CỨU
2.1.Vật liệu
2.1.1 Mẫu cây
Các mẫu thông tươi được thu hái ở các địa điểm: Hà Giang, Đà Lạt ( Hồ Tiên, Núi Voi, Xuân Trường), Đắc Lắc (E H’leo, Krông Năng).
2.1.2 Chủng vi sinh vật kiểm định
Bộ chủng do phòng Sinh học thực nghiệm – Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên cung cấp bao gồm:
▪ Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtillis ATCC 27212
Staphylococcus aureus ATCC 12222 ▪ Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923 ▪ Nấm men: Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754
Candida albicans SH 20 ▪ Nấm mốc: Aspergillus niger 439
Fusarium oxyporum M42
2.1.3. Các dòng tế bào
Dòng Hep- G2: Hepatocellular carcinoma- ung thư gan Dòng Lu: Lung cancer- ung thư phổi
2.1.4. Dụng cụ và hóa chấtDụng cụ Dụng cụ
• Tủ cấy vi sinh - Box laminar PII (Đức) • Tủ ấm 30ºC ÷ 30ºC – Memmert (Đức) • Cân điện tử AL300 – Thụy Sỹ
• Nồi khử trùng Lequenx (Pháp) • Máy lắc thường Gerhardt (Đức)
• Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản)
• Các dụng cụ cấy VSV (Việt Nam, Thụy Sỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ…).
Hóa chất
Các hóa chất thực hiện thí nghiệm có nguồn gốc từ: Đức, Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ…
2.1.5. Môi trường
2.1.5.1. Môi trường phân lập
MT Martin (g/l): glucoza 1; pepton 5; KH2PO4 0,1; MgSO4.7H2O 0,5; Rose bengal 1/3000; thạch 20; nước 1000ml; pH = 7,0 - 7,2.
2.1.5.2. Môi trường nuôi cấy và giữ chủng nấm nội sinh
MT khoai tây thạch (g/l): khoai tây 200; pepton 5; glucoza 20; thạch 20; nước 1000 ml; pH = 6,5 - 7,0.
MT khoai tây dịch thể (g/l): khoai tây 200; glucoza 20; pepton 5; nước 1000ml; pH = 6,5 - 7,0.
MT Saboraud dịch thể (g/l): pepton 10; glucoza 20 - 40; nước 1000ml; pH = 7,0 - 7,2.
MT Saboraud thạch (g/l): glucoza 20 40; pepton 10; thạch 20 – 30; nước 1000ml; pH = 7,0 - 7,2.
MT nước chiết ngô (g/l): bột ngô 20; saccaroza 20; (NH4)2SO4 2,5; CaCO3 2; MgSO4 1,5; nước 1000ml; pH = 6,5 - 7,2.
MT bột đậu tương (g/l): bột đậu tương 20; saccaroza 20; (NH4)2SO4
2,5; CaCO3 2; MgSO4 1,5; nước 1000ml; pH = 6,5 - 7,2.
MT cám gạo (g/l): cám gạo 20; saccaroza 20; (NH4)2SO4 2,5; CaCO3 2; MgSO4 1,5; nước 1000ml; pH = 6,5 - 7,2.
MT Czapek (g/l) : Saccaroza 30; NaNO3 2; KH2PO4 1; MgSO4.7H2O 0,5; KCl 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; nước 1000 ml.
MT thạch thường (g/l): cao thịt 2,5; pepton 10; NaCl 5; thạch 20 - 30; nước 1000ml; pH = 7,0 - 7,2.
2.1.5.3. Môi trường thử hoạt tính enzym
♦ Dung dịch khoáng (g/l): NaNO3 2,5; K2HPO4 1; NaCl 0,1; MgSO4.7H2O 0,3; FeCl3 0,01; CaCl2 0,1; nước cất 1000ml; pH = 6,8.
MT thử hoạt tính enzym xenlulaza (g/l): Na-CMC 1; thạch 4; dung dịch khoáng 200ml.
MT thử hoạt tính enzym amilaza (g/l): tinh bột tan 2; thạch 4; dung dịch khoáng 200ml.
MT thử hoạt tính enzym proteaza (g/l): cazein (hoặc gelatin) 5; thạch 4; dung dịch khoáng 200ml.
Chú ý: Các môi trường đều được khử trùng ở 121ºC/15÷30 phút.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập các chủng nấm nội sinhLấy mẫu Lấy mẫu
Mẫu còn tươi được giữ nguyên vẹn trong túi nilon sạch, bảo quản ở nhiệt độ 4oC trước khi phân lập.
Làm sạch bề mặt mẫu
Rửa mẫu dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Khi bề mặt mẫu đã ráo nước, ngâm mẫu trong cồn EtOH 70o trong 1 phút. Để mẫu khô ráo trong tủ cấy vô trùng
Phân lập
Dùng dụng cụ vô trùng cắt mẫu thành những đoạn nhỏ dài 5-10 mm; đặt các mảnh nhỏ lên đĩa petri có môi trường phân lập, sau đó chuyển đĩa vào tủ ấm 30ºC.
Lựa chọn và lưu giữ chủng giống
Khi nấm bắt đầu có sợi khuẩn ty mọc ra từ mô cây, chọn ra các chủng nấm và ria cấy trên môi trường Martin để tinh sạch chủng. Lựa chọn các chủng sạch và cấy trên môi trường thạch nghiêng khoai tây để lưu giữ giống và kiểm tra hoạt tính. Trước khi mang ra sử dụng cấy truyền lại sang ống nghiệm mới để làm mới chủng.
2.2.2. Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng nấm nội sinh phân lập được nấm nội sinh phân lập được
Chuẩn bị
Các chủng VSVKĐ được cấy truyền từ ống thạch nghiêng sang môi trường canh thang để làm mới chủng, đặt trong tủ ấm 30ºC (đối với nấm); 37ºC (đối với vi khuẩn) thời gian 48h.
Đun MT cho thạch tan hết, để nguội đến 40ºC
Dùng Micro pipet hút dịch sinh khối VSVKĐ ra đĩa petri, sau đó hòa đều với thạch (đã để nguội đến 50ºC), theo tỷ lệ 5%. Trong đó nấm kiểm định hòa với môi trường Sabouraud, còn vi khuẩn kiểm định hòa với môi trường thạch thường.