Hình 2.3 Quy trình tinh sạch collagen từ da cá Tra (pangasius hypophthalmus)
Thẩm tích
Sấy thăng hoa
Collagen Bã NaOH 0,5% + LASNa 1%, 6h, 40C, tỉ lệ 1/10(w/v) ( thay nước: 2h/lần) H2O2 1%, 3h, 40C, tỉ lệ 1/10(w/v) Acid acetid 0.5M, 24h, 40C, tỉ lệ 1/50(w/v) NaCl 0.9M CH3COOH 0.5M Hòa tan tủa
Dịch chiết collagen Tạo tủa Chiết collagen Ly tâm Xử lý bằng NaOH, LASNa Xử lý bằng H2O2 Da cá tra Rửa sạch
3.1 Nguyên liệu
Da cá tra mua từ nhà máy về - Bảo quản lạnh
- Rã đông
- Rửa bằng nước sạch nhiều lần để loại bỏ máu và các tạp chất bẩn khác,…
3.2 Loại béo
Mục đích: nhằm làm sạch các tạp chất bẩn bám trên da cá tra, tẩy mỡ, tẩy bớt mùi tanh, chất nhờn, cắt đứt các liên kết hydro của acid béo và phi collagen. Các mạch này trở nên lỏng lẻo dẫn đến quá trình chiết collagen được dễ dàng hơn.
Da cá sau khi rã đông, rửa sạch, để ráo nước, sau đó nguyên liệu được ngâm với dung dịch LASNa ở nồng độ 1% trong môi trường NaOH 0.5%, với tỉ lệ da cá/dung dịch là 1:10(w/v) ; nhiệt độ duy trì ở 4oC. Tiến hành xử lý trong 6 giờ, thay nước rửa 2 giờ/lần. Sau đó khảo sát hàm lượng lipid sau khi loại béo so với hàm lượng lipid trong nguyên liệu da cá tra ban đầu.
3.3 Tẩy màu
Mục đích: tẩy trắng da cá tra, khử một ít mùi tanh của cá, và loại bỏ một phần lipid.
Da cá sau khi tách béo bằng LASNa được rửa sạch, để ráo sau đó đem ngâm trong dung dịch H2O2 để tẩy màu da cá ở nồng độ 1 %; với tỉ lệ da cá/dung dịch (w/v): 1:10; ở nhiệt độ 4oC. Tiến hành xử lý trong 4 giờ.
3.4 Cắt nhỏ
Mục đích: tạo diện tích tiếp xúc lớn giữa nguyên liệu và dung môi chiết để tăng hiệu quả chiết collagen.
3.5 Chiết collagen
Ngâm da cá đã cắt nhỏ trong dung dịch acid acetid 0.5M với tỉ lệ 1/50 (w/v). Nhiệt độ chiết ≤ 4oC; thời gian chiết 24 giờ trong điều kiện có khuấy trộn nhẹ. Sau đó tiến hành khảo sát quá trình chiết collagen.
3.6 Lọc thu dịch chiết
Nhằm tách phần bã từ da cá và thu được dịch chiết. Sử dụng túi vải (vải trắng mịn) để lọc lấy dịch chiết. Bã lọc để vào túi PE đem đông lạnh.
3.7 Kết tủa phân đoạn thu collagen
Hòa tan muối vào dịch lọc đến nồng độ 0.9M. Để kết tủa collagen, để yên trong 12 giờ trong tủ lạnh, nhiệt độ 4oC. Sau 12 giờ tiến hành lọc thu tủa (hoặc dùng máy ly tâm lạnh để ly tâm thu tủa).
3.8 Phương pháp thẩm tích loại muối ra khỏi dung dịch bằng ống màng cellulose - RCDMB (Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing)
Collagen dạng tủa được hòa tan trong dung dịch 0.5M acid acetid với tỷ lệ rắn/lỏng =1/10 (w/v); dung dịch collagen sau đó được rót vào ống membrane với một đầu đã được cột chặt, sau khi rót dung dịch collagen vào với thể tích chiếm khoảng 2/3 ống ta cột chặt đầu còn lại của ống. Sau đó, ống membrane chứa dung dịch collagen được ngâm trong dung dịch acid acetid loãng 0.1M, với thể tích dung dịch đệm gấp 30 lần thể tích dung dịch collagen cần thẩm tích, duy trì trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC, thời gian thẩm tích 24 giờ ở điều kiện có khuấy trộn (sử dụng máy khuấy từ đặt vào trong tủ lạnh). Dung dịch thẩm tích acid acetid 0.1M được thay 8 giờ/ lần. Nguyên tắc hoạt động của quá trình thẩm tích: các phần tử muối di chuyển từ nơi có nồng độ muối cao (bên trong màng) đến nơi có nồng độ muối thấp (bên ngoài màng), quá trình này cứ diễn ra liên tục trong hệ thẩm tích cho đến khi đạt trạng thái cân bằng (nồng độ muối bên trong và bên ngoài màng chênh lệch không đáng kể). Như vậy cứ mỗi lần thay dung dịch đệm lại có một cân bằng mới được
thiết lập trong hệ, nhờ vậy hàm lượng muối trong màng sẽ giảm dần và dung dịch collagen bên trong màng sẽ ngày càng tinh sạch hơn.
Sấy thăng hoa: dịch collagen sau thẩm tích được lọc bằng giấy lọc (sử dụng máy lọc hút chân không để gia tăng tốc độ lọc), sử dụng quá trình lọc ở giai đoạn này nhằm tách một phần nước ra khỏi dịch chiết collagen để rút ngắn thời gian sấy đông khô nhằm tiết kiệm năng lượng. Nếu không có công đoạn lọc, thời gian sấy đông khô tăng có nghĩa là năng lượng tiêu tốn cho quá trình sấy tăng, sau đó trải đều lớp collagen lên khay inox (bề dày khoảng 5mm) đem đông lạnh (-18oC). Collagen sau đông lạnh được đem sấy thăng hoa ở nhiệt độ -45oC, trong thời gian khoảng 24 giờ.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 1. Phân tích thành phần nguyên liệu
- Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: da cá sau khi rã đông được rửa bằng nước sạch, để ráo nước. Sau đó đem phân tích.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần ở cùng điều kiện. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1 Hàm lượng các thành phần hóa học trong da cá nguyên liệu
Chỉ tiêu Mẫu Kết quả đạt được Kết quả trung bình (*)
Độ ẩm (%) 1 61.6 61.53 ± 0.30 2 61.2 3 61.8 Protein (%) 1 26.93 26.77 ± 0.46 2 27.13 3 26.25 Lipid (%) 1 10.4 10.87 ±0.50 2 11.4 3 10.8 Độ tro (%) 1 0.1 0.13 ± 0.06 2 0.2 3 0.1
Hình 3.1 Biểu đồ biểu thị hàm lượng các thành phần hóa học trong da cá tra
Nhận xét: hàm lượng ẩm trong da cá tra nguyên liệu là 61.53%, ít hơn so với độ ẩm trong da cá ngừ mắt to (Priacanthus tayenus) (Kittiphattanabawon, 2004) [16]. Lượng protein thô, chất béo, và độ tro tương ứng là 26.77%, 10.87%, 0.13%, so với da cá ngừ mắt to (Kittiphattanabawon, 2004) [16] thì da cá tra ít đạm và tro hơn, nhưng hàm lượng lipid cao hơn gần 5 lần. So với da cá Pecca (lacteolabra japonicas) thì da cá tra cũng ít tro hơn nhưng hàm lượng lipid cao gần gấp 2 lần (Muyonga et al., 2004). Vì vậy mà trong quy trình khâu xử lý chất béo là rất quan trọng. 0 10 20 30 40 50 60 70
Độ ẩm Protein Lipid Độ tro
Thành phần hóa học trong da cá tra
2. Khảo sát hàm lượng lipid sau khi loại béo
- Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: da cá sau khi rã đông được rửa bằng nước sạch, để ráo nước, sau đó da cá sẽ được ngâm với dung dịch LASNa nồng độ 1% trong môi trường NaOH 0.5%, với tỉ lệ da cá/dung dịch là 1:10(w/v) trong thời gian là 6 giờ (cứ 2 giờ thay nước rửa/lần), nhiệt độ duy trì ở 4oC.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần ở cùng điều kiện. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.2 Hàm lượng lipid sau khi loại béo
Mẫu 1 2 3
Hàm lượng lipid
(%) 0.69 0.65 0.67
Trung bình (%) 0.67± 0.02
Kết quả trên cho thấy: sau khi loại béo thì hàm lượng lipid giảm so với lượng lipid trong da cá tra ban đầu, tuy nhiên vẫn chưa loại bỏ hoàn toàn lipid trong nguyên liệu. Hàm lượng lipid của da cá tra là 0.67% (sau khi loại béo), trong khi đó hàm lượng lipid (đã loại béo) từ da cá Mập (Heterodonus japonius) là 0.19% (Kittiphattanabawon et al., 2010). [10]
3. Khảo sát quá trình chiết
Da cá sau khi tẩy màu được cắt nhỏ đến kích thước 1mmx1mm. Ngâm da cá đã cắt nhỏ trong dung dịch acid acetic 0.5M với tỉ lệ 1/50 (w/v). Nhiệt độ chiết ≤ 4oC; thời gian chiết 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong điều kiện có khuấy trộn nhẹ. Sau đó tiến hành khảo sát quá trình chiết collagen.
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát chiết collagen
Thời gian (giờ) 24 48 72
Hydroxyproline (mg/ml) 3.43 3.91 3.97
Hình 3.2 Kết quả chiết collagen bằng acid acetic 0.5M ở 4oC, tỉ lệ 1/50 (w/v)
Từ kết quả trên cho thấy: thời gian chiết càng lâu thì hàm lượng hydroxyproline càng cao. Tuy nhiên, sau 24 giờ thì hàm lượng hydroxyproline tăng không đáng kể, điều này là do nồng độ collagen trong dung dịch và trong miếng da tương đương nhau, hay hệ chiết đạt đến trạng thái cân bằng. Vậy chọn thời gian chiết là 24 giờ sẽ hiệu quả nhất để tiết kiệm thời gian,….Hiệu suất chiết collagen ở từng thời điểm được xác định dựa vào tỷ số hàm lượng hydroxyproline của sản
phẩm ở thời điểm tương ứng và hàm hàm lượng hydroxyproline ở da cá đã qua xử lý loại tạp chất.
4. Phân tích thành phẩm collagen thu được 4.1 Thành phần hóa học trong collagen 4.1 Thành phần hóa học trong collagen
- Chuẩn bị mẫu phân tích: collagen dạng bông xốp được tách chiết bằng acid acetic 0.5M.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần ở cùng điều kiện. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.4 Hàm lượng các thành phần hóa học trong collagen
Chỉ tiêu Mẫu Kết quả đạt được Kết quả trung bình () Độ ẩm (%) 1 19.43 19.42 ± 0.01 2 19.41 3 19.42 Protein (%) 1 79.35 79.71± 0.41 2 79.62 3 80.16 Lipid (%) 1 0.48 0.52 ± 0.04 2 0.51 3 0.57 Độ tro (%) 1 0.355 0.351± 0.003 2 0.349 3 0.349
Hình 3.3 Biểu đồ biểu thị hàm lượng các thành phần hóa học trong collagen từ da cá Tra (pangasius hypophthalmus)
Kết quả phân tích hàm lượng lipid (0.52%) và độ tro (0.351%) của collagen từ da cá tra thấp hơn so với hàm lượng lipid và độ tro trong collagen từ da cá deap – sea redfish: lipid (1.2%), độ tro (0.9%)[10].
So với hàm lượng lipid và tro trong collagen từ da cá blacktip shark (carcharhinus limbatus) của Phanat Kittiphattanabawon thì hàm lượng lipid trong collagen từ da cá tra cao hơn 0.35%, và hàm lượng tro thấp hơn 0.229%.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
độ ẩm protein lipid độ tro
Thành phần hóa học trong collagen
4.2 Thành phần acid amin trong collagen
- Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: collagen dạng bông xốp được tinh sạch theo quy trình (hình 2.3)
Bảng 3.5 Thành phần acid amin trong collagen
Acid amin Số gốc/100gốc Acid amin Số gốc/100gốc
Alanine 4.83 Methionine 1.20
Glycine 20.74 4-Hydroxyproline 7.87
Valine 2.11 Glutamic acid 8.98
Leucine 2.25 Phenylalanine 1.53 Isoleucine 1.18 Lysine 3.10 Threonine 1.87 Histidine 0.5 Serine 2.60 Hydroxylysine 0.36 Proline 10.48 Tyrosine 0.43 Aspartic acid 4.66
Hình 3.4 Biểu đồ biểu thị acid amin trong collagen
- Qua kết quả ở bảng 3.5 ta nhận thấy
Thành phần acid amin trong collagen tinh sạch từ da cá tra (pangasius hypophthalmus) gồm 17 loại. Trong đó, hàm lượng Glycine chiếm cao nhất (20.74%) cho ta thấy Glycine là amino acid chính trong collagen.
0 5 10 15 20 25 Số gốc/100gốc
Bảng 3.6 So sánh thành phần acid amin (Glycine, hydroxyproline, proline) của collagen tách chiết từ da một số loài cá
Acid amin Loài động vật (da)
Glycine Hydroxyproline Proline
Cá Tra nghiên cứu 207.4 78.7 104.8
Cá balloon 353 68 106
Cá đuối 348 72 81
Cá nóc bạc 363 77 93
Cá bống biển (Sea chub) 326 74.2 110
Cá đuối đại bàng (Eagle ray) 326 80.2 113 Cá đuối da đỏ ( Red sting- ray) 335 102 115
Hàm lượng proline + hydroxyproline của collagen tách từ da cá tra là 183.5 / 1000 gốc, thấp hơn so với collagen tách chiết từ da cá bống biển (184.2 gốc/ 1000 gốc) và collagen tách chiết từ da cá đuối đại bàng (193.2 gốc/1000 gốc) (Kittiphattanabawon et al., 2004; Zhang et al., 2007) [16]. Và cao hơn hàm lượng proline + hydroxyproline của collagen tách từ da một số loài cá khác như: cá balloon, cá đuối, cá nóc bạc (bảng 3.6). Sự khác nhau về hàm lượng acid amin giữa các loài chủ yếu là do môi trường sống khác nhau, đặc biệt là nhiệt độ. Các loài cá sống ở vùng ôn đới và cá ở vùng nhiệt đới thì hàm lượng acid amin tách chiết từ da sẽ khác nhau.
Ở đây kết quả cho thấy, hàm lượng proline + hydroxyproline từ collagen của da cá tra sống ở đồng bằng sông Cửu Long nước ta tương đối cao hơn so với các
loài cá khác. Đây là một ưu điểm để ta ứng dụng collagen từ da cá tra vào các lĩnh vực khác nhau trong ngành y dược, mỹ phẩm và thực phẩm.
4.3 Phân tử lượng collagen được xác định bằng phương pháp điện di
- Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: dung dịch collagen sau khi thẩm tích loại muối ra khỏi dung dịch bằng ống màng cellulose - RCDMB (Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing), được đem chạy điện di.
Hình 3.5 Hình chụp điện di của dung dịch tách từ da cá Tra (Pangasius
hypophthalmus)collagen trên SDS – PAGE
- Hình 3.5 cho thấy trong dung dịch collagen thu được từ da cá tra gồm 3 chuỗi : α1, α2 và β. Và thành phần α1 nhiều hơn α2 vì đường gạch α1 dày hơn α2. Bằng phương pháp đối chiếu cột protein markers và phương pháp tam suất xác định được Collagen da cá tra thuộc loại I với chuỗi α1 có phân tử lượng 140 kDa, chuỗi α2 cóphân tử lượng là 130 kDa. Vì α1 dày gấp đôi α2, tương tự hình điện di collagen loại I từ da cá brown stripe red snapper [15]. Chuỗi β có phân tử lượng là 250 kDa
là hợp phần của 2 chuỗi α. Hình điện di này tương tự hình điện di collagen loại I tách chiết từ da cá Baltic cod, striped catfish và một số loài cá khác [13, 17].
5. Xác định nhiệt độ biến tính bằng phương pháp đo độ nhớt
Bảng 3.7 Bảng biểu thị độ nhớt thông qua nhiệt độ
Nhiệt độ (oC) 32.5 34.5 36.5 38.5 40.5 42.5 44.5 46.5 48.5 Độ nhớt (cP) 100 99.8 72.7 51.8 19.9 7.9 5.8 2.7 1.2
Hình 3.6 Đường cong biến tính nhiệt của dung dịch collagen
Kết quả cho thấy:
- Khi tăng nhiệt độ từ 32.5oC – 34.5oC, độ nhớt của dung dịch collagen giảm rất ít. Lý do là các liên kết trong cấu trúc collagen lúc này chưa bị phá vỡ.
Theo đồ thị này, thì càng tăng nhiệt độ thì độ nhớt càng giảm. Nhiệt độ biến tính, Td, được xác định là nhiệt độ mà tại đó sự thay đổi của độ nhớt đã giảm được một nửa. Và có thể xác định được nhiệt độ biến tính của collagen là 38,6oC. Như vậy, nhiệt độ biến tính từ da cá tra pangasius hypophthalmus cao hơn so với nhiệt độ biến tính của collagen từ da các loài cá nước lạnh như da cá tuyết (15oC) và của 1 số loài cá khác như cá rô Nile (36oC), cá đuối đại bàng (34.1oC), cá đuối da đỏ (33.2oC), cá balloon (30.30oC). Ngược lại, nhiệt độ biến tính collagen từ da cá tra lại thấp hơn nhiều so với nhiệt độ biến tính collagen từ da cá ngừ mắt to (Priacanthus tayenus) (40.4oC) (Jongjareonrak, Benjakul, Visessanguan, và Tanaka, 2005) [16].
Theo các kết quả và so sánh nhiệt độ biến tính của collagen da cá tra với các loài khác như sau:
Bảng 3.8 So sánh nhiệt độ biến tính collagen da cá tra với các loài khác
Loài động vật (da) Tên khoa học Nhiệt độ biến
tính (oC)
Cá tra nghiên cứu Pangasius hypophthalmus 38.6
Cá rô Nile (Nile perch) Lates niloticus 36 Cá đuối đại bàng (eagle ray) Myliobatis tobijei 34.1 Cá đuối da đỏ (red stingray) Dasyatis akajei 33.2
Cá balloon Diodon holocanthus 30.3
Cá bống biển (Sea chub) Kyphosus bigibbus 29
Nhiệt độ biến tính collagen từ da phụ thuộc thành phần imino acid (proline và hydroxyproline), khác nhau giữa các loài là do có sự khác biệt về giống loài, về môi trường sống,…
Theo Soottawat Benjakul và cộng sự, nhiệt độ biến tính của collagen phụ thuộc vào vị trí của chuỗi Gly-X-Y và hàm lượng các thành phần acid amin, đặc biệt là các thành phần proline, hydroxyproline, glycine do sự tồn tại các vòng pyrrolidine của proline, hydroxyproline và các liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của hydroxyproline ở cấu trúc bậc hai trong chuỗi polypeptide của collagen.
Cá sống vùng nhiệt đới sẽ có nhiệt độ biến tính cao hơn cá sống ở vùng ôn đới. Vì hàm lượng imino acid, đặc biệt là hydroxyproline, phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường sống của cá và nó ảnh hưởng lên sự bền nhiệt của collagen. Collagen có nguồn gốc từ các loài cá sống trong môi trường nước lạnh có thành phần hydroxyproline thấp hơn so với những loài sống ở vùng nước ấm.
Cá tra là loài sống ở vùng nước ấm nên có chứa nhiều hydroxyproline nên nhiệt độ biến tính cao. Ở đây kết quả cho thấy, nhiệt độ biến tính collagen của da cá tra sống ở đồng bằng sông Cửu Long nước ta cao hơn so với các loài cá khác. Đây là một ưu điểm để ta ứng dụng collagen từ da cá tra vào các lĩnh vực khác nhau trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm.
6. Xác định cấu trúc collagen
Chuẩn bị mẫu: dung dịch collagen sau khi tinh sạch theo quy trình (hình 2.3)