngoài ra, trong collagen còn có các chuỗi β và γ - Trọng lượng phân tử collagen nằm trong khoảng 186.5 – 69.5 kDa - Việc xác định độ nhớt của dung... Hình 1.3 Từng bậc cấu trúc trong chuỗi collagen Hình 1.4 Tổ chức bó sợi collagen Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng các liên kết ngang tạo thành các sợi theo chu kỳ nhất định Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng Vì thế collagen. .. đẩy quá trình lão hóa của cơ thể Collagen đóng vai trò quan trọng giúp cải thiện cấu trúc da, kích thích quá trình tái tạo của làn da, phục hồi tế bào da bị tổn thương Collagen hydrolysate là thành phần trong các sản phẩm mặt nạ dưỡng da chúng kết hợp với các tinh chất trong mật ong, dầu oliu, tinh dầu hoa hồng… có tác dụng dưỡng ẩm cho da, tái tạo làn da mệt mỏi, bảo vệ da khỏi các tác nhân tia tử ngoại,... 10.000 vòng/phút Collagen hòa tan Hình 1.7 Quy trình trích ly collagen từ da cá tuyết [13] 16  Những kết quả phân tích collagen trên da cá tuyết - Tác giả đã tính hàm lượng collagen thông qua việc phân tích hàm lượng hydroxyproline và nhân với hệ số chuyển đổi từ hydroxyproline qua collagen là 14.7 Hàm lượng collagen trong da cá tuyết là 21.5% (tính theo trọng lượng ướt), và 71.2% (tính theo trọng... phương pháp của Weber và Osbom (1969) để xác định chuỗi collagen Trong đó chuỗi collagen được hòa tan vào Sodium photphat 0,02M (pH= 7.2) chứa 1% Sodium dodecyl sunphat (SDS) và 3.5 ure Tiến hành điện di 3.5% gel với đệm photphate 0.1M (pH = 7.2) chứa 1%SDS Tác giả đã đo nhiệt độ biến tính của hỗn hợp collagen 0.03% hòa tan vào acid acetid 0.1M tại một số nhiệt độ Nhiệt độ biến tính collagen của da cá rất... phẩm trắng da, chống nhăn, chống nắng Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da được mịn màng, tươi tắn và trẻ trung Collagen giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào Ngoài ra, collagen còn đảm bảo sắc tố da, làm sáng màu da Sự suy giảm về chất lượng, số lượng collagen sẽ dẫn đến da trở nên khô, mất độ căng, đàn hồi và thúc... thế collagen rất chắc, dai và bền (hình 1.4) 2.3 Thành phần hóa học của collagen [1], [14]  Thành phần protein trong collagen có gần đầy đủ các loại acid amin (Schrieber và Gareis, 2007) Thành phần acid amin có thể thay đổi tùy theo nguồn 8 gốc của collagen, nhưng vẫn tồn tại một vài tính chất chung và duy nhất cho tất cả collagen Trong thành phần collagen không chứa cystein và tryptophan, nhưng chứa... các quá trình tách chiết mà chưa phân tích được những thông số của collagen như các chuỗi cấu trúc của collagen, trọng lượng phân tử, vị trí và thành phần acid amin, nhiệt độ biến tính của collagen, … 17 3.2 Tách chiết collagen từ da của các loài cá Pecca Nhật Bản (lacteolabra japonicas), cá Thu (Samber japonus), cá Mập (Heterodonus japonius) Da cá NaOH Loại tạp chất Butyl alcohol Loại tạp chất Acid acetid... Sấy thăng hoa Collagen sạch Hình 1.8 Quy trình tách chiết collagen từ da cá [19] 18  Những kết quả phân tích collagen trích chiết từ da cá - Về hiệu suất tách chiết: đạt được hiệu suất tương đối cao 51.4% (cá pecca Nhật Bản), 49.8% (cá Thu), 50.1% (cá mập) tính trên trọng lượng khô - Về phân tích cấu trúc chuỗi collagen: Hình 1.9 Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của collagen da cá (Điện di... nhớt của dung dịch collagen: trên 40oC, collagen bị biến đổi thành một hỗn hợp các dây đơn, đôi, và ba cuộn lại một cách vô trật tự (random- 20 coil single, double, triple strand) Sự phá vỡ cấu trúc collagen gây ra bởi sự thay đổi nhiệt độ và có liên hệ với sự thay đổi độ nhớt của dung dịch collagen - Tác giả còn phân tích ảnh hưởng của pH lên độ nhớt của dung dịch collagen Dung dịch collagen có độ nhớt . để sản xuất collagen ở nước ta khá dồi dào, giá rẻ và có tiềm năng phát triển nên chúng tôi chọn 2 đề tài Tinh sạch và xác định đặc tính của collagen từ da cá Tra (pangasius hypophthalmus) . Tìm hiểu về các phương pháp tinh sạch collagen, các phương pháp xác định đặc tính hóa lý của collagen. - Phân tích nguyên liệu (da cá tra) : xác định độ ẩm, độ tro, lipid, hàm lượng collagen, …. giảm thiểu ô nhiễm môi trường.  Mục tiêu - Tinh sạch collagen từ da cá tra. - Xác định một số đặc tính hóa lý, hóa sinh của collagen từ da cá tra.  Phương pháp nghiên cứu: phương pháp phân