Nghiên cứu sự biến đổi một số chỉ số chống oxy hóa ở người tiếp xúc nghề nghiệp với chì vô cơ, tác dụng bảo vệ của sâm ngọc linh trên động vật thực nghiệm

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chì và các hợp chất vô cơ của chì (gọi chung là chì) đã được sử dụng từ hàng ngàn năm trước công nguyên. Mặc dù có nhiều tác hại đối với sức khoẻ con người, song chì là nguyên liệu không thể thay thế trong nhiều ngành công nghiệp [25]. Vì vậy, chì vẫn tiếp tục được sử dụng rộng rãi trong hiện tại và tương lai cho nên số lượng người tiếp xúc không những không giảm mà còn có xu hướng tăng lên. Hiện có khoảng hơn 150 nghề và trên 400 quá trình công nghệ khác nhau có sử dụng chì và các hợp chất của chì [3]. Trong quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, sản xuất ắc quy và sản xuất thuốc gợi nổ là hai ngành rất quan trọng, không những phục vụ cho quốc phòng mà còn phục vụ cho sự phát triển của đất nước. Chì gây nhiều tổn thương đa dạng và phức tạp trên hầu hết các cơ quan và tổ chức như tổn thương hệ thống thần kinh, tiêu hóa, sinh sản, tim mạch, xương khớp, thận tiết niệu và đặc biệt nổi bật trên hệ thống tạo máu… Các nhà khoa học đã chứng minh rằng, cơ chế gây độc của chì là ức chế và liên kết đặc hiệu đối với các enzym, các chất sinh học có chứa nhóm -SH trong cấu trúc phân tử [25]. Từ những hiểu biết cơ bản này, người ta đã điều chế ra một số thuốc điều trị đặc hiệu để sử dụng trong điều trị nhiễm độc chì như dimercaprol (British Anti Lewisite, BAL), D-penicillamin, succimer, CaNa 2 EDTA . Các thuốc này khi đưa vào cơ thể sẽ can thiệp vào cơ chế bệnh sinh do chì gây ra [5], [25], [62]. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị chưa được như mong muốn, nhất là trong nhiễm độc chì mạn tính. Bởi vậy, người ta đặt vấn đề: phải chăng ngoài cơ chế gây nhiễm độc được thừa nhận như đã nêu trên, chì còn gây tổn thương cơ thể theo những cơ chế khác nữa. 1 2 Vấn đề đặt ra là cần phải có hướng nghiên cứu tiếp về cơ chế bệnh sinh và điều trị người tiếp xúc nghề nghiệp với chì. Gần đây, một số nghiên cứu trên người và động vật đã gợi ý rằng, chì có khả năng kích thích tạo gốc tự do và làm giảm chức năng của hệ thống chống gốc tự do trong cơ thể. Như vậy, chì được xem như một xenobiotic, khi vào cơ thể có khả năng tác động như một stress oxy hóa. Có thể đây là một trong các cơ chế sinh bệnh học quan trọng cần phải làm sáng tỏ. Điều này phù hợp với đặc điểm tổn thương đa dạng và không mang tính đặc hiệu trên nhiều tổ chức và cơ quan trong nhiễm độc chì. Làm rõ được vấn đề này, cần đánh giá sự thay đổi các enzym chống oxy hóa ở công nhân tiếp xúc nghề nghiệp với chì [36], [70], [123], [152]. Hiện nay, trên thị trường có nhiều loại dược phẩm có tác dụng chống oxy hóa như belaf, selen, glutathion…. Ngoài tác dụng được coi là bổ, tăng lực, sinh thích nghi, chống viêm, giảm đau, bảo vệ gan…thì sâm Ngọc Linh tự nhiên và sâm Ngọc Linh sinh khối đã được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất tốt, bảo vệ cơ thể chống lại các stress oxy hóa [20]. Việc ứng dụng và đánh giá hiệu quả bảo vệ của sâm Ngọc Linh tự nhiên hoặc sâm Ngọc Linh sinh khối đối với các đối tượng tiếp xúc độc hại nói chung và chì nói riêng là những vấn đề mới thực tế chưa được nghiên cứu nhiều. Làm sáng tỏ được vấn đề này, sẽ góp phần tìm kiếm thêm một loại chế phẩm tốt phục vụ cho công tác dự phòng và điều trị nhiễm độc chì trong tương lai. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này với mục tiêu: 1. Xác định sự thay đổi một số thông số chống oxy hóa và hóa sinh máu ở người tiếp xúc nghề nghiệp với chì và ở chuột nhắt trắng được gây nhiễm độc chì. 2. Đánh giá tác dụng bảo vệ của sâm Ngọc Linh sinh khối trên chuột nhắt trắng được gây nhiễm độc chì bán trường diễn. 2 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Gốc tự do và hệ thống chống gốc tự do của cơ thể. 1.1.1. Khái niệm. Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp ngoài cùng chứa các điện tử không ghép cặp (điện tử đơn độc). Chúng có thể mang điện tích âm hoặc không mang điện và có khả năng phản ứng cao. Vì vậy, gốc tự do thường bất ổn cả về năng lượng cũng như động học. Nó có khuynh hướng đạt tới sự ổn định, thời gian tồn tại rất ngắn, hoạt tính rất mạnh. Quá trình sinh gốc tự do là một quá trình chuyển hóa bình thường của cơ thể [12], [38], [138]. Gốc tự do có xu hướng mất điện tử để trở thành gốc khử hoặc nhận điện tử để trở thành gốc oxy hóa. Gốc tự do không ghép cặp nên dễ dàng tấn công vào các phân tử tạo ra các phân tử mới, gốc mới và gây ra phản ứng dây chuyền. Các gốc tự do chủ yếu là các dạng oxy hoạt động được hình thành qua chuỗi hô hấp tế bào, trong quá trình peroxy hóa lipid của các acid béo chưa bão hòa [2], [12], [38]. 1.1.2. Gốc tự do và các dạng oxy hoạt động trong cơ thể. Trong đời sống tế bào bình thường, oxy là nhiên liệu chủ yếu cần thiết cho sự sống của tế bào và cũng là nguồn gốc chính sản sinh ra gốc tự do. Các dạng oxy hoạt động (reactive oxygen species - ROS) là những gốc tự do, những ion hoạt động, phân tử có chứa nguyên tử oxy, có khả năng sinh ra gốc tự do hoặc được hoạt hóa bởi các gốc tự do [39]. Những dạng ROS quan trọng trong cơ thể sinh vật gồm: anion superoxid • 2 O , hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), gốc hydroxyl ( • OH), oxy đơn bội 1 O 2 , gốc alkoxyl (LO • ) hoặc peroxyl (LOO • )… 3 4 + Superoxid được tạo thành từ chuỗi hô hấp tế bào hoặc từ một số phản ứng tự oxy hóa và trong quá trình bùng nổ hô hấp của hiện tượng thực bào. e - + • O-O • • 2 O + Hydrogen peroxid (H 2 O 2 ) có thể được hình thành sau phản ứng dị ly của • 2 O hoặc do phản ứng khử hai điện tử của oxy. H 2 O 2 có hoạt tính hóa học hạn chế, là chất tan trong lipid và có thể xuyên qua các màng sinh học. + Gốc hydroxyl ( • OH) được hình thành từ phản ứng Fenton hoặc phản ứng Haber-Weiss xảy ra chậm. Khả năng phản ứng của gốc hydroxyl là rất lớn trong môi trường sinh học, có khả năng phản ứng với rất nhiều thành phần của tế bào. + Gốc alkoxyl (LO • ) hoặc peroxyl (LOO • ), có thể được tạo ra dưới tác động của một gốc tự do có chứa oxygen ( • 2 O , HO • .) trên những chuỗi acid béo có nhiều nối đôi. + Oxy đơn bội ( 1 O 2 ) là một dạng oxy có năng lượng cao, hình thành khi O 2 được cung cấp năng lượng, nó không phải là gốc tự do nhưng có khả năng oxy hóa cực mạnh, chỉ tồn tại trong nước và thời gian bán hủy là 2µs. Oxy đơn bội được tạo thành ở hệ thống sinh học trong một số sắc tố như chlorophyll, retinal và flavin khi chúng được chiếu sáng với sự có mặt của oxy. 1.1.3. Stress oxy hóa. Trong những cơ thể sống ái khí khỏe mạnh, gần như có sự cân bằng giữa sản sinh các dạng oxy hoạt động với hệ thống chống oxy hóa [42]. Stress oxy hóa dùng để chỉ sự mất cân bằng nghiêm trọng giữa quá trình tạo thành các dạng oxy hoạt động với hệ thống chống oxy hóa. Nếu stress oxy hóa ở mức độ nhẹ, các phân tử sinh học bị tổn thương có thể được sửa chữa hoặc thay thế. Ở mức độ nặng nề hơn, stress oxy hóa có thể gây tổn thương không hồi phục hoặc chết tế bào [12], [38]. 4 5 Stress oxy hóa có thể là kết quả của ba yếu tố: suy giảm hệ thống chống oxy hóa, tăng tạo thành các dạng oxy hoạt động và thiếu khả năng sửa chữa các tổn thương do quá trình oxy hóa trong cơ thể [12]. 1.1.4. Quá trình hình thành các gốc tự do. Các gốc tự do trong cơ thể được tạo ra thường xuyên: qua chuỗi hô hấp tế bào, tác nhân phóng xạ, hội chứng viêm, trong hiện tượng thiếu máu cục bộ - tưới máu lại, các tác nhân xenobiotic và một số tác nhân khác. 1.1.4.1. Chuỗi hô hấp tế bào. Hô hấp tế bào được thực hiện trong ty thể, bao gồm các phản ứng oxy hóa khử oxy để sinh ra nước và năng lượng dưới dạng ATP (phản ứng oxy hóa khử là quá trình cho và nhận điện tử, do vậy sản sinh ra các gốc), O 2 mà chúng ta hít thở nhận một điện tử ở bước đầu tiên tạo ra • 2 O . Cơ chất e - + • O-O • • 2 O • 2 O sinh ra tỷ lệ thuận với cường độ hô hấp tế bào (tỷ lệ với năng lượng sinh ra), là một gốc anion độc hại ở mức trung bình và chúng bị phân hủy bởi nhiều cơ chế khác nhau. Sự phân huỷ • 2 O được xúc tác bởi enzym SOD, chuyển thành H 2 O 2 theo cơ chế tự oxy hóa khử. 2 • 2 O + 2H +  → SOD H 2 O 2 + O 2 SOD có hai dạng chính là MnSOD (là SOD mà trung tâm hoạt động có mangan) và CuZnSOD (là SOD mà trung tâm hoạt động có đồng và kẽm). Trong ty thể, enzym MnSOD phân hủy khoảng 80% gốc • 2 O khi chúng vừa được sinh ra, còn gốc nào thoát ra bào tương (khoảng 20%) sẽ bị loại bỏ bởi enzym CuZnSOD và nhờ hai enzym này mà gốc • 2 O không đến được màng tế bào, vượt ra ngoài tế bào và do vậy dịch ngoại bào hầu như không có • 2 O [39], [134]. 5 6 H 2 O 2 thường xuyên sinh ra do sự phân hủy • 2 O , nồng độ H 2 O 2 (10 -8 mol/L) và • 2 O (10 -12 mol/L) trong tế bào tương đối ổn định. Tuy nồng độ thấp như vậy, nhưng sự tồn tại đồng thời của chúng trong môi trường sinh học là rất nguy hại. Phản ứng giữa chúng sinh ra những sản phẩm 1 O 2 cũng rất nguy hại, gốc • OH với hoạt tính cao, có khả năng phá hủy những cấu trúc hữu cơ bền vững nhất của cơ thể và gây ra các quá trình bệnh lý. Khi không có mặt của ion Fe 2+ , Cu 2+ thì phản ứng này xảy ra chậm, gọi là phản ứng Harber-Weiss. • 2 O + H 2 O 2 HO • + HO - + 1 O 2 Khi có mặt của các ion Fe 2+ , Cu 2+ thì tốc độ phản ứng xảy ra rất nhanh (phản ứng Fenton). Hai tiểu phân • 2 O và H 2 O 2 không độc có thể tạo ra 1 O 2 , • OH có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxid và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. 2 • 2 O + 2 H + H 2 O 2 + O 2 Và khi đó ion kim loại chuyển tiếp (Fe 2+ , Cu 2+ ) dễ dàng phân tách H 2 O 2 thành gốc hydroxyl. Fe 2+ + H 2 O 2 HO • + HO - + Fe 3+ Gốc • OH có khả năng phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học ở tốc độ khuếch tán, vì vậy nó thường phản ứng trước khi khuếch tán tới những nơi có khoảng cách xa trong tế bào. Gốc • OH có thời gian tồn tại ngắn, khả năng gây tổn thương lớn, nhưng chỉ gây tổn thương trong phạm vi bán kính nhỏ [3], [12], [39], [145]. 1.1.4.2. Tác nhân phóng xạ. Các tia phóng xạ hoặc bức xạ có năng lượng cao, có khả năng bẻ gãy một phân tử tạo ra 2 hay nhiều gốc tự do. Trong cơ thể chúng ta chiếm phần 6 7 lớn là nước, do vậy khi các bức xạ có năng lượng cao tác động trên cơ thể, sẽ phân huỷ nước tạo thành các phân tử khác và sản sinh gốc tự do [3], [43]. 1.1.4.3. Trong hội chứng viêm. Theo Almagor M và cs (1984) [34], hội chứng viêm là một phản ứng tự vệ của cơ thể khi có các tác nhân lạ xâm nhập vào cơ thể. Khi các tác nhân (là các kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính bắt giữ, đồng thời lại kích hoạt bạch cầu đa nhân trung tính tăng tiêu thụ oxy, kích thích enzym của màng tế bào là NADPH-oxidase, từ đó gây phản ứng xúc tác bởi enzym này, kết quả cuối cùng là tạo ra • 2 O . Nếu số lượng gốc tự do sinh ra quá nhiều sẽ gây nên một tỷ lệ bạch cầu bị chết, giải phóng các gốc ROS ra ngoại bào gây nên hiện tượng viêm. 1.1.4.4. Trong quá trình thiếu máu cục bộ và tưới máu lại. Khi thiếu máu cục bộ do lòng mạch máu bị hẹp hoặc có cục máu đông, các chất xanthine được tích lũy do tăng thoái hóa ATP và xanthine oxidase được hoạt hóa. Khi có sự tưới máu trở lại, với sự có mặt của oxy, xanthine oxidase xúc tác phản ứng chuyển điện tử từ hypoxanthine và xanthine sang O 2 và phản ứng oxy hóa xảy ra rất mạnh, một lượng lớn gốc • 2 O hình thành lại chuyển thành H 2 O 2 , • OH và 1 O 2 [3], [12], [138]. 2 H + Xanthin + O 2 Xanthin dạng oxy hoá + • 2 O 2 H + 2 • 2 O H 2 O 2 + 1 O 2 1.1.4.5. Tác nhân xenobiotic. Các chất xenobiotic (thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, chì, CCl 4 , dioxin .) xâm nhập vào cơ thể bằng nhiều con đường khác nhau, khi vào cơ thể sẽ bị chuyển hóa và làm biến đổi sinh học. Sau quá trình chuyển hóa đó, cấu trúc xenobiotic bị biến đổi rõ rệt, chúng có thể gắn thêm nhóm -OH, -NH 2 , -SH, 7 8 -COOH . tạo thành các chất dễ tan trong nước và tiếp tục liên hợp với các chất, đào thải ra khỏi cơ thể. Trong quá trình chuyển hóa các chất xenobiotic, tạo ra các dạng ROS như • 2 O , 1 O 2 .có độc tính cao và gây ra tình trạng stress oxy hóa. Các chất chống oxy hóa trong cơ thể như SOD, catalase, protein có nhóm SH, ceruloplasmin trong hồng cầu và gan rất nhạy cảm với các xenobiotic. Do vậy, khi có các xenobiotic xâm nhập vào cơ thể, các chất chống oxy hóa này sẽ thay đổi theo hướng chống lại các tác nhân đó [27], [68], [138]. 1.1.4.6. Một số tác nhân khác. Trong một số bệnh lý: bệnh đái đường, vữa xơ động mạch, bệnh lý nhãn khoa, lão hóa, bệnh Parkinson và Alzheimer…cũng tăng tạo các dạng ROS [7], [12]. 1.1.5. Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể. Trong cơ thể luôn tồn tại các dạng oxy hoạt động, đồng thời cũng tồn tại một hệ thống chống oxy hóa để loại bỏ các tác hại của chúng. Hệ thống này hoạt động theo 4 con đường sau: (1) tạo phức làm mất khả năng xúc tác của các kim loại chuyển tiếp (transferin), (2) làm gián đoạn các phản ứng lan truyền (α-tocoferol), (3) làm giảm nồng độ các gốc tự do hoạt động (glutathion), (4) thu dọn các gốc tự do tham gia khơi mào phản ứng (superoxid dismutase) [41]. Hệ thống gồm các chất chống oxy hóa có bản chất enzym và có bản chất không enzym. 8 9 Sơ đồ 1.1. Mối liên quan giữa các enzym bảo vệ tế bào và các chất chống oxy hóa (Nguồn: theo William J. Marshall, Stephen K. Banger (1995) [161]). 1.1.5.1. Hệ thống chống oxy hóa có bản chất enzym. - Superoxid dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) Superoxid dismutase (SOD) là enzym chống oxy hóa có chứa kim loại thuộc loại oxidoreductase, nó xúc tác cho phản ứng chuyển hóa superoxid thành O 2 và H 2 O 2 : 2 • 2 O + 2H + H 2 O 2 + O 2 SOD có hoạt tính càng cao thì O 2 • có hoạt tính càng nhỏ, SOD là một chất chống oxy hóa rất cơ bản, làm hạ thấp nồng độ tiền chất • 2 O , mà từ đó sẽ sản sinh ra tất cả các dạng oxy hoạt động khác.  → SOD 9 10 Cơ chế phản ứng của SOD: SOD là metalloenzym chống oxy hóa hữu hiệu trong tế bào, xúc tác phản ứng dị ly oxy hóa khử, phân hủy gốc superoxid. Quá trình trao đổi điện tử thực chất xảy ra tại trung tâm hoạt động ion kim loại (Me) theo cơ chế phản ứng oxy hóa khử vòng gồm 2 bước: Me 3+ + • 2 O Me 2+ + O 2 Me 2+ + • 2 O + 2H + Me 3+ + H 2 O 2 Đầu tiên Me 3+ bị khử bằng cách nhận một điện tử của gốc • 2 O và trở thành dạng oxy hóa Me 2+ , còn • 2 O chuyển thành O 2 . Khi đó Me 2+ tiếp tục tương tác với một gốc • 2 O và nhường điện tử cho nó, với sự có mặt của H + chúng kết hợp với nhau để tạo thành H 2 O 2 . Quá trình này tiếp tục lặp đi, lặp lại tạo nên một chu trình phản ứng khép kín. Chu kỳ bán hủy của SOD từ vài phút đến vài giờ, nó phụ thuộc vào nhóm SOD khác nhau. SOD không qua được màng tế bào nên chỉ có tác dụng cải thiện khả năng chống oxy hóa nội bào [12], [39]. - Catalase (CAT, EC 1.15.1.1). Catalase là enzym xúc tác phản ứng phân hủy H 2 O 2 và chỉ hoạt động khi H 2 O 2 ở nồng độ cao (lớn hơn 10 -8 mmol/L), catalase không phân hủy được peroxide hữu cơ và H 2 O 2 vô cơ ở nồng độ thấp vì chúng chỉ được hoạt hóa khi H 2 O 2 ở nồng độ cao. H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 Catalase có mặt trong hầu hết các tế bào và các mô động vật nhưng hoạt tính mạnh nhất là ở gan và thận, ít nhất là ở mô liên kết và trong các mô, catalase có chủ yếu trong các ty thể và peroxisome [12], [39], [88], [138]. - Peroxidase (EC 1.11.1.7).  → Catalase 10 . Xác định sự thay đổi một số thông số chống oxy hóa và hóa sinh máu ở người tiếp xúc nghề nghiệp với chì và ở chuột nhắt trắng được gây nhiễm độc chì. 2 chế bệnh sinh và điều trị người tiếp xúc nghề nghiệp với chì. Gần đây, một số nghiên cứu trên người và động vật đã gợi ý rằng, chì có khả năng kích thích