Nghiên cứu phát hiện các hợp chất thứ cấp có tính kháng vi sinh vật kiểm định phân lập từ một số chủng xạ khuẩn biển thuộc chi stepptomyces (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - CAO ĐỨC TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN BIỂN THUỘC CHI STREPTOMYCES Chun ngành: Hóa hữu Mã số: 9.44.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ Hà Nội – 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Đoàn Thị Mai Hương Người hướng dẫn khoa học 2: TS Lê Thị Hồng Minh Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Các sản phẩm tự nhiên sử dụng làm thuốc chữa bệnh, chất gây nghiện hay chất độc từ trước lâu (Marderosian, 1969) Đến nay, hợp chất tự nhiên, hầu hết có nguồn gốc từ lục địa, nguồn đóng góp nhiều cho công nghiệp dược phẩm (Harvey, 2000) Mặc dù đại dương chiếm khoảng 70% diện tích bề mặt trái đất, đánh giá có độ đa dạng sinh học cao, song nghiên cứu hợp chất tự nhiên từ biển phát triển mạnh thời gian gần (Fattorusso, 2012) Đã có 30.000 hợp chất tự nhiên từ đại dương xác định với cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học đa dạng (Hu, 2011) Trong số đó, số hợp chất có cấu trúc tương đồng với hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ vi sinh vật Điều gợi ý vi sinh vật tham gia vào q trình sinh tổng hợp vi sinh vật nguồn sản xuất hợp chất (Molinski, 2009) Hơn nữa, nghiên cứu hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật biển có ưu điểm yêu cầu thu lượng mẫu tự nhiên nhỏ, từ tiến hành phân lập vi sinh vật sinh khối lượng lớn phòng thí nghiệm, giúp tạo lượng mẫu đủ lớn để thực nghiên cứu đặc điểm hố học hoạt tính sinh học Việt Nam nằm khu vực Thái Bình Dương với hệ sinh vật biển đa dạng phong phú, có tiềm to lớn tài ngun biển Chính phủ Việt Nam có định hướng phát triển kinh tế biển, khai thác tài nguyên thiên nhiên nghiên cứu sản phẩm tự nhiên từ biển (Nguyễn Phú Trọng, 2018) Bên cạnh đó, Việt Nam nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao giới, đặc biệt, số vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm có khả lây lan cao cộng đồng để lại hệ nặng nề sức khoẻ kinh tế (WHO, 2014) Vì vậy, việc tìm kiếm thuốc chữa bệnh nhiễm khuẩn, có nguồn gốc từ biển với hiệu cao hơn, giá thành rẻ quan trọng chủ động, tự sản xuất nước yêu cầu cấp thiết Từ lý trên, đề tài: “Nghiên cứu phát hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phân lập từ số chủng xạ khuẩn biển thuộc chi Streptomyces” lựa chọn, thực 2 Mục tiêu nghiên cứu luận án Phát hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) từ số chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Việt Nam, cụ thể là: - Phân lập, sàng lọc xác định số chủng xạ khuẩn có hoat tính kháng VSVKĐ có nguồn gốc từ biển Việt Nam - Phân lập, xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn tiềm khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ hợp chất thứ cấp phân lập được, làm sở khoa học cho việc định hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất có hoạt tính tốt chủng xạ khuẩn nghiên cứu cách hiệu Các nội dung nghiên cứu luận án Phân lập nuôi cấy số chủng xạ khuẩn biển Việt Nam từ trầm tích, hải miên số sinh vật biển khác; Thử hoạt tính kháng VSVKĐ cặn chiết chủng xạ khuẩn biển phân lập lựa chọn chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính tốt để định danh, lên men sinh khối lượng lớn; Phân lập hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn biển lên men sinh khối lượng lớn; Xác định cấu trúc hoá học hợp chất thứ cấp phân lập phương pháp vật lý, hóa học; Đánh giá hoạt tính sinh học kháng VSVKĐ hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng xạ khuẩn nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tài nguyên sinh vật biển 1.2 Xạ khuẩn (Actinomycetes) 1.2.1 Phân loại xạ khuẩn 1.2.2 Chi xạ khuẩn Streptomyces 1.2.3 Thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ chi Streptomyces 1.3 Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật từ chi Streptomyces biển 1.3.1 Các nghiên cứu giới 1.3.1.1 Streptomyces phân lập từ trầm tích biển 1.3.1.2 Streptomyces biển có nguồn gốc từ động vật thân mềm 1.3.1.3 Streptomyces biển có nguồn gốc khác 1.3.1.4 Một số hợp chất kháng vi sinh vật phát triển phương pháp khai thác gene xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (Genome mining) 1.3.2 Các nghiên cứu nước CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu hóa chất nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 2.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn biển từ mẫu sinh vật trầm tích biển (Williams, 1965; Williams, 1971; Vũ Thị Minh Đức, 2001) 2.2.3 Phương pháp làm xạ khuẩn lưu giữ giống sau phân lập ( Vũ Thị Minh Đức, 2001; Nguyễn Lân Dũng, 2003) 2.2.4 Phương pháp hoạt hóa nuôi cấy xạ khuẩn (Vũ Thị Minh Đức, 2001; Nguyễn Lân Dũng, 2003) 2.2.5 Phương pháp tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy xạ khuẩn (Carlson, 2014; Tanouye, 2015) 2.2.6 Phương pháp định danh xạ khuẩn (Holt, 1989; Sambrook, 1989; Weisburg, 1991; Li, 2007) 2.2.7 Phương pháp lên men xạ khuẩn (quy mô 50 L) (Basilio, 2003; Nguyễn Văn Cách, 2004) 2.2.8 Phương pháp phân lập hợp chất thứ cấp 2.2.9 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 2.2.10 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Hadacek, 2000) CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Kết thu mẫu Từ thiết bị phương pháp thu thập mẫu nêu, thu 23 mẫu biển bao gồm: - 09 mẫu thu nhận vùng biển Quảng Bình (2 mẫu trầm tích, mẫu rong, mẫu san hô mềm mẫu hải miên) - 14 mẫu thu nhận vùng biển Cù Lao Chàm, Quảng Nam (5 mẫu trầm tích, mẫu san hô mềm, mẫu hải miên, mẫu da gai, mẫu thỏ biển, mẫu đuôi rắn mẫu thân mềm) 3.2 Kết phân lập chủng xạ khuẩn Từ 23 mẫu biển thu nhận vùng biển Quảng Bình Cù Lao Chàm, Quảng Nam, 35 chủng xạ khuẩn có hình thái màu sắc khuẩn lạc khác phân lập 3.3 Kết thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn phân lập 35 chủng xạ khuẩn phân lập nuôi cấy lượng nhỏ (500 mL), tạo cặn chiết thử hoạt tính kháng VSVKĐ Kết (Bảng 4.1) cho thấy 24/35 chủng phân lập có tính kháng VSVKĐ, có 4/35 chủng có hoạt tính kháng từ chủng VSVKĐ trở lên Hai chủng G212 G278 (kháng chủng VSVKĐ), đại diện hai vùng biển nghiên cứu, lựa chọn để thực nghiên cứu 3.4 Kết định danh chủng xạ khuẩn G212 G278 3.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu 3.4.2 Định danh chủng nghiên cứu trình tự gene 16S rRNA 3.4.2.1 Tách DNA tổng số chủng nghiên cứu 3.4.2.2 Nhân gene 16S rRNA 3.4.2.3 Kết giải trình tự gene 16S rRNA Từ trình tự gene 16S rRNA hai chủng G212 G278, thực so sánh với liệu công bố ngân hàng gene, kết hợp với phát sinh chủng loại, cho thấy hai chủng G212 G278 có mối quan hệ gần gũi với chủng thuộc chi Streptomyces Trình tự gene 16S rRNA chủng G212 G278 đăng ký ngân hàng gene quốc tế với mã số tương ứng MF187963 MF960781 3.5 Kết sinh khối lượng lớn hai chủng xạ khuẩn G212 G278 Thực lên men lượng lớn quy mô 50L thu nhận 50L dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn G212 G278 3.6 Kết phân lập hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G212 3.6.1 Xử lý mẫu, tạo cặn chiết Đã tạo hai cặn chiết EtOAc (EG212) n-BuOH (BG212), từ dịch nuôi cấy (50L) chủng Streptomyces sp G212, với khối lượng tương ứng 2,2 g 21,4 g 3.6.2 Phân lập hợp chất thứ cấp từ cặn chiết chủng Streptomyces sp G212 3.6.2.1 Phân lập hợp chất thứ cấp từ cặn chiết EtOAc (EG212) Từ cặn chiết EG212 (2,2 g), phân lập 10 hợp chất G212-1 (5 mg), G212-2 (6 mg), G212-3 (5 mg), G212-4 (7 mg), G212-5 (12 mg), G212-6 (7 mg), G212-7 (6 mg), G212-8 (8 mg), G212-9 (8 mg) G21210 (6 mg) 3.6.2.2 Phân lập hợp chất thứ cấp từ cặn chiết n-BuOH (BG212) Từ cặn chiết BG212 (21,4 g), phân lập hợp chất G212-11 (7 mg), G212-12 (13 mg), G212-13 (5 mg), G212-14 (6 mg), G212-15 (10 mg) G212-16 (5 mg) 3.6.3 Hằng số vật lí liệu phổ hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng Streptomyces sp G212 3.6.4 Tổng hợp hợp chất G212-2 G212-3 Để khẳng định cấu trúc hóa học hợp chất 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate (G212-2) 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3), chúng tơi tổng hợp tồn phần hợp chất từ hai hợp chất thương mại tương ứng 2,4-dichlorobenzoyl chloride 2,3dimethoxybenzoic acid 3.6.4.1 Tổng hợp hợp chất 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate (G2122 TH) 3.6.4.2 Tổng hợp hợp chất 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) đồng phân G212-6’ 3.7 Kết phân lập hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G278 3.7.1 Xử lý mẫu, tạo cặn chiết Đã tạo hai cặn chiết EtOAc (EG278) n-BuOH (BG278), từ dịch nuôi cấy (50L) chủng Streptomyces sp G278, với khối lượng tương ứng 3,26 g 22,4 g 3.7.2 Phân lập hợp chất thứ cấp từ cặn chiết chủng Streptomyces sp G278 3.7.2.1 Phân lập hợp chất thứ cấp từ cặn chiết EtOAc (EG278) Từ cặn chiết EG278 (3,26 g), phân lập hợp chất (Hình 3.13) G278-1 (6 mg), G278-2 (7 mg), G278-3 (5 mg), G278-4 (10 mg), G2785 (6 mg), G278-6 (6 mg) 3.7.2.2 Phân lập chất thứ cấp từ cặn chiết n-BuOH (BG278) Từ cặn chiết BG278 (22,4 g), phân lập 10 hợp chất (Hình 3.14) G278-7 (7 mg), G278-8 (6 mg), G278-9 (5 mg), G278-10 (8 mg), G27811 (6 mg), G278-12 (20 mg), G278-13 (6 mg), G278-14 (10 mg), G278-15 (8,5 mg), G278-16 (5 mg) 3.7.3 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ chủng Streptomyces sp G278 3.8 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập (Xem Bảng 4.33 Bảng 4.34) CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1 Kết thu mẫu Tổng số 23 mẫu thu thập bao gồm: mẫu thu nhận Quảng Bình 14 mẫu thu nhận Cù Lao Chàm, Quảng Nam Số lượng mẫu vùng khác khác nhau, tương ứng với đa dạng loại sinh vật biển khác đợt thu mẫu để thực luận án 4.2 Kết phân lập chủng xạ khuẩn Từ mẫu thu nhận khu vực biển Quảng Bình 14 mẫu thu nhận vùng biển Cù Lao Chàm, Quảng Nam có tương ứng 15 20 chủng xạ khuẩn phân lập 4.3 Kết thử hoạt tính sinh học chủng thu Kết thử hoạt tính kháng VSVKĐ cặn chiết thô dịch nuôi cấy 35 chủng XK (Bảng 4.1) cho thấy 24/35 (68,6 %) chủng có hoạt tính kháng VSVKĐ, có 4/35 (11,4 %) chủng có hoạt tính kháng từ chủng VSVKĐ trở lên; 11/35 (31,4 %) chủng phân lập kháng nấm kiểm định mạnh (MIC – 64 µg/mL) Ngồi ra, có 15/35 (42,8%) chủng thể hoạt tính kháng VSVKĐ Gram dương có 6/35 (17,1%) chủng thể hoạt tính kháng VSVKĐ Gram âm Bảng 4.1 Giá trị MIC (µg/mL) chủng xạ khuẩn biển phân lập (* Chỉ thể kết chủng có hoạt tính kháng VSVKĐ) TT 9 10 11 12 13 14 15 Chủng (*) Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/mL) Gram dương Gram âm Nấm E faecalis S aureus B cereus E coli P aeruginosa S enterica C.albicans ATCC29212 ATCC25923 ATCC14579 ATCC25922 ATCC27853 ATCC13076 ATCC10231 15 chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Quảng Bình G183 128 G193 64 G196 64 G197 128 G202 128 G207 128 G212 128 128 64 256 256 G214 128 G216 256 20 chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Cù Lao Chàm – Quảng Nam G274 256 G275 G276 256 G277 256 G278 256 32 16 16 G280 256 256 16 32 32 G283 128 G284 256 256 G285 32 G288 32 G289 32 G290 32 16 16 G291 128 G292 32 G293 256 S 256 256 128 32 256 128 C 32 (S: Streptomycine; C: Cyclohexamide; (-): giá trị MIC > 256 µg/mL) 4.4 Kết định danh chủng xạ khuẩn G212, G278 Trình tự đoạn gene 16S rRNA chủng G212 có độ tương đồng (99,57%) so với chủng Streptomyces caelestis JS-5 (mã số EU124773) (99,64%) so với chủng Streptomyces caelestis JS-4 (mã số EU124772) Trình tự đoạn gene 16S rRNA chủng G278 có độ tương đồng (99,86%) so với chủng Streptomyces sp R1 (mã số MK757961) 4.5 Kết sinh khối lượng lớn chủng xạ khuẩn G212 G278 Đã lên men thành công lượng lớn (50 L) cho chủng G212 G278 để tiếp tục nghiên cứu 4.6 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G212 Từ dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật Streptomyces sp G212, phân lập xác định cấu trúc 16 hợp chất (Hình 4.31) có chất (G212-2 G212-3) chất lần đầu phân lập từ tự nhiên (G212-1): hợp chất polyethylene terephthalate ethylene terephthalate cyclic trimer (G212-1), dẫn xuất dichlorophenyl 2,4-dichlorophenyl 2,4dichlorobenzoate (G212-2), dẫn xuất phthalite 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3), hợp chất kháng sinh germicidine A (G212-4), germicidine B (G212-5), dẫn xuất benzopyridine 3,4-dihydroxy-6,7dimethyl-quinolin-2-carboxylic (G212-9), hợp chất cyclopeptide cyclo(Pro-Val) (G212-10), cyclo-(Pro-Tyr) (G212-11), cyclo-(Leu-trans-4hydroxy-Pro) (G212-12), dẫn xuất nucleic acid 2’-deoxythymidine (G212-7), 2’-deoxyuridine (G212-8), hợp chất indol N-[2-(1H-indol-3yl)-2-oxo-ethyl] acetamide (G212-13), indole-3-carboxylic acid (G212-14) hợp chất 5-hydroxymethyl-4-hydroxy-2,4-dimethyl-2cyclopentenone (G212-6), 1H-pyrrole-2-carboxylic acid (G212-15), 2phenylacetic acid (G212-16) Cấu trúc hóa học hợp chất (G212-2 G212-3) khẳng định phương pháp tổng hợp tồn phần Dưới trình bày tóm tắt phương pháp xác định cấu trúc hợp chất G212-1, G212-2 G212-3 11 3); 8,11 (dd, J = 8,5 Hz, H-6), vòng B: H 7,23 (d, J = 8,5 Hz, H-6'); 7,32 (dd, J = 2,5; 8,5 Hz, H-5'); 7,50 (d, J = 2,5 Hz, H-3')] Phân tích phổ 13CNMR với trợ giúp phổ HSQC hợp chất G212-2 có mặt 13 nguyên tử carbon, bao gồm nhóm carbonyl C 161,7; sáu nhóm methine sp2 C 124,6 (C-5'), 127,3 (C-6), 128,1 (C-6'), 130,3 (C3'), 131,5 (C-3), 133,3 (C-5) carbon không liên kết trực tiếp với hydro C 126,4 (C-1), 127,9 (C-2'), 132,4 (C-4'), 136,2 (C-4), 139,7 (C-2), 145,5 (C-1') Bảng 4.3 Dữ liệu NMR hợp chất G212-2 hợp chất tổng hợp G212-2 G212-2 TH C a,b a,c a,b,# δH độ bội (J, Hz) δC δH độ bội (J, Hz) 126,4 139,7 7,57 d (2,5) 131,5 7,56 d (2.0) 136,2 7,40 dd (2,0; 8,5) 133,3 7,39 dd (2,0; 8,5) 8,11 d (8,5) 127,3 8,11 d (8,5) 161,7 1' 145,5 2' 127,9 3' 7,50 d (2,5) 130,3 7,50 d (2.5) 4' 132,4 124,6 5' 7,32 dd (2,5; 8,5) 7,31 dd (2,5; 8,5) 6' 7,23 d (8,5) 128,1 7,23 d (8,5) a CDCl3, b 500 MHZ, c 125 MHz, #H G212-2 TH Phổ COSY G212-2 cho phép xác định hệ tương tác spin-spin: H5/H-6 H-5'/H-6' (Hình 4.10) Các mảnh cấu trúc sau kết nối nhờ phân tích phổ HMBC Trên phổ HMBC hợp chất G212-2 cho thấy tương tác H-5 (H 7,40) với C-3 (C 131,5), C-1 (C 126,4); tương tác H3 (H 7,57) với C-1 (C 126,4), C-2 (C 139,7), C-4 (C 136,2); H-6 (H 8,11) với C-2 (C 139,7), C-4 (C 136,2) xác nhận cấu trúc vòng A bị vị trí Tương tác HMBC H-3' (H 7,50) với C-1' (C 145,5), C-2' (C 127,9), C-4' (C 132,4); H-5' với C-1' (C 145,5), C-3' (C 130,3), C-4' (C 132,4); H-6' với C-1' (C 145,5), C-2' (C 127,9), C-4' (C 132,4) xác nhận cấu trúc vòng B Trên phổ HMBC (Hình 4.10) xuất tương tác 12 xa proton H-6 (H 8,11) với carbon carbonyl (C 161,7) khẳng định liên kết nhóm carbonyl với vòng A Độ chuyển dịch hóa học C-1' (C 145,5) gợi ý liên kết carbon với nguyên tử oxy Dựa vào CTPT C13H6Cl4O2 liệu phổ 2D-NMR, cấu trúc G212-2 xác định 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate Tuy nhiên, liên kết este vòng A vòng B chưa khẳng định rõ ràng phổ HMBC nên cấu trúc hợp chất G212-2 khẳng định lại phản ứng tổng hợp 2,4-dichloro-benzoyl chloride 2,4-dichlorophenol (Hình 4.11) Phản ứng thực oC đến nhiệt độ phòng với có mặt Et3N Phổ H NMR sản phẩm tổng hợp (G212-2 TH) giống hệt với hợp chất tách từ tự nhiên G212-2 (Bảng 4.3) Như hợp chất G212-2 xác định 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate hợp chất Hình 4.10 Một số tương tác phổ COSY HMBC G212-2 Hình 4.11 Phản ứng tổng hợp tạo thành G212-2 TH 4.6.3 Hợp chất 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) Hợp chất G212-3 phân lập dạng chất rắn màu trắng Phổ khối phân giải cao G212-3 xuất pic ion giả phân tử m/z 181,0496 [M+H]+, tính tốn lý thuyết cho CTPT C9H9O4, 181,0501 Kết hợp với liệu phổ 13C-NMR cho phép xác định CTPT G212-3 C9H8O4 Phổ hồng ngoại G212-3 có đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxy (νmax 3475 cm-1) nhóm chức carbonyl (νmax 1717 cm-1) Trên phổ chiều (1H-NMR 13C-NMR) G212-3 xuất tín hiệu nhóm methyl (H 2,38, C 16,0), nhóm methylene (H 5,13, C 66,7), nhóm methin sp2 (H 6,72, C 118,4), carbon vòng thơm khơng 13 liên kết trực tiếp với hydro (C 113,5, 130,1, 134,7, 137,1 150,6) nhóm carbonyl (C 170,9) Độ chuyển dịch hóa học carbon C-3 (C 66,7), C-4 (C 137,1) C-5 (C 150,6) cho phép dự kiến carbon gắn trực tiếp với nguyên tử oxy Trên phổ HMBC G212-3 (Hình 4.16) cho thấy tương tác xa H-6 (H 6,72) với C-4 (C 137,1), C-5 (C 150,6), C-7 (C 130,1), C-7a (C 113,5) C-8 (C 16,0) Tương tác proton nhóm methyl CH3-8 (H 2,38) với C-6 (C 118,4), C-7 (C 130,1), C-7a (C 113,5) cho phép xác định vòng A hợp chất G212-3 nhóm methyl CH3-8 gắn với vòng A vị trí C-7 Tương tác proton nhóm methylene CH2-3 (H 5,13) với carbon C=O (C 170,9), C-4 (C 137,1), C-3a (C 134,7), C-7a(C 113,5), C-7 (C 130,1) cho phép xác định vòng lactone B Từ liệu phổ HMBC cho phép xác định dẫn xuất phthalite Tuy nhiên, trình bày trên, phổ HMBC hợp chất G212-3 cho thấy proton nhóm CH2-3 (H 5,13) tương tác với carbon C-4 (C 137,1) C-7 (C 130,1) nên có khả cấu trúc hợp chất vòng lactone B (Hình 4.12) Hình 4.12 Hai khả cấu trúc G212-3 Hình 4.16 Một số tương tác phổ HMBC G212-3 Bảng 4.4 Dữ liệu NMR G212-3 hợp chất tổng hợp (G212-3 TH) G212-3 G212-3 TH C a,b a,c a,b,# δH độ bội (J, Hz) δC δH độ bội (J, Hz) 170,9 5,13 s 66,7 5,13 s 3a 134,7 14 C 7a a δHa,b G212-3 độ bội (J, Hz) 6,72 s 2,38 s DMSO-d6, b 500 MHZ, δC 137,1 150,6 118,4 130,1 113,5 16,0 δH a,c c 125 MHz, G212-3 TH bội (J, Hz) a,b,# độ 6,72 s 2,38 s # H hợp chất G212-3 TH Để khẳng định cấu trúc hợp chất phân lập để có thêm chất phục vụ cho việc thử hoạt tính sinh học, chúng tơi tiến hành tổng hợp tồn phần hợp chất G212-3 đồng phân G212-6′ Quy trình tổng hợp trình bày Hình 4.17 từ hợp chất thương mại 2,3dimethoxy benzoic acid qua bước Ngồi để phân biệt xác cấu trúc đồng phân G212-4′ G212-5′, hợp chất G212-4′ tổng hợp qua bước từ hợp chất halogen hóa G212-1′ (a) HCHO, HCl đặc, 60-70 oC, 80%; (b) LiAlH4, THF, 72%; (c) i, KMnO4, NaOH, H2O; ii, Ac2O, 55% bước; (d) LiAlH4, THF, 77%; (e) H2, Pd/C, THF, 97%; (f) BBr3, CH2Cl2, oC - RT, 89%; (g) BBr3, CH2Cl2, 0oC-RT, 87% Hình 4.17 Sơ đồ tổng hợp G212-3 TH đồng phân G212-6′ 15 Tổng hợp (G212-1′) 4-(chloromethyl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one Hợp chất thương mại 2,3-dimethoxy benzoic acid biến đổi thành dẫn xuất phthalide G212-1′ với việc sử dụng HCl đặc paraformaldehhyde nhiệt độ 60-70 oC với hiệu suất thu 80% (Bhattacharjee, 1980) Trên phổ 1H-NMR 13C-NMR G212-1′ cho tín hiệu nhóm carbonyl C 168,1, nhóm methine (C 119,8, H 7,20), nhóm methoxy (C 57,1; 62,5, H 3,93; 4,11), nhóm methylene carbon khơng liên kết trực tiếp với hydro Từ liệu phổ cho phép xác định hợp chất thu dẫn xuất phthalide G212-1′ Tổng hợp 3,4-dimethoxy-6-methyl-1,2-phenylene dimethanol (G212-2′): Hợp chất G212-1′ sau khử thành ancol G212-2′ sử dụng LiAlH4 dung môi THF cho hiệu suất 72% (Ying, 2011) So với hợp chất G212-1′, phổ 1H-NMR 13C-NMR G212-2′ thấy tín hiệu nhóm carbonyl xuất thêm tín hiệu nhóm methyl C 19,6, H 2,39 Từ liệu phổ cho phép xác định hợp chất G212-2′ mở vòng lactone tạo alcol Tổng hợp 4,5-dimethoxy-7-methylisobenzofuran-1,3-dione (G212-3′) Q trình oxy hóa đóng vòng hợp chất G212-2′ qua bước, cho G212-2′ tác dụng với KMnO4 cho sản phẩm acid, sau sản phẩm acid thô đun hồi lưu với mL Ac2O vòng 30 phút cho hợp chất phthalic anhydride G212-3′ với hiệu suất đạt 55% So với hợp chất G212- 16 2′, phổ 1H-NMR 13C-NMR G212-3′ thấy tín hiệu nhóm methylene, thay vào tín hiệu nhóm carbonyl C 162,6 160,9 Từ liệu phổ cho phép xác định cấu trúc hợp chất G212-3′ Tổng hợp hợp chất G212-4′ G212-5′ Hợp chất G212-3′ khử hóa với LiAlH4 cho hỗn hợp đồng phân G212-4′ G212-5′ với tỉ lệ 1:2 Hai đồng phân phân tách dễ dàng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/ EtOAc gradient Trên phổ NMR hợp chất G212-4′ G212-5′ cho tín hiệu nhóm methyl, nhóm carbonyl, nhóm methin, nhóm methoxy carbon khơng liên kết trực tiếp với hydro Phổ HMBC chất G212-5′ (Hình 4.19) cho tương tác proton nhóm methyl 10 với carbon C-7a, carbon gắn trực tiếp với nhóm carbonyl C 116.1, cho phép dự đoán cấu trúc chất G212-5′, nhiên nhìn thấy tương tác với C-3a C-4 Do đó, để phân biệt xác cấu trúc đồng phân G212-4′ G2125′, hợp chất G212-4′ tổng hợp qua bước từ hợp chất halogen hóa G212-1′ thơng qua q trình hydro hóa có sử dụng xúc tác Pd/C Sau so sánh liệu phổ NMR hợp chất G212-4′ tổng hợp từ hợp chất halogen hóa G212-1′ với liệu phổ đồng phân G212-4′ G212-5′ tổng hợp từ hợp chất G212-3′ (Bảng 4.5), chúng tơi xác định xác cấu trúc đồng phân G212-4′ G212-5′ Hình 4.19 Một số tương tác phổ HMBC G212-5′ 17 C 3a 7a 10 Bảng 4.5 Dữ liệu NMR hợp chất G212-4′ G212-5′ G212-4′ G212-5′ G212-4′ tổng hợp từ tổng hợp từ G212-3′ G212-1′ a,b δHa,b δ δHa,b H δCa,c δCa,c độ bội (J, Hz) độ bội (J, Hz) độ bội (J, Hz) 169,0 170,8 5,12 s 68,0 5,12 s 5,24 66,7 137,8 138,8 120,6 140,7 7,02 s 117,6 7,02 s 156,0 152,5 6,81 s 116,1 146,5 136,0 126,8 115,3 4,05 s 62,3 4,05 s 3,90 s 56,3 3,90 s 57,0 3,90 s 3,95 s 60,4 2,26 s 17,2 2,26 s 2,63 17,1 a CDCl3, b 500 MHz, c 125 MHz Tổng hợp hợp chất G212-3 G212-6′ Cuối cùng, cho hợp chất G212-4′ G212-5′ phản ứng với BBr3 thu hợp chất G212-3 tổng hợp (G212-3 TH) G212-6′ với hiệu suất từ 87-89 % So sánh liệu phổ hợp chất tách từ tự nhiên G212-3 với hợp chất tổng hợp G212-3 TH thấy liệu phổ trùng khớp, hợp chất G212-3 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide Hợp chất G212-3 đồng phân tổng hợp G212-6′ hợp chất 18 Bảng 4.6 Dữ liệu NMR hợp chất G212-3 TH G212-6′ G212-3 TH G212-6′ C a,b a,c a,b δH độ bội (J, Hz) δC δH độ bội (J, Hz) δCa,c 170,9 169,8 5,13 s 66,7 5,11 s 68,1 3a 134,7 136,4 137,1 123,1 150,6 6,92 s 121,8 6,72 s 113,5 142,7 118,4 145,3 7a 111,5 111,5 2,38 16,0 2,08 s 16,4 OH-6 9,32 s OH-7 9,67 s a DMSO-d6, b 500 MHZ, c 125 MHz 4.7 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G278 Hình 4.49 Các hợp chất phân lập từ chủng G278 19 Từ dịch ngoại bào chủng vi sinh vật Streptomyces sp G278, phân lập xác định cấu trúc 16 hợp chất (Hình 4.49), có hợp chất cyclodipeptide cyclo-(Pro-Gly) (G278-1), cyclo-(Pro-Leu) (G278-2), cyclo-(Pro-Phe) (G278-3), cyclo (Pro-Tyr) (G278-4), cyclo-(Leu-Tyr) (G278-5), cyclo-(Pro-Trp) (G278-6), hợp chất indol 1H-indole-3ethanol (G278-7) hợp chất coumarin scopoletin (G278-8), hợp chất nucleoside adenosine (G278-11), hợp chất dioxan 2-((-5-methyl-1,4dioxan-2-yl)methoxy)ethanol (G278-12) hợp chất phenolic khác benzyl salicylate (G278-9), N-phenylnaphthalen-2-amine (G278-10), N-(4hydroxyphenylethyl)acetamide (G278-13), 2,4-dichlorophenyl 2,4dichlorobenzoate (G278-14), 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15), 3-hydroxyl-2-methylpyridine (G278-16) Trong có hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên G278-15 G278-16 Dưới trình bày tóm tắt phương pháp xác định cấu trúc hợp chất G278-15 G278-16 4.7.15 Hợp chất 2,5-Bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15) Hợp chất G278-15 phân lập dạng chất rắn màu trắng Phổ khối phân giải cao G278-15 thể pic ion giả phân tử m/z 431,1785 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho CTPT C26H27N2O2S, m/z: 431,1793), kết hợp với liệu phổ 13C-NMR cho CTPT C26H26N2O2S, tương ứng với độ bội 15 Phổ hồng ngoại hợp chất G278-15 tín hiệu dao động nhóm chức C=N (1635, 1581 cm-1) C-O (1266, 1195 cm-1) Thêm vào đó, có mặt nguyên tử lưu huỳnh cấu trúc hợp chất G27815 củng cố tín hiệu dao động hấp thụ hồng ngoại C-S νmax 715 cm-1 Trên phổ 1H-NMR xuất tín hiệu hệ ABX δH 7,54 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-5), 7,72 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-4), 7,81 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), proton thơm singlet 8,06 (1H, s, H-3′) nhóm methyl δH 1,37 (9H, s, x CH3) Phổ 13C-NMR and DEPT cho tín hiệu 13 nguyên tử carbon tương ứng với nhóm methyl, nhóm methin sp2 carbon khơng liên kết trực tiếp với hydro Phân tích tín hiệu tương tác từ phổ HMBC (Hình 4.38) cho phép xác định liên kết nhóm tert-butyl C-6 vòng thơm ABX thơng qua tương tác proton thuộc nhóm methyl δH 1,37 với C-6 (δC 148,3) C- 20 (δC 34,8) Thêm vào đó, tương tác HMBC proton H-3′ (δH 8,06) với C-2 (δC 157,5) C-2′ (δC 132,4), cho phép xác định liên kết chuỗi carbon C-3′/C-2′/C-2 Độ chuyển dịch hóa học C-7a (δC 148,6) and C-3a (δC 141,3), C-2 (δC 157,5) gợi ý liên kết carbon với nguyên tử oxy nitơ Các liệu phổ MS, NMR gợi ý cấu trúc G278-15 có cấu trúc đối xứng với đơn vị cấu trúc C13H13NO kết nối với thông qua liên kết C-3–C-3′ C-2′–S–C-2′′ Bảng 4.31 Dữ liệu phổ NMR hợp chất G278-15 G278-15 C a,b δH độ bội (J, Hz) δCa,c 157,5 3a 141,3 7,72 d (8,0) 110,3 7,54 dd (2,0; 8,0) 123,9 148,3 7,81 d (2,0) 116,3 7a 148,6 34,8 1,37 s 31,5 2′ 132,4 3′ 8,06 s 131,3 a DMSO-d6, b 500 MHZ, c 125 MHz Hình 4.38 Một số tương tác phổ HMBC G278-15 Kết hợp với liệu phân tích từ phổ, HR-ESI-MS, 2D-NMR khẳng định hợp chất G278-15 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene Hợp chất tổng hợp trước sử dụng làm tác nhân phát quang, nhiên báo cáo hợp chất phân lập từ tự nhiên (Li, 2008) 4.7.16 Hợp chất 3-hydroxy-2-methylpyridine (G278-16) 21 Hợp chất G278-16 phân lập dạng chất rắn màu trắng Phổ khối phân giải cao G278-16 cho pic ion giả phân tử m/z 110,0609 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho CTPT C6H8NO, m/z: 110.0606), kết hợp với liệu phổ 13C NMR cho CTPT C6H7NO Trên phổ 1H-NMR, xuất tín hiệu proton aromatic δH 7.01 (1H, dd, J = 5.0, 8.0 Hz, H-5), 7.09 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 7.86 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-6) nhóm methyl δH 2.30 (3H, s, H-7) Phổ 13C-NMR and DEPT có mặt nguyên tử carbon có nhóm methyl, nhóm methin sp2, carbon khơng liên kết trực tiếp với hydro δC 147.7 (C-2) and 154.0 (C-3) Độ chuyển dịch hóa học C-2, C-6 C-3 cho phép xác định chúng gắn trực tiếp với nguyên tử nitơ oxy Trên phổ HMBC (Hình 4.48) cho thấy tương tác xa H-6 với C-2, C-4 C-5 tương tác gữa H-4 với C-2 C-6 cho phép xác định có mặt vòng pyridine Đồng thời tương tác proton nhóm CH3 với C-2 C-3; tương tác H-5 với C-3 cho phép xác định nhóm OH gắn vị trí C-3 nhóm CH3 gắn với carbon C-2 Kết hợp liệu phổ 2DNMR, HR-MS cho phép xác định hợp chất G278-16 3-hydroxyl-2methylpyridine Đây hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên, hợp chất tổng hợp vào năm 2008 (Jida, 2008) Bảng 4.32 Dữ liệu NMR hợp chất G278-16 hợp chất tham khảo G278-16 3-hydroxy-2-methylpyridine C a,c a,d δH độ bội (J, Hz) δC δH b,e# độ bội (J, Hz) δC b,f# 147,7 144,7 154,0 146,3 7,09 d (8,0) 122,6 7,15 dd (1,2; 8,4) 122,3 7,01 dd (5,0; 8,0) 123,2 7,06 dd (4,7; 8,4) 122,4 7,86 d (5,0) 139,3 8,05 dd (1,2; 4,7) 139,7 2,30 s 18,4 2,53 m 18,4 a CD3OD, b CDCl3, c 500 MHZ, d 125 MHz, e 300 MHZ, f 63 MHz, #H hợp chất tham khảo (Jida and Ollivier, 2008) Hình 4.48 Một số tương tác phổ HMBC G278-16 22 4.8 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất phân lập Các hợp chất phân lập hợp chất tổng hợp thử nghiệm hoạt tính kháng VSVKĐ Kết cho thấy 20/30 hợp chất phân lập hợp chất tổng hợp có hoạt tính kháng VSVKĐ (Bảng 4.33 Bảng 4.34) Bảng 4.33 Bảng 4.34 Giá trị MIC (µg/mL) hợp chất tự nhiên tổng hợp (*Chỉ thể chất có hoạt tính kháng VSVKĐ) T T Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/mL) Gram dương Gram âm Chất (*) E faecalis S aureus B cereus E coli P aeruginosa S enterica Nấm C.albicans ATCC29212 ATCC25923 ATCC14579 ATCC25922 ATCC27853 ATCC13076 ATCC10231 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 G212-1 G212-2 G278-14 G212-3 G212-4 G212-5 G212-6 G212-7 G212-8 G212-9 G212-15 G212-16 G278-5 G278-6 G278-8 G278-9 G278-10 G278-12 G278-15 G278-16 Các hợp chất phân lập từ chủng G212 G278 64 64 16 64 32 32 16 128 64 256 128 32 64 256 - 256 - 128 128 64 32 128 64 64 128 32 64 32 32 32 256 32 32 128 64 256 256 128 256 64 Các hợp chất tổng hợp 64 128 128 128 64 128 64 32 64 256 128 32 - - - - 64 32 - 256 64 64 128 32 64 64 256 128 64 64 32 32 128 64 64 G212-4' 64 64 128 G212-5' 32 128 G212-6' 128 32 32 S 256 256 128 C 32 (S: Streptomycine; C: Cyclohexamide; (-): giá trị MIC > 256 µg/mL) 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Luận án thu kết sau: Từ 23 mẫu thu thập hai vùng biển Quảng Bình Cù Lao Chàm – Quảng Nam phân lập, nuôi cấy lưu giữ 35 chủng xạ khuẩn biển Đã đánh giá hoạt tính kháng VSVKĐ 35 chủng phân lập, có 24/35 chủng (68,6 %) có hoạt tính kháng VSVKĐ, bao gồm 4/35 chủng (11,4 %) có hoạt tính kháng từ chủng VSVKĐ trở lên Đã tuyển chọn hai chủng xạ khuẩn G212 G278 có hoạt tính kháng VSVKĐ cao phổ rộng, kháng 5/7 chủng VSV thử nghiệm Định danh chủng thuộc chi Streptomyces Trình tự gene 16S rRNA chủng G212 G278 đăng ký sở liệu GenBank với mã số tương ứng MF187963 MF960781 Đã tiến hành nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hóa học 32 hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn G212 G278 (gồm 30 hợp chất khác nhau) Trong có hợp chất 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate (G212-2), 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) hợp chất lần phân lập từ tự nhiên ethylene terephthalate cyclic trimer (G2121), 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15) 3-hydroxy2-methylpyridine (G278-16) Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ chủng G212 G212-2 G212-3 khẳng định phương pháp tổng hợp tồn phần Trong q trình tổng hợp, tổng hợp thêm hợp chất dẫn xuất hợp chất G212-3 Cấu trúc hóa học hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên G212-1 khẳng định phương pháp X-ray Các hợp chất phân lập được khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ có 19/30 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ Ba analog hợp chất G212-3 tổng hợp thể hoạt tính kháng VSVKĐ thử nghiệm Đồng phân tổng hợp G212-6’ thể hoạt tính tốt chủng nấm C albicans chủng Gram âm P aeruginosa với giá trị MIC = 32 µg/ml, đồng phân phân lập từ tự nhiên G212-3 khơng thể hoạt tính chủng nấm C albicans 24 KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục có nghiên cứu sâu hoạt tính sinh học khác số hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ tốt nhằm hướng đến khả ứng dụng tương lai Cần tiếp tục nghiên cứu chủng xạ khuẩn phân lập nhằm tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học mà khn khổ luận án chưa có điều kiện nghiên cứu Đồng thời mở rộng hướng nghiên cứu vùng biển khác nhằm phát chủng VSV biển có khả sản sinh hợp chất có hoạt tính sinh học cao NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đã phân lập xác định hoạt tính kháng VSVKĐ 35 chủng xạ khuẩn từ 23 mẫu biển thu nhận vùng biển: Quảng Bình Cù Lao Chàm, Quảng Nam Trong đó, 24/35 chủng (68,6 %) có hoạt tính kháng VSVKĐ, bao gồm 4/35 chủng (11,4 %) có hoạt tính kháng từ chủng VSVKĐ trở lên Đã tuyển chọn hai chủng xạ khuẩn G212 G278 có hoạt tính kháng VSVKĐ cao phổ rộng, kháng 5/7 VSV thử nghiệm Định danh chủng thuộc chi Streptomyces Trình tự gene 16S rRNA chủng G212 G278 đăng ký sở liệu GenBank với mã số tương ứng MF187963 MF960781 Đã tiến hành nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hóa học 32 hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn G212 G278 (gồm 30 hợp chất khác nhau) Trong có hợp chất 2,4-dichlorophenyl 2,4dichlorobenzoate (G212-2), 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) chất lần phân lập từ tự nhiên ethylene terephthalate cyclic trimer (G212-1), 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15) 3-hydroxy-2-methylpyridine (G278-16) Trong trình tổng hợp để khẳng định cấu trúc hợp chất G212-3, tổng hợp hợp chất dẫn xuất hợp chất G212-3 Đã khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ 30 hợp chất phân lập từ dịch nuôi cấy XK hợp chất tổng hợp có 19/30 hợp chất tự nhiên hợp chất tổng hợp thể hoạt tính kháng VSVKĐ 25 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Duc-Tuan Cao, Thuy-Linh Nguyen, Van-Hieu Tran, Huong Doan-ThiMai, Quyen Vu-Thi, Mai-Anh Nguyen, Hong-Minh Le-Thi, Van-Minh Chau and Van-Cuong Pham, Synthesis, Structure and Antimicrobial Activity of Novel Metabolites from a Marine Actinomycete in Vietnam’s East Sea, 2019 Natural Product Communication, 14 (1): 121-124 Duc Tuan Cao, Van Hieu Tran, Van Nam Vu, Huong Doan Thi Mai, Thi Hong Minh Le, Thi Quyen Vu, Hung Huy Nguyen, Van Minh Chau, Van Cuong Pham, Antimicrobial Metabolites from a Marine-Derived Actinomycete Streptomyces sp G278, 2019 Natural Product Research, 33:22, 3223-3230 Cao Duc Tuan, Le Thi Hong Minh, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Doan Thi Mai Huong, Chau Van Minh, Pham Van Cuong, Identification and Antimicrobial Activity of Actinomycetes Strains isolated from samples collected in the coastal area Hue, Da Nang and Quang Nam Provinces, Vietnam, 2017 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15 (4): 737-744 Cao Duc Tuan, Vu Van Nam, Tran Van Hieu, Doan Thi Mai Huong, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Le Thi Hong Minh, Brian T Murphy, Nguyen Quoc Vuong, Pham Van Cuong, Secondary metabolites from marine actinomycete Streptomyces sp G212, 2017 Tạp chí Hóa học, 55 (6e): 8589 Cao Duc Tuan, Tran Van Hieu, Doan Thi Mai Huong, Le Thi Hong Minh, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Brian Murphy, Nguyen Quoc Vuong, Pham Van Cuong, Secondary metabolites produced by marine actinomycette Streptomyces sp G278 2017, Tạp chí Hóa học, 55 (6e): 145-149 Cao Duc Danh, Cao Duc Tuan, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Doan Thi Mai Huong, Pham Van Cuong, Chau Van Minh, Le Thi Hong Minh, Identification and antimicrobial activity of actinomycetes strains isolated from marine samples in the coastal area of Thanh Hoa – Quang Binh – Quang Tri, 2018 Vietnam Journal of Science and Technology, 56 (4): 424433 ... tiêu nghiên cứu luận án Phát hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) từ số chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Vi t Nam, cụ thể là: - Phân lập, sàng lọc xác định số chủng. .. sản xuất nước yêu cầu cấp thiết Từ lý trên, đề tài: Nghiên cứu phát hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phân lập từ số chủng xạ khuẩn biển thuộc chi Streptomyces” lựa chọn,... chủng xạ khuẩn có hoat tính kháng VSVKĐ có nguồn gốc từ biển Vi t Nam - Phân lập, xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn tiềm khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ hợp chất thứ