Phân lập, lựa chọn các chủng nấm có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, gây độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa nội sinh trên cây họ thông pinaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA NỘI SINH TRÊN CÂY HỌ THÔNG PINACEAE Hà Nội – 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA NỘI SINH TRÊN CÂY HỌ THÔNG PINACEAE Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Lê Mai Hương Sinh viên thực hiện: Dương Thị Thanh Thủy Lớp: 0605 Hà Nội – 2010 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bài luận văn này, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS Lê Mai Hương – Trưởng phòng Sinh học thực nghiệm và Th.S Trần Thị Như Hằng, phòng Sinh học thực nghiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm là các anh, chị: Mai Ngọc Toàn, Trần Hồng Hà, Nguyễn Hoàng Kim Chi, Vũ Đình Giáp, Nguyễn Đình Luyện đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các giảng viên, cộng tác viên của khoa Công nghệ Sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã dạy dỗ tôi trong 4 năm qua. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, 23 tháng 5 năm 2010 Sinh viên Dương Thị Thanh Thủy NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN CMC : Cacboxyl metyl xenluloza EtOAc : Etyl axetat EtOH : Etanol NNS : Nấm nội sinh MT : Môi trường VSV : Vi sinh vật VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tìm hiểu về nấm nội sinh thực vật 3 1.1.1 . Nấm nội sinh thực vật là gì? 3 1.1.2 . Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh thực vật 3 1.1.2.1 Tình nghiên cứu trên thế giới 3 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 4 1.1.3 . Quan hệ giữa NNS và cây chủ 6 1.1.4 . Các sản phẩm tự nhiên từ NNS 8 1.1.4.1. Chất kháng sinh . 8 1.1.4.2 Chất chống ung thư 11 1.1.4.3 Chất chống oxy hóa 14 1.2. Họ thông (Pinaceae) 15 1.2.1 . Đặc điểm chung 15 1.2.2 . Phân bố 16 1.2.3 . Phân loại 17 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 19 2.1. Vật liệu 19 2.1.1 . Mẫu cây 19 2.1.2 . Chủng VSV kiểm định 19 2.1.3 . Các dòng tế bào 19 2.1.4 . Dụng cụ và hóa chất 19 2.1.5 . Môi trường 20 2.1.5.1 Môi trường phân lập 20 2.1.5.2 Môi trường nuôi cấy và giữ chủng NNS 20 2.1.5.3 Môi trường thử hoạt tính enzym 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 . Phân lập các chủng NNS 21 2.2.2 . Sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ của các chủng NNS phân lập được 22 2.2.3 . Xác định trọng lượng sinh khối khô 22 2.2.4 . Hoạt tính enzym ngoại bào 22 2.2.4.1 Xác định xenlulaza 22 2.2.4.2 Xác định amilaza 23 2.2.4.3 Xác định proteaza 24 2.2.5 . Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của chủng nấm 24 2.2.5.1 Lựa chọn môi trường thích hợp 24 2.2.5.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu 24 2.2.5.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 24 2.2.5.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ 24 2.2.6. Lên men, chiết rút các thành phần có hoạt tính sinh học của 2 chủng NNS . 25 2.2.7 . Xác định hoạt tính sinh học của các cặn chiết 25 2.2.7.1 Hoạt tính kháng VSVKĐ 25 2.2.7.2 Hoạt tính gây độc tế bào 26 2.2.7.3 Hoạt tính chống oxy hóa 27 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng NNS 28 3.2. Sàng lọc sơ bộ các chủng có hoạt tính sinh học 29 3.3. Các điều kiện nuôi thích hợp cho hoạt tính kháng VSVKĐ và sinh khối khô của 2 chủng nấm HT18Đ và NV8T 31 3.3.1 . Môi trường thích hợp 31 3.3.2 . Điều kiện pH thích hợp 34 3.3.3 . Lựa chọn thời gian lên men thích hợp để thu nhận sản phẩm 36 3.3.4 . Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp 39 3.3.5 . Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp 41 3.4. Tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của các cặn chiết EtOAc thu được từ dịch nuôi cấy của các chủng HT18Đ và NV8T 43 3.4.1 . Hoạt tính kháng VSVKĐ 43 3.4.2 . Hoạt tính gây độc tế bào 44 3.4.3 . Hoạt tính chống oxy hóa 44 3.4.4 . Hoạt tính enzym ngoại bào 45 KẾT LUẬN . 46