Tinh sạch các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm từ chủng bacillus phân lập ở việt nam

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÝ THỊ BÍCH HẠNH TINH SẠCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Tuyên Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii THÁI NGUYÊN - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu dƣới nhóm cộng nghiên cứu phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thực từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2015 Thái Nguyên, ngày 06 tháng 11 năm 2015 Học viên Lý Thị Bích Hạnh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam định hƣớng nghiên cứu, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian cho trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn anh chị cán Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học bảo, giúp đỡ tận tình cho trình nghiên cứu nhƣ chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh thầy cô giáo trƣờng Đại Học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, thầy cô Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình bạn bè giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, Tháng năm 2015 Học viên Lý Thị Bích Hạnh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv BẢNG CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium presulphate AFC Antifungal compound B subtilis Bacillus subtilis BCF Biological Control Fungi CFU Connoly-Forming unit DEAE-cellulose Dimethylaminoethyl-cellulose ĐC Đối chứng F oxysporum Fusarium oxysporum kDa Kilo Dalton LB Luria – Bertani PDA Potato Dextrose agar M Marker MIC Minimal Inhibitory Concentration FTIR Fourirer ransform infrared spectroscopy TLC Thin Layer Chromatography Pr Protein R solani Rhizoctonia solani SDS Sodium doecyl sulfate TB Trung bình TEMED N, N, N’, N’, - Tetramethyl ethylene diamine TN Thí nghiệm v/v Volume/volume (thể tích/ thể tích) w/v Weight/volume (khối lƣợng/thể tích) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG vii MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chất đối kháng sinh trƣởng nấm 1.2 Vai trò vi khuẩn B subtilis kiểm soát sinh học 1.2.1 Đại cƣơng vi khuẩn B subtilis 1.2.2 Nghiên cứu hợp chất có hoạt tính kháng nấm 1.3 Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm giới 1.4 Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm Việt Nam .13 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 2.1 Vật liệu hóa chất 16 2.1.1 Chủng giống 16 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Các loại đệm dung dịch 16 2.1.4 Môi trƣờng 17 2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 18 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh thu nhận dịch ngoại bào 18 2.2.2 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính ức chế sinh trƣởng nấm 19 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi 2.2.3 Thử hoạt tính kháng nấm khoanh giấy lọc 20 2.2.4 Phƣơng pháp tủa muối amonium sulfate 20 2.2.5 Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose 20 2.2.6 Phƣơng pháp sắc ký lọc gel Biogel P100 21 2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số 23 2.2.8 Điện di SDS - PAGE 23 2.2.9 Đánh giá tính chất lý hóa protein tinh 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Hoạt tính ức chế nấm dịch lọc ngoại bào chủng B subtilis AS 27 3.1.1 Hoạt tính ức chế dịch lọc ngoại bào nấm F oxysporum 27 3.1.2 Hoạt tính ức chế dịch lọc ngoại bào nấm R solani 29 3.2 Tinh protein có hoạt tính kháng nấm 31 3.2.1 Tủa protein muối amonium sulfate 31 3.2.1 Tinh qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose 31 3.2.2 Tinh protein có hoạt tính kháng nấm qua sắc ký lọc gel Biogel P100 35 3.3 Đánh giá tính chất protein tinh 39 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 40 3.3.2 Ảnh hƣởng proteinase K 41 3.3.3 Khả ức chế sợi bào tử nấm 43 3.3.4 Hoạt tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein với nấm R.solani F oxysporum 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 Kết luận 48 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS môi trƣờng PDA Hình 2.1 Quy trình tinh protein kháng nấm từ chủng B subtilis AS 22 Hình 2.2 Đƣờng chuẩn Brardford 23 Hình 3.1 Hoạt tính ức chế dịch lọc ngoại bào chủng B subtilis AS nấm F oxysporum sau ngày 28 Hình 3.2 Hoạt tính ức chế nấm dịch lọc ngoại bào chủng B subtilis AS nấm R solani sau ngày 30 Hình 3.3 Sắc ký đồ phân đoạn qua cột sắc ký trao đổi ion DEAEcellulose 32 Hình 3.4 Điện di đồ phân đoạn protein tinh qua cột DEAE – celulose 33 Hình 3.5 Hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A, D) R solani (B, C) 34_Toc434515732 Hình 3.6 Sắc ký đồ phân đoạn proteintinh có hoạt tính kháng nấm sau qua cột Biogel P100 36 Hình 3.7 Điện di đồ phân đoạn protein có hoạt tính kháng nấm qua cột Biogel P100 36 Hình 3.8 Các phân đoạn protein tinh có hoạt tính kháng nấm qua cột Biogel P100, 38 Hình 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A) 40 Hình 3.10 Ảnh hƣởng proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A) nấm R solani (B) 42 Hình 3.11 Khả ức chế nảy mầm bào tử F oxysporum protein tinh từ chủng B subtilis AS 44 Hình 3.12 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh từ chủng B subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum 45 Hình 3.13 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh từ chủng B subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm nấm R solani 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần loại đệm dung dịch 17 Bảng 2.2 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 17 Bảng 2.3 Danh sách thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng 18 Bảng 2.4 Thành phần gel cô gel tách 24 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng nồng độ dịch lọc tế bào B subtilis AS lên sinh trƣởng F oxysporum 28 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ dịch lọc tế bào B subtilis AS lên sinh trƣởng nấm R solani 29 Bảng 3.3 Tóm tắt trình tinh protein kháng nấm từ chủng B subtillis AS qua bƣớc tinh 39 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Hàng năm, bệnh trồng gây tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp Theo tổ chức nông lƣơng liên hợp quốc (FAO, 2004), thiệt hại nông nghiệp bệnh vi nấm gây đến 537,3 triệu loại nông sản chủ yếu, chiếm khoảng 11,6% tổng sản lƣợng nông nghiệp giới Trong chiếm 83% bệnh vi nấm gây ra, chủ yếu bệnh nhƣ: đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng… đặc biệt bệnh nấm Fusarium Rhizoctonia gây chiếm tỉ lệ tƣơng đối lớn Hiện nay, biện pháp hóa học đƣợc sử dụng phổ biến rộng rãi với lƣợng lớn mang lại hiệu phòng trừ cao, rẻ tiền Tuy nhiên bên cạnh đó, gây tác hại to lớn đến môi trƣờng sức khỏe ngƣời, tạo kháng thuốc với nhiều loại bệnh hại Vì gây nên nhiều khó khăn công tác phòng trừ bệnh Để khắc phục nhƣợc điểm biện pháp hóa học gây nhƣ trên, giới nhƣ Việt Nam, việc sử dụng chế phẩm sinh học thay phần thuốc hóa học để phòng trừ số bệnh trồng vi sinh vật gây xu hƣớng chủ yếu Chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng có tác dụng tích cực nông nghiệp, ƣu việt so với việc dùng thuốc hóa học Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn để diệt nấm gây hại trồng mang lại lợi ích lâu dài cho ngƣời sản xuất nhƣ: làm tăng suất trồng, giảm chi phí đầu tƣ, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trƣờng sinh thái, không ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời vật nuôi, góp phần quan trọng việc phát triển nông nghiệp hữu bền vững hiệu Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu công bố đƣợc biết đến với vai trò quan trọng việc kiểm soát bệnh trồng Chúng có khả sinh tổng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhƣ chất kháng sinh, lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin fengycin Một số chủng Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng để kiểm soát bệnh trồng nấm gây Việc nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh trồng chế phẩm sinh học đƣợc hình thành phát triển Việt Nam nhƣng nhiều hạn chế Các chế phẩm dƣới dạng tinh tách chiết từ vi sinh vật nghiên cứu chủ yếu phòng thí nghiệm quy mô sản xuất thử nên giá thành cao Các sản phẩm thị trƣờng chủ yếu sản phẩm có chứa tế bào vi sinh vật đối kháng nên thời gian hữu hiệu ngắn hiệu không cao Mặt khác, sản phẩm sử dụng tế bào mang nguy gây bệnh lớn cho ngƣời Vì vậy, để phát triển sản phẩm sinh học đạt độ tinh cao để phòng chống nấm bệnh trồng vấn đề cấp thiết Trong trình nghiên cứu, phân lập tuyển chọn đƣợc chủng B subtilis AS có khả ức chế mạnh nấm gây bệnh trồng nhƣ F oxysporum R solani Xuất phát từ lý tình hình nghiên cứu Việt Nam, thực đề tài luận văn: "Tinh hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập Việt Nam" Mục tiêu đề tài - Tinh hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm F oxysporum R solani từ chủng B subtilis AS - Đánh giá tính chất lý hóa hợp chất đƣợc tinh Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả ức chế sinh trƣởng phát triển dịch lọc ngoại bào vi khuẩn B subtilis AS hai chủng nấm F oxysporum R solani - Tách chiết tinh protein có hoạt tính kháng nấm từ dịch lọc ngoại bào vi khuẩn B subtilis AS - Đánh giá ảnh hƣởng nhiệt độ, proteinase K, ức chế sợi tử bào nấm nồng độ ức chế tối thiểu lên hoạt tính kháng nấm protein tinh đƣợc 45 nấm bị protein làm cho ức chế, sợi nấm co ngắn lại, sợi nấm không ủ với protein phát triển bình thƣờng sợi nấm dài [40] Tan cộng (2013) nghiên cứu khả ức chế sợi bào tử nấm, protein từ chủng B.subtilis B25 có khả ức chế sợi bào tử nấm F oxysporum làm cho sợi bào tử nấm sƣng lên, biến dạng, bất thƣờng [58] 3.3.4 Hoạt tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein với nấm R solani F oxysporum Từ kết thu đƣợc tinh protein, tiếp tục nghiên cứu đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) hoạt chất tinh thu đƣợc, nhƣ thử nghiệm lại hoạt tính đối kháng với hai loại nấm F oxysporum R solani theo phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung Hình 3.12 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh từ chủng B subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum 46 Hình 3.13 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh từ chủng B subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm nấm R solani Trong nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh bổ sung protein nồng độ 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml 0,9 mg/ml vào đĩa thạch PDA xác định hoạt tính ức chế nấm F.oxysporum nấm R solani theo đƣờng tròn đồng tâm sau 3-5 ngày nuôi cấy (Hình 3.12 Hình 13) Đã xác định khả ức chế nấm F.oxysporum nấm R solani nồng độ protein có hoạt tính kháng nấm đƣợc tách chiết từ chủng B subtilis AS 0,6 mg/ml đến 0,9 mg/ml Ở nồng độ 0,6 mg/ml, protein có hoạt tính kháng nấm ức chế đƣợc 85% sinh trƣởng phát triển nấm R solani 96% sinh trƣởng phát triển nấm F.oxysporum Khi nồng độ hoạt chất tăng lên 0,7 mg/ml hoạt chất ức chế đƣợc 89% nấm R solani 97% nấm F.oxysporum Hoạt tính nồng độ ức chế tối tối thiểu (MIC) protein có hoạt tính kháng nấm 0,9 mg/ml, nồng độ 47 (MIC) protein ức chế 98% 95% sinh trƣởng phát triển nấm F.oxysporum (Hình 3.12) nấm R solani (Hình 3.13) Nhƣ kết nghiên cứu phù hợp với số tác giả công bố Nhƣ kết nghiên cứu phù hợp với số tác giả công bố nhƣ: nồng độ ức chế tối thiểu phenazine-1-carboxylic acid (PCA) Sclerotium rolfsii NCIM 1084 29 mg/ml [52] Năm 2009 Li cộng nghiên cứu khả ức chế nồng độ tối thiểu(IC50) protein có hoạt tính kháng nấm B29I có khả ức chế sinh trƣởng phát triển nấm F.oxysporum R solani tƣơng ứng 45 112 µmol/L [37] Kumar cộng (2009) tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chất kháng sinh có hoạt tính kháng nấm đƣợc tách chiết từ chủng B subtilis MTCC-8114 135 145 µg/ml tƣơng ứng nấm Microsporum fulvum Trichophyton [30] 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Dịch lên men chủng B subtilis AS với nồng độ 20% ức chế đƣợc 60% sinh trƣởng phát triển hai chủng nấm F oxysporum R solani, đặc biệt nồng độ 50% làm cho hạch chủng nấm F oxysporum khả nảy mầm Đã tinh đƣợc protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng B subtilis AS có kích thƣớc phân tử 14 kDa 45 kDa Hiệu suất tinh đạt 62% Protein tinh có kích thƣớc phân tử 45 kDa từ chủng B subtilis AS bền với nhiệt độ đƣợc xử lý nhiệt độ 80oC 30 phút không làm ảnh hƣởng đến khả kháng nấm Proteinase K không ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng nấm F oxysporum với nồng độ ủ từ 0,5- µg Protein tinh làm cho sợi bào tử nấm co ngắn lại khả nảy mầm bảo tử nấm đƣợc xử lý với protein nồng độ 80 µg/ml 24 48 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh 0,9 mg/ml, ức chế nấm F oxysporum R solani tƣơng ứng đạt 98% 95% Đề nghị Hoàn thiện quy trình tinh protein có hoạt tính kháng nấm quy mô lên men lớn ứng dụng tạo sản phẩm sinh học có khả kháng nấm phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Tấn Dũng (2007), Nghiên cứu bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani) hại số trồng Hà Nội năm 2005 – 2006, Tạp chí Bảo vệ thực vật, 1/2007 Đỗ Thị Tuyên, Lê Đình Quyền, Quyền Đình Thi, Nguyễn Ngọc Dũng (2011), “Tinh protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis XL62”, Tạp chí Công Nghệ Sinh Học, 3, tr 1811- 4989 Lê Thanh Hoàng, Lê Đình Quyền, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi, Nguyễn Ngọc Dũng, Đoàn Thị Thanh (2012), “Thử nghiệm chế phẩm BCF phòng trừ số nấm hại trồng điều kiện nhà lƣới đồng ruộng” Tạp chí Bảo vệ thực vật, 3, tr 26-31 Lê Hồng Minh, Phạm Việt Cƣờng, Nguyễn Thị Kim Cúc (2005), Tách dòng giải trình tự gen PhlD mã hóa cho 2,4- diacetylphloroglucinol từ Serratia marcescens kháng Fusarium oxysporum In: Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc, tr 1315 – 1317 Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Kim Vân (2003), “Nghiên cứu chủng nấm Rhizoctonia solani Kuhn gây hại cải bắp bƣớc đầu khảo sát biện pháp phòng trừ”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, 192, tr 18-21 Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh (2007), Khả phân hủy sợi nấm mối quan hệ di truyền từ chủng Bacillus sp TD67 In: Tuyển tập Hội thảo Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nxb Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Phan Thị Hoài Anh, Nguyễn Ngọc Dũng (2006), “Nghiên cứu chế kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trồng số chủng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang chọn lọc”, Tạp chí Sinh học, 28, tr 77 – 81 50 Trƣơng Thanh Giản (1995), “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu bệnh chế phẩm vi khuẩn nấm”, Đề tài nghiên cứu Viện Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn Tài liệu Tiếng Anh Agrios G.N (2005), “Plant Pathology 5th Edn” Elsevier Academic Press 10 Ali M.I, Asif S., Ahmad A., Jamal A., Jaffri S.A (2010), “Evaluation of ipopeptide (susfactin) production by bacillus subtilis”, Biomedica, 26, pp 34 – 38 11 Ali S., Hameed S., Imran A., Iqbal M., Lazarovits G (2014), “Genetic, physiological and biochemical chracterization of Bacillus sp train RMB7 exhibiting plant growth promoting and broad spectrum antifungal activities”, Microb Cell Fact, 13, pp 144 12 Babasaki K., Takao T., Shimonishi Y., Kurahashi K (1985), “Subtilosin A, a new antibiotic peptide produced by Bacillus subtilis 168: isolation, structural analysis, and biogenesis”, J Biochem, 98(3), pp 585-603 13 Bassam B.J., Caetano-Anolles G., and Gresshoff P.M (1991), “Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacylamide gels”, Analytical biochemistry, 196(1), pp 80 – 83 14 Benhamou N., Broglie K., Broglie R., chet I (1993), “Antifungal effect of bean endochitinase on Rhizoctonia solani: ultrastructural changes and cytochemical aspect of chitin breadown”, Can j Microbiol, 39(3), pp 318 – 328 15 Bradford M.N (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Anal Biochem, 72, pp 248-254 51 16 Carrillo C., Teruel J.A., Aranda F.J., Ortiz A (2003), “Molecular mechanism of membrane premeabilization by the peptide antibiotic surfactin”, Biochim Biophys Acta, 1611(1-2), pp 91 – 97 17 Chitarra G.S., Breeuwer P., Nout M.J., Van Aelst A.C., Rombouts F.M., Abeet (2003), “An antifungal compound produced by Bacillus subtilis YM 10-20 inhibits germination of Penicillium roqueforti conidiospores”, J Appl Microbiol, 94(2), pp 159 – 166 18 Christopher A., David A., Michael J., Alejandro P (2015), “Genomic analysis of Bacillus subtilis OH 131.1 and co-culturing with Cryptococcus flavescens for control of Fusarium head bligh”, Plant Gene, 2, pp – 19 Christopher A.D., David A.S., Neil PP., Stenven F.V (2011), “Cyclic lipopeptide profile of three Bacillus subtilis strains; antagonists of fusarium head blingt”, The Journal of Microbiology, 49(4), pp 603 – 609 20 De Lucca A.J., Jack T.J., Takemoto J., Vinyard B., Peter J., Navarro E., Walsh T.J (1999), “Fungal lethality, binding, and cytotoxicity of syringomycin-E”, Antimicrob Agents Chemother, 43, pp 371-373 21 Elkahoui S., Djébali N., Yaich N., Azaiez S., Hammami, Essid R., Limam F (2015), “Antifungal activity of volatile compounds-producing Pseudomonas P2 strain against Rhizoctonia solani”, World J Microbiol Biotechnol, 31(1), pp 175-185 22 Gerhardson B (2002), “Biological substitutes for pesticides”, Trends Biotechnol, 20, pp 338-343 23 Ghosh M (2006), “Antifungal properties of haem peroxidase from Acorus calamus”, Ann Bot 98(6), pp 1145-1153 24 Guo Q., Dong W., Li S., Lu X., Wang P., Zhang X., Wang Y., Ma P (2014), “Fengycin produced by Bacillus subtilis NCD-2 plays a major role 52 in biocontrol of cotton seedling damping-off disease”, World J Microbiol Biotechnol, 29(1), pp 155-164 25 Iijima R., Kurata S., Natori S (1993), “Purification, characterization and cDNA cloning of an antifungal protein from the hemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh fly)”, J Biol Chem, 268(16), pp 1205512062 26 Ji S.H., Paul N.C., Deng J.X., Kim Y.S., Yun B.S., Yu S.H (2013), “Biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 against fungal plant disease”, Mycobiology, 41(4), pp 234-42 27 Joshi B.N., Sainani M.N Fau – Bastawade K.B., Bastawade K.B Fau – Gupta V.S (1998), “Cysteine protease inhibitor from pearl millet: a new class of antifungal protein”, World J Microbiol Biotechnol, 11(1), pp 125-133 28 Kim P.I., Chung K.C (2004) “Production of an antifungal protein for control of Colletotrichum lagenarium by Bacillus amyloliquefaciens MET0908”, FEMS Microbiol Lett, 234(1), pp 177-183 29 Kim P.I., Ryu J., Kim Y.H., Chi Y.T (2010), “Production of Biosurfactant Lipopeptides Iturin A, Fengycin, and Surfactin A from Bacillus subtilis CMB32 for Control of Colletotrichum gloeosporioides”, J Microbiol Biotechnol, 20, pp 138-145 30 Kumar A., Saini P., Shrivastava J.N (2009), “Production of peptide antifungal antibiotic and biocontrol activity of Bacillus subtilis”, Indian J Exp Biol, 47(1), pp 57-62 31 Kumar A., Saini P., Shrivastava J.N (2009), “Production of peptide antifungal antibiotic andbiocontrol activity of Bacillus subtilis”, Indian J Exp Biol, 47(1), pp 57-62 53 32 Laemmli U.K (1970), “Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227, pp 680-685 33 Lam S.K., Ng T.B (2001), “Isolation of a novel thermolabile heterodimeric ribonuclease with antifungal and antiproliferative activies from roots of the sanchi ginseng panax notoginseng”, Biochem Biophys Res commun, 285(2), pp 419 – 423 34 Lam Y.W., Wang H.X., Ng T.B (2000), “A robust cysteine-deficient chitinase-like antifungal protein from inner shoots of the edible chive Allium tuberosum”, Biochem Biophys Res Commun, 279(1), pp 74-80 35 Latoud C., Peypoux F., Michel G., Genet R., Morgat J (1986), “Interactions of antibiotics of the iturin group with human erythrocytes”, Biochem Biophys Acta, 35, pp 526-535 36 Lee C., Kim S., Hyun B (1994), “Cepacidine A, a novel antifungal antibiotic produced by Pseudomonas cepacia I Taxonomy, production, isolation, and biological actity”, J Antibiot, 47, pp 1402 -1405 37 Li J., Yang Q., Zhao L., Zhang S., Wang Y., Zhao X (2009), “Purification and charracterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29”, Journal of Zhejiang University Science B, 10(4), pp 264-272 38 Li L., Ma M., Huang R., Qu Q., Li G., Zhang K., Lu K., Niu X., Luo J (2012), “Induction of chlamydospore formation in fusarium by cyckic lipopeptide antibiotics from bacillus subtilis C2”, J Chem Ecol, 38(8), pp 966 – 974 39 Liu Y., Chen Z., Ng T.B., Zhang J., Zhou M., Song F., Lu F., Liu Y (2007), “Bacisubin, an antifungal protein with ribonuclease nd hemagglutinating activities from Bacillus subtilis strain B-916”, Peptides, 28(3), pp 553-559 54 40 Liu Y., Xu Q., Chen Z (1999), “Purification and characterization of antifugal peptide LP-1”, Acta microbiologica Sinnica, 39(5), pp 553 – 559 41 Loeffler W., Tschen J.S.M., Vanittanakom N., Kulger M., Knorpp E., Hsieh T.F., Wu T.G (1986), “Antifungal effects of bacilysin and fengycin from bacillus subtilis F29-3 A comparison with activities of other bacillus antibiotics”, J Phytopathol, 115(3), pp 204 – 213 42 Malfanova N., Franzil L., Lugtenberg B., Chebotar V., Ongena M (2012), “Cyclic lipopeptide profile of the plant-beneficial endophytic bacterium Bacillus subtilis HC8”, Arch Microbiol, 191(11), pp 839-899, 43 Mendizabal V.Y., Zeriouh H., Vinas I., Torres R., Usall J., Vicente A., Garcia A.P., Teixido N (2012), “Biological control of peach brown rot (Monilinia spp.) by bacillus subtilis CPA -8 is based on production of fengycin-like lipopeptides”, Eur J Plant Pathol, 132, pp 609 – 619 44 Moyne A.L., Cleveland T.E., Tuzun S (2004), “Molecular characterization and analysis of operon encoding the antifungal lipopeptide bacillomycin D”, FEMS, Microbiol Lett, 234(1), pp 43 – 49 45 Ngai P.H.K., Zhao Z., Ng T.B (2005), “Agrocybin,an antifungal peptide from the edible mushroom Agrocybe cylindrecea”, Peptides, 26(2), pp 191 – 314 46 Ongena M., Jacques P (2008), “Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol”, Trends in Microbiology, 16, pp 115-125 47 Ongena M., Jacques P., Touré Y., Destain J., Jabrane A., Thonart P (2005), “Involvement of fengycin-type lipopeptides in the multifaceted biocontrol potential of Bacillus subtilis”, Applied Microbiology and Biotechnology, 69, pp 29-38 48 Paik S.H., Chakicherla A., Hansen J.N (1998), “Identification and characterization of the structural and transporter genes for, and the chemical 55 and biological properties of, sublancin 168, anovel lantibiotic produced by Bacillus subtilis 168”, J Biol Chem, 273(36), pp 23134-23142 49 Peypoux F., Beson F., Michel G (1980), “Characterization of a new antibiotic of iturin group bacilloycin D”, J Antibiot, 33(10), pp 1146 – 1149 50 Peypoux F., Pommier MT., Marion D., Ptak M., Das B.C., Michel G (1986), “Revised structure of mycosubtilin, a lipidolipid antibiotic from B subtilis”, J Antibiot, 39(5), pp 636 – 641 51 Peypoux F., Pommier M.T., Marion D., Ptak M., Das BC., Michel G (1986), “Revised structure of mycosubtilin, a lipidolipid antibiotic from B subtilis”, J Antibiot, 39(5), pp 636 – 641 52 Ran MR., Sarode P.D., Chaudhari B.L., Chincholkar S.B (2007), “Detection, isolation and identification of phenazine-1-carboxylic acid produced by biocontrol strains of pseudomonas aeruginosa”, Jscien Indus Res, 66, pp 627-631 53 Rezuanul Islam, Yong Tae Jeong, Yong Se Lee, and Chi Hyun Song (2012), “Isolation and Identification of Antifungal Compounds from Bacillus subtilis C9 Inhibiting the Growth of Plant Pathogenic Fungi”, Mycobiology, 40(1), pp 59-66 54 Sarangi N.P., AthukoralamW.G., Dilantha F., Khalid Y.R (2009), “Identification of antifungal antibiotics of Bacillus species isolated from different microhabitats using polymerase chain reaction and MALDI-TOF mass spectrometry”, Can J Microbiol, 55, pp 1021-1032 55 Seger A., bachman R.C., Ballio A., Bossa F., Grgurina I., Lacobellis N.S., Marino G., Pucci P., Simmaco M., Takemoto J.Y (1989), “The struc ture of syringomcins A1, E, and G”, FEBS Lett, 255, pp 27 – 31 56 56 Sengupta S., Banerjee A.B., Bose S.K (1971), “γ-Glutamyl and D-or Lpeptide linkages in mycobacillin, a cyclic peptide antibiotic”, Biochem J, 121, pp 839 – 846 57 Stein T (2005), “Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions”, Mol Microbiol, 56(4), 845 – 857 58 Tan Z., Lin B., Zhang R (2013) “A novel antifungal protein of Bacillus subtilis B25”, Springerplus, 2, pp 543 59 Tenorio S., Tinoco R., Vazquez-Duhalt R (2013) “Identification of volatile comprounds produced by the bacterium Bukholderia tropica that inhibit the growth of fungal pathogens”, Bioengineered, 4(4), pp 236-243 60 Wang H., Ng T.B (2002), “Isolation of cicadin, a novel and potent antifungal peptide from juvenile cicadas”, Peptides, 23(1), pp – 11 61 Yiu-Kwok C., Marc E.S., Lana M.R., Terry C., Wayne A.M., Charles S (2012), “Identification of lipopeptide antibiotics of a bacillus subtilis isolate and their control of Fusarium graminearum dises in maize and wheat”, Bio Control, 54(3), 567 – 574 62 Zhang B., Xie C., Yang X (2008) “Anovel small antifungal peptide from Bacillusstrain B-TL2 isolated from tobacco stems”, Peptides, 29(3), pp 350355 63 Zuber P., Nakano M.M., Mahariel M.A (1993), “Petide antibiotics In Bacillus subtilis and other gram – positive bacteria”, American Society of Microbiology, pp 897 – 916 PHỤ LỤC Bảng P1 Bảng đo hàm lƣợng protein qua cột DEAE – celulose Phân đoạn OD OD 2 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0,045 0,047 0,048 0,054 0,059 0,062 0,067 0,126 0,735 0,912 0,855 0,738 0,512 0,102 0,093 0,085 0,085 0,074 0,073 0,071 0,069 0,066 0,065 0,057 0,053 0,048 0,045 0,038 0,031 0,028 0,047 0,048 0,050 0,052 0,059 0,060 0,065 0,289 0,806 0,915 0,841 0,731 0,508 0,121 0,102 0,086 0,085 0,073 0,072 0,071 0,067 0,066 0,064 0,053 0,054 0,046 0,044 0,032 0,029 0,029 OD TB Hàm lƣợng OD1 Hàm lƣợng OD2 Hàm lƣợng ODTB mg/ml 0,046 0,048 0,049 0,053 0,059 0,061 0,066 0,208 0,771 0,914 0,848 0,735 0,510 0,112 0,098 0,086 0,085 0,074 0,073 0,071 0,068 0,066 0,065 0,055 0,054 0,047 0,045 0,035 0,030 0,029 0,005588 0,006209 0,00652 0,008382 0,009935 0,010866 0,012419 0,030736 0,219808 0,274759 0,257063 0,220739 0,150574 0,023285 0,020491 0,018007 0,018007 0,014592 0,014281 0,01366 0,013039 0,012108 0,011798 0,009314 0,008072 0,00652 0,005588 0,003415 0,001242 0,00031 0,006209 0,00652 0,007141 0,007762 0,009935 0,010245 0,011798 0,081341 0,24185 0,275691 0,252717 0,218566 0,149333 0,029183 0,023285 0,018317 0,018007 0,014281 0,013971 0,01366 0,012419 0,012108 0,011487 0,008072 0,008382 0,005899 0,005278 0,001552 0,000621 0,000621 0,005899 0,006364 0,00683 0,008072 0,009935 0,010556 0,012108 0,056038 0,230829 0,275225 0,25489 0,219652 0,149953 0,026234 0,021888 0,018162 0,018007 0,014437 0,014126 0,01366 0,012729 0,012108 0,011642 0,008693 0,008227 0,006209 0,005433 0,002484 0,000931 0,000466 0,0590 0,0636 0,0683 0,0807 0,0993 0,1056 0,1211 0,5604 2,3083 2,7523 2,5489 2,1965 1,4995 0,2623 0,2189 0,1816 0,1801 0,1444 0,1413 0,1366 0,1273 0,1211 0,1164 0,0869 0,0823 0,0621 0,0543 0,0248 0,0093 0,0047 Bảng P2 Bảng đo hàm lƣợng protein qua cột Biogel P100 Phân đoạn OD OD ODTB Hàm Hàm Hàm lƣợng lƣợng lƣợng OD1 OD2 OD TB mg/ml 0,365 0,0361 0,20055 0,104936 0,002825 0,054 0,5388 0,306 0,345 0,3255 0,086619 0,098727 0,093 0,9267 0,296 0,287 0,2915 0,083514 0,08072 0,082 0,8212 0,222 0,178 0,2 0,06054 0,04688 0,054 0,5371 0,195 0,184 0,1895 0,052158 0,048743 0,050 0,5045 0,223 0,221 0,222 0,060851 0,06023 0,061 0,6054 0,143 0,131 0,137 0,036014 0,032288 0,034 0,3415 0,112 0,106 0,109 0,026389 0,024527 0,025 0,2546 0,033 0,025 0,029 0,001863 -0,00062 0,001 0,0062 10 0,022 0,023 0,0225 -0,00155 -0,00124 -0,001 -0,0140 Bảng P3 Khả nồng độ ức chế tối thiểu chủng B subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm R solani nấm TN R solani mẫu TN d0 (cm) d1 (cm) % ức chế ĐC 4,5 600 3,5 1,75 84 700 1,5 89 800 95 Bảng P4 Khả nồng độ ức chế tối thiểu chủng B subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum nấm TN F.oxysporum mẫu TN d0 (cm) d1 (cm) % ức chế ĐC 4,5 600 1,8 0,9 96 700 1,6 0,8 97 800 1,3 0,65 98 [...]... số các loại protein trên đã đƣợc công bố là có hoạt tính kháng nấm Chủng Pseudomonas Các chủng pseudomonas sinh tổng hợp nhiều chất đối kháng sinh trƣởng nấm khác nhau Nhiều chủng sinh tổng hợp các chất kháng sinh nhƣ phenazine, 2, 4- diacetylphloroglucinol, pyrrolnitrin, pyoluteorin, hoặc siderophore Chủng p syringae sinh tổng hợp syringomycin, syringostatin và syringotoxin, có hoạt tính kháng nấm. .. sạch có hoạt tính kháng nấm tƣơng đối mạnh và có khối lƣợng phân tử khoảng 21 kDa trên điện di đồ SDS-PAGE Protein kháng nấm này có hoạt tính ức chế mạnh sự sinh trƣởng và phát triển của nấm F oxysporum và R solani Protein tinh sạch từ chủng B subtilis XL62 có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với chủng nấm F oxysporum, hoạt tính kháng nấm này vẫn còn duy trì khi ủ ở 800C, thậm chí là 1000C trong 15 phút [2]... lập từ các mẫu vật khác nhau ở Việt Nam Thử khả năng đối kháng nấm F oxysporum và R solani của các chủng này đã đƣợc tiến hành Kết quả cho thấy, các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các chất ngoại bào với hoạt tính ức chế sinh trƣởng hay nảy mầm của bào tử nấm rất mạnh Nhƣ vậy, trên thị trƣờng Việt Nam, các loại sản phẩm sinh học phòng trừ bệnh nấm R solani và F oxysporum chủ yếu là các sản phẩm có. .. tâm nhiều hơn cả bởi tính phổ biến và thuận lợi trong tinh sạch Các chủng Bacillus có rất nhiều đặc tính tốt nhƣ: dễ nuôi cấy, phổ biến, sinh trƣởng nhanh trong môi trƣờng lỏng, cho nhiều bào tử và đặc biệt chúng có khả năng tổng hợp nhiều chất đối kháng sinh trƣởng nấm Các protein và peptide có khả năng kháng nấm đƣợc phân loại theo nhiều cách khác nhau, dựa vào cơ chế tác động có thể phân thành 3 loại... học chứa các chủng nấm đối kháng (chủ yếu là các chủng Trichoderma) hoặc vi khuẩn đối kháng (chứa B subtilis) Các chế phẩm thƣơng mại phần lớn chứa các chủng nấm đối kháng ở dạng phân bón Việc ứng dụng các vi sinh vật đối kháng nấm bệnh cây đã đƣợc thực hiện rất sớm ở Việt Nam và đạt đƣợc những thành tựu to lớn nhƣ sử dụng vi sinh vật đối kháng nấm nhƣ một sinh vật chức năng trong sản xuất phân bón hữu... đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8 để thu 20 phân đoạn protein mỗi phân đoạn 1 ml Protein tinh sạch Xác định hàm lƣợng protein - Thử hoạt tính kháng nấm F oxysporum và R solani - Kiểm tra điện di SDSPAGE của protein tinh sạch - Xác định hàm lƣợng protein - Đánh giá tính chất lí hóa của hoạt chất tinh sạch Hình 2.1 Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B subtilis AS 23 2.2.7 Xác định hàm lượng... chất đối kháng sinh trƣởng nấm Chất đối kháng sinh trƣởng nấm (Antifungal – compounds, AFC) là những chất có khả năng ức chế sự sinh trƣởng hoặc tiêu diệt sự phát triển của các loại nấm .Các chất này đã đƣợc ứng dụng để phòng và chữa trị các bệnh do nấm gây ra, đặc biệt là các loại nấm gây bệnh hại trên cây trồng nhƣ lạc, cà chua, đậu tƣơng, cây cà phê và nhiều loại cây khác Các protein và peptide có. .. [39], chất ức chế protease [27] Peptide kháng nấm đầu tiên đƣợc tách chiết từ chủng Bacillus là iturin và bacillomycin Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng và có khả năng kháng nấm và tan huyết [35] Bacillus cũng chính là đối tƣợng vi khuẩn đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất hiện nay, chủng này sinh tổng hợp rất nhiều các polypeptide có hoạt tính kháng nấm và có tiềm năng trong việc kiểm soát các. .. khác nhau về kích thƣớc, hình dạng phân tử lƣợng của protein có trong hỗn hợp Biogel P100 là một polyacrylamide trong đó phân tử của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang tạo thành sàng phân tử bởi hệ thống lỗ lƣới xốp Các phân đoạn có hoạt tính kháng nấm mạnh sau khi qua cột DEAE – celulose có hoạt tính kháng nấm mạnh tiếp tục đƣợc đƣa lên cột Biogel P100 Cột có kích thƣớc (2,6x60) cm đƣợc cân... bắp [5] Có thể sử dụng chế phẩm sinh học nấm đối ức chế Trichoderma viride để phòng trừ bệnh lở cổ rễ hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ bệnh cao 86% trên cây cà chua và 78% trên cây dƣa chuột trong điều kiện thí nghiệm chậu vại [1] Năm 2011 Đỗ Thị Tuyên và cộng sự đã tinh sạch đƣợc protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng B subtilis XL62 Các phân đoạn sau khi tinh sạch có hoạt tính kháng nấm tƣơng ... phát từ lý tình hình nghiên cứu Việt Nam, thực đề tài luận văn: "Tinh hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập Việt Nam" Mục tiêu đề tài - Tinh hợp chất thứ cấp có hoạt. .. Protein kháng nấm có hoạt tính ức chế mạnh sinh trƣởng phát triển nấm F oxysporum R solani Protein tinh từ chủng B subtilis XL62 có hoạt tính kháng nấm mạnh chủng nấm F oxysporum, hoạt tính kháng nấm. .. Năm 2011 Đỗ Thị Tuyên cộng tinh đƣợc protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng B subtilis XL62 Các phân đoạn sau tinh có hoạt tính kháng nấm tƣơng đối mạnh có khối lƣợng phân tử khoảng 21 kDa điện