môi trường dịch thể)
Dùng khoan đục lỗ trên MT thạch đã cấy VSVKĐ trong đĩa petri. Nhỏ vào các lỗ khoan dịch nuôi cấy hoặc dịch chiết đã lọc qua giấy lọc. Các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch.
2.2.3. Xác định trọng lượng sinh khối khô
Giấy lọc được sấy ở 90ºC đến trọng lượng không đổi. Cân nhanh trên cân điện tử. Sau đó lọc dịch nuôi thu lấy tế bào. Đưa giấy lọc cộng sinh khối VSV sấy khô ở 90ºC đến trọng lượng không đổi. Sinh khối VSV được xác định theo công thức: P = P1 – P2
Trong đó P1 là khối lượng giấy lọc và sinh khối VSV. P2 là khối lượng giấy lọc.
2.2.4. Hoạt tính enzym ngoại bào
Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng nấm được xác định theo phương pháp đục lỗ thạch.
2.2.4.1. Xác định xenlulaza
Cơ chất để thử hoạt tính xenlulaza là CMC.
Tiến hành: Đun nóng MT cho thạch và cơ chất tan hết, để nguội 50- 60oC thì đổ ra đĩa Petri. Khi thạch đông thì khoan lỗ thạch, sau đó nhỏ phần dịch nuôi vào giếng thạch. Để trong tủ lạnh 4oC khoảng 5 tiếng để enzym khuyếch tán, sau đó đặt vào tủ ấm 30oC khoảng 24 giờ. Nhỏ thuốc thử lugol, nếu dịch nuôi có hoạt tính xenlulaza thì sẽ thấy xuất hiện vòng phân giải không bắt màu trên đĩa thạch. Hiệu số giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ đục (D-d, mm) phản ánh hoạt tính xenlulaza của dịch nuôi.
2.2.4.2. Xác định amilaza
Cơ chất để thử hoạt tính amilaza là tinh bột. Các bước tiến hành tương tự như khi thử hoạt tính xenlulaza, sử dụng thuốc thử lugol.
2.2.4.3. Xác định proteaza
Cơ chất để thử là gelatin. Sử dụng thuốc thử là dung dịch axit axetic 0,3%. Các bước tiến hành tương tự như khi xác định enzym xenlulaza và amilaza.
2.2.5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của các chủng nấm các chủng nấm
2.2.5.1. Lựa chọn môi trường thích hợp
Các chủng nấm đã lựa chọn được nuôi cấy trên các MT dịch thể: Sabouraud, Khoai tây, nước chiết Cám, nước chiết Ngô, nước chiết Đậu tương, Czapek. Sau thời gian 2 - 3 tuần tiến hành xác định hoạt tính sinh học và trọng lượng sinh khối khô để lựa chọn ra môi trường thích hợp.
2.2.5.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Nấm được nuôi cấy trên MT khoai tây dịch thể, chỉnh pH theo các thang 3; 4; 5; 6; 7; 8 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N. Sau 2 - 3 tuần xác định hoạt tính sinh học bằng phương pháp đục lỗ thạch và trọng lượng sinh khối khô.
2.2.5.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Nấm được nuôi cấy trên MT khoai tây dịch thể, theo các mốc thời gian 1 tuần; 2 tuần; 3 tuần; 4 tuần ; 5tuần. Ở mỗi thời điểm xác định hoạt tính sinh học bằng phương pháp đục lỗ thạch và trọng lượng sinh khối khô.
2.2.5.4. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon và nitơ♦ Ảnh hưởng của nguồn cacbon ♦ Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Sử dụng MT Czapek, nguồn cacbon được thay bằng: Glucoza, Lactoza, Saccaroza, Tinh bột, CMC với lượng không đổi.
♦ Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Sử dụng MT Czapek, nguồn nitơ được thay bằng: pepton, cao nấm men, (NH4)2SO4, NaNO3, NH4NO3.
2.2.6. Lên men, chiết rút các thành phần có hoạt tính sinh học của 2 chủng nấm nội sinh chủng nấm nội sinh
Các chủng nấm có hoạt tính được nuôi cấy trên MT dịch thể trong 2- 3 tuần. Sau đó sẽ tách chiết theo sơ đồ 1. Sản phẩm là cặn chiết EtOAc sẽ dùng để đánh giá hoạt tính sinh học.
Phương pháp chiết rút thành phần có hoạt tính sinh học được thể hiện bằng sơ đồ sau:
Sơ đồ 1: Phương pháp chiết rút các chế phẩm có hoạt tính sinh học
2.2.7. Xác định hoạt tính sinh học của các cặn chiết2.2.7.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 2.2.7.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Việc đánh giá hoạt tính kháng VSVKĐ được thực hiện theo phương pháp của Vanden Bergher và Vlietinck (năm 1994). Đó là phương pháp tiến Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-0524
Dịch nuôi nấm (2-3 tuần)
Cặn chiết EtOAc Dịch chiết EtOAc
Chiết với EtOAc (1:1) 3 lần
Loại dung môi dưới áp suất giảm
hành trên phiến vi lượng 96 giếng để tìm ra nồng độ ức chế tối thiểu MIC của các chất có hoạt tính.[29]
Kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampicillin đối với vi khuẩn Gram (+); Tetraxilin đối với vi khuẩn Gram (-); Nystatin dối với nấm mốc và nấm men. VSVt kiểm định gồm 8 chủng đã nêu ở trên.
Mẫu thử được hòa tan bằng dung môi DMSO 100%; với từ 4 ÷ 10 thang nồng độ được pha loãng dần từ dịch gốc rồi nhỏ sang phiến vi lượng. VSVKĐ sau khi được hoạt hóa sẽ được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị McLand (khoảng 108 VSV trên ml). Để trong tủ ấm 37ºC trong 24h đối với vi khuẩn và 30ºC trong 48h đối với nấm. Sau đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC).
Nếu mẫu thô có MIC ≤ 200 μg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50 μg/ml là có hoạt tính.
2.2.7.2. Hoạt tính gây độc tế bào
Theo phương pháp của Likhiwitayawuid đang được tiến hành tại viện nghiên cứu quốc gia của Mỹ (NCI).
Dòng tế bào: Dòng LU (Lung cancer – ung thư phổi); dòng Hep–G2 (Hepatocellular carcinoma - ung thư gan) từ Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương.
Tế bào ung thư được duy trì liên tục ở các điều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến pha log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại 3 lần trên phiến vi lượng 96 giếng. Phiến thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử, được ủ trong tủ ấm CO2/37 ºC /48÷72h để tế bào tiếp tục phát triển. Sau đó phiến được lấy ra cố định tế bào, rửa, nhuộm, loại thuốc nhuộm thừa và hòa lại bằng dung dịch chuẩn.
Giá trị IC50 được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị OD đo được.
Mẫu thô có IC50 ≤ 20 μg/ml; mẫu tinh có IC50 ≤ 5 μg/ml là có hoạt tính.
2.2.7.3. Hoạt tính chống oxy hóa
Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K., và cộng sự (2003).
Dựa trên nguyên tắc 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 495 ÷ 515 nm.