Tinh sạch và xác định đặc điểm sinh hóa của RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) từ virus gây bệnh tay chân miệng (FMDV)

Bài viết này trình bày về protein RdRp tái tổ hợp của virus gây bệnh tay chân miệng (FMDV) đã được tinh sạch và kiểm tra các hoạt tính sinh hóa. Protein RdRp tái tổ hợp với độ tinh sạch hơn 98% đã được thu nhận và thể hiện hoạt tính RNA polymerase với sự tổng hợp RNA phụ thuộc mồi. Mời các bạn cùng tham khảo!

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 44, 2020 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY-CHÂN-MIỆNG (FMDV) PHẠM TẤN VIỆT, NGUYỄN NGỌC ẨN, NGUYỄN THỊ DIỆU HẠNH Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Cơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh nguyenthidieuhanh@iuh.edu.vn Tóm tắt Protein RdRp (RNA dependent RNA polymerase) virus có vai trị quan trọng chu trình sống virus Enzyme xem mục tiêu cho thuốc phòng ngừa điều trị bệnh Trong nghiên cứu này, protein RdRp tái tổ hợp gây bệnh tay chân miệng (FMDV) tinh kiểm tra hoạt tính sinh hóa Protein RdRp tái tổ hợp với độ tinh 98% thu nhận thể hoạt tính RNA polymerase với tổng hợp RNA phụ thuộc mồi Chúng xác định giá trị km V max cho tổng hợp UTP 13,6 µM 42 µM/giờ kcat cho xúc tác phản ứng 0,28 min-1 kobs cho chuyển đổi chất 0,022 min-1 Chất ức chế cho hoạt động enzyme DMUT kiểm tra IC50 DMUT 26,79 µM Như vậy, đặc điểm sinh hóa enzyme RdRp FMDV xác định, sở cho việc sàng lọc đối tượng thuốc phương pháp hóa trị liệu để phịng ngừa điều trị bệnh tay chân miệng Từ khóa RNA polymerase phụ thuộc RNA, virus gây bệnh tay chân miệng, đặc điểm sinh hóa, phương pháp so màu, tinh enzyme PURIFICATION AND BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF RNA- DEPENDENT RNA POLYMERASE (RdRp) FROM FOOT AND MOUTH DISEASE VIRUS Abstract The RdRp protein (RNA dependent RNA polymerase) of the viruses plays an important role in the viral life cycle This enzyme is considered an attractive target for viral preventive and treatment drugs In this study, the recombinant RdRp protein of foot and mouth disease virus (FMDV) was purified and examined biochemical activities The recombinant RdRp protein with 98% purity were collected and expressed RNA polymerase activity with primer-dependent RNA synthesis km and V max values are also calculated and km for UTP synthesis is 13.6 µM and V max is 42 µM / hour Kcat for catalytic reaction is 0.28 min-1 and kobs for rate constant is 0.022 -1 The inhibitor for enzyme activity was also tested and the IC 50 for DMUT was 1.28 mM and 26.79 µM Thus, the biochemical characteristics of FMDV RdRp has been identified, which is the basis for the screening of drug candidates in chemotherapy to prevent and treat foot and mouth disease Key words RNA dependent RNA polymerase, foot and mouth desease virus, biochemical characterization, colorimetric assay, enzyme purification GIỚI THIỆU Bệnh tay chân miệng (hay cịn gọi bệnh lở mồm long móng động vật móng guốc) bệnh cấp tính, dễ lây lan vật ni móng guốc bị, lợn, cừu, số động vật hoang dã Bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi [1-4] Tác nhân gây nên bệnh tay chân miệng virus FMDV (Foot and Mouth Disease Virus) thuộc chi Aphthovirus, họ Picornavirida Sự lây lan nhanh virus FMDV động vật khiến Tổ chức Thế giới cho Sức khỏe Động vật (World Organization for Animal Health-OIE) đưa bệnh tay chân miệng vào danh mục bệnh nghiêm trọng cần giám sát [5] Hiện FMDV biết có bảy kiểu huyết bao gồm A, O, C, Châu Á 1, lãnh thổ Nam Phi SAT1, SAT2, SAT3 Mỗi kiểu huyết có chứa nhiều kiểu gen quy định [6, 7] Trong kiểu huyết này, 60 phân nhóm báo cáo Chính kiểu gen đa dạng nên chưa có vaccine đa hiệu cho FMDV Do đó, thách thức cho việc chọn lọc dòng vaccine [8] Trước đây, vaccine hiệu cho ngăn ngừa bệnh tay chân miệng sử dụng FMDV bất hoạt số lượng giới hạn dịch bùng phát Hiện nay, ứng dụng kỹ thuật di truyền, vaccine chứa phần gen FMDV mà cần thiết cho hợp capsid virus không chứa gen mã hóa cho nonstructural protein, đặc biệt enzyme RNA dependent RNA polymerase – RdRp Tuy nhiên, vaccine có hoạt lực sau bảy ngày tiêm chủng cần thời gian để kích hoạt phản ứng miễn dịch [9] Nhiều nghiên cứu © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 66 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY-CHÂN-MIỆNG (FMDV) thực để tìm loại thuốc cho việc phịng ngừa điều trị bệnh tay chân miệng việc sử dụng hợp chất ribavirin để ức chế nhân lên gen virus, hợp chất 29-C-methylcytidin ức chế hoạt động enzyme RdRp, chưa có loại thuốc cơng nhận thật có khả phòng ngừa điều trị bệnh [2-4, 10] Bộ gen Virus FMDV phân tử RNA sợi dương mạch đơn có chiều dài khoảng 8,5 kb Sản phẩm sau dịch mã polyprotein Phân tử polyprotein phân cắt thành protein cấu trúc protein chức [11] Protein chức tham gia trình tổng hợp RNA RNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polymerase - RdRp) Do đó, enzyme RdRp có vai trị mấu chốt chu trình sống FMDV Hiện nay, nhiều loại thuốc kháng virus mà mục tiêu polymerase tác nhân gây bệnh khác chứng nhận Như vậy, enzyme polymerase virus mục tiêu chủ yếu cho việc phát triển loại thuốc chống lại bệnh virus gây Trong đó, enzyme RdRp FMDV mục tiêu rõ ràng cho việc sử dụng phương pháp hóa trị liệu điều trị phòng ngừa bệnh [4, 12-15] Việc hiểu rõ đặc tính sinh hóa RdRp giúp cho việc sàng lọc loại thuốc hỗ trợ phòng chống bệnh tác nhân virus RNA mang gen RNA gây nên Trong nghiên cứu này, tiến hành biểu tinh RNA phụ thuộc RNA virus gây bệnh tay chân miệng kỹ thuật tái tổ hợp Protein sau tinh kiểm tra đặc tính động học enzyme với ảnh hưởng nồng độ enzyme lên hoạt tính RNA polymerase, phụ thuộc mồi enzyme, hoạt tính RNA polymerase điều kiện nồng độ mạch khuôn RNA khác nhau, nồng độ chất UTP khác hoạt tính thể khoảng thời gian khác Ngoài ra, ảnh hưởng chất ức chế cạnh tranh DMUT lên trình tổng hợp RNA kiểm tra nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzyme xác định Sự hiểu biết động học enzyme giúp cho việc tiên đoán hoạt động enzyme hỗ trợ việc sàng lọc đối tượng thuốc cho việc phòng ngừa điều trị bệnh tay chân miệng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Biểu tinh biểu tinh RdRp tái tổ hợp từ FMDV Plasmid pET-28a chứa gen mã hóa cho enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA từ virus gây bệnh tay chân miệng C-S8c1 (Foot and mouth disease vius RNA dependent RNA polymerase – FMDV C-S8c1 RdRp) biến nạp vào Escherichia coli BL21, trình biểu RdRp tái tổ hợp trình bày nghiên cứu Cristina Ferrer-Orta cộng sự, 2004 [16] Vi khuẩn E coli BL21 có chứa plasmid mang gen mã hố cho protein RdRp nuôi môi trường LB (Luria broth) có bổ sung kanamycin (50 µg/mL) nhiệt độ 37°C lắc 180 vòng/phút giá trị mật độ quang bước sóng 600 nm đạt giá trị 0,6 cho cảm ứng để tổng hợp protein Chất cảm ứng IPTG (isopropyl-D-1thiogalactopyranoside) thêm vào môi trường nuôi cấy với nồng độ cuối đạt 0,5mM kiểm tra biểu protein điều kiện nhiệt độ khác 16°C, 28°C, 37°C khoảng thời gian khác 2, 4, 6, 16 để chọn điều kiện nhiệt độ thời gian thích hợp cho biểu protein Các tế bào sau nuôi cấy ly tâm thu nhận điều kiện 4500 vòng/phút 20 phút 4°C Các tế bào phá vỡ sóng siêu âm với thiết bị Ultrasonic Probe Sonicator Q500 (Thomas Scientific, USA) thu dịch sau ly tâm 13000 vòng/phút 4°C Protein FMDV RdRp tái tổ hợp với tag His dịch vi khuẩn tinh hệ thống FPLC (Akta Prime Plus, GE Healthcare, USA) với kỹ thuật sắc ký lực Ni-NTA, sau tiếp tục tinh với kỹ thuật sắc ký lọc gel (Superdex 75 3,2/300) mô tả nghiên cứu trước [17] Sản phẩm protein tinh kiểm tra gel SDSPAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) 2.1.2 Cơ chất mạch khuôn RNA poly-rA, mồi dT18 , nucleotide UTP pyrophosphatase Mạch khuôn RNA sử dụng phản ứng tổng hợp RNA poly(rA) (khoảng 600 nt; Sigma– Aldrich) Mồi sử dụng phân đoạn DNA cấu tạo Thymine với chiều dài 18 nucleotide - DNA oligo(dT) (Cosmo Genetech, Seoul, Hàn Quốc) Thành phần nucleotide UTP (Uracil triphosphate) đánh dấu đồng vị phóng xạ đầu phosphate [ -32P] UTP (3,000 Ci/mmol, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) sử dụng thí nghiệm kiểm tra hoạt tính RNA polymerase Enzyme pyrophosphatase tái tổ hợp (PPase) chịu nhiệt từ vi khuẩn Pyrococcus cung cấp phòng thí nghiệm Nucleic Acid Biochemistry Laboratory (Đại học Konkuk, Seoul, Hàn Quốc) © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY-CHÂN-MIỆNG (FMDV) 67 2.2 Phƣơng pháp 2.2.1 Xác định hoạt tính phân hủy UTP FMDV RdRp tái tổ hợp Phản ứng RNA polymerase kiểm tra phương pháp so màu thông qua gốc phosphate tạo thành nghiên cứu trước [18] Do đó, hoạt tính phân hủy UTP hình thành nên gốc phosphate ảnh hưởng đến kết thu nhận Hoạt tính phân hủy UTP kiểm tra phản ứng thực điều kiện chứa 25 mM Tris–HCl (pH 7,8), 2,5 mM MgCl2, mM DTT, 20 U/ml chất ức chế RNase (Enzynomics, Daejeon, Korea), 0,1 µM mạch khn poly(rA) bắt cặp với µM mồi DNA oligo(dT) (18 nt), 20 µM UTP có pha trộn với [ -32P] UTP (0,4 µCi/nmol), µM FMDV RdRp tái tổ hợp Phản ứng ủ khoảng thời gian khác (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120 phút) 30°C Sản phẩm phản ứng phân tích sắc ký mỏng TCL (Thin Chromatography Layer) Sản phẩm tạo thành quan sát việc nhận diện tín hiệu thơng qua thơng qua thiết bị Cyclone phosphorimager (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) 2.2.2 Xác định hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp tái tổ hợp phƣơng pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ Hoạt tính RNA polymerase xác định thông qua khả tổng hợp chuỗi RNA polynucleic acid phương pháp đồng vị phóng xạ thể gel điện Hoạt tính RNA polymerase kiểm tra mơi trường phản ứng có chứa 25 mM Tris–HCl (pH 7,8), 2,5 mM MgCl2, mM DTT, 20 U/ml chất ức chế RNase, 0,1 µM mạch khn poly(rA) bắt cặp với µM mồi DNA oligo(dT) (18 nt), 200 µM UTP có pha trộn với [ -32P] UTP (0,4 µCi/nmol) µM FMDV RdRp tái tổ hợp Phản ứng ủ nhiệt độ 30°C 60 phút ngừng dung dịch quenching buffer có chứa 100 mM EDTA pH 8,0, 0,4% sodium dodecyl sulfate, 20% glycerol, 0,1% bromophenol blue, 0,1% xylene cyanol Hỗn hợp sau phản ứng kiểm tra điện di gel polyacrylamide không biến tính 15% (PAGE) nhận diện tín hiệu thơng qua thiết bị PhosphorImager Các phản ứng đối chứng thực tương tự điều kiện khơng có enzyme FMDV RdRp khơng có mạch khn RNA poly(rA) Sản phẩm tạo thành RNA có kích thước lớn [ -32P] UTP cho tín hiệu vạch di chuyển chậm sau trình điện di 2.2.3 Xác định hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp tái tổ hợp phƣơng pháp so màu quang phổ Hình 1: Sơ đồ kiểm tra hoạt tính RNA polymerase theo phương pháp so màu quang phổ (A) Sơ đồ phản ứng RNA polymerase theo phương pháp so màu (B) Trình tự phản ứng dị tìm tổng hợp RNA RdRp theo phương pháp so màu thông qua hình thành gốc phosphate với thuốc thử malachite green molypdate © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 68 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY-CHÂN-MIỆNG (FMDV) Sự tổng hợp RNA enzyme RNA polymerase giải phóng pyrophosphate (PPi) việc thêm vào phản ứng enzyme pyrophosphatase phân hủy pyrophosphate để hình thành gốc phosphate (Pi) Do đó, xác định hàm lượng phosphate tạo thành gián tiếp xác định hoạt tính RNA polymerase [18] Như vậy, phương pháp so màu sử dụng để xác định hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp trải qua giai đoạn: (a) tổng hợp RNA giải phóng pyrophosphate (PPi); (b) phân hủy PPi thành phosphate (Pi) (hình 1A) Hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp tái tổ hợp thực môi trường phản ứng có chứa 25 mM Tris–HCl (pH 7,8), 2,5 mM MgCl2, mM DTT, 20 U/ml chất ức chế RNase, µM Pyrococcus PPase, mạch khn poly(rA) bắt cặp với mồi DNA oligo(dT) (18 nt), 200 µM UTP FMDV RdRp tái tổ hợp Phản ứng ủ nhiệt độ 30°C khoảng thời gian định Sau thời gian ủ, hỗn hợp phản ứng đốt nóng 70°C phút để ngừng phản ứng Thuốc thử malachite green - molypdate (100 µl) thêm vào 25 µl hỗn hợp phản ứng để hình thành phức hợp phosphomolypdate hấp thụ bước sóng 650 nm [18, 19] (hình 1B) 10 ul hỗn hợp sau phản ứng điện di gel polyacrylamide khơng biến tính 15% (PAGE) quan sát sản phẩm tạo thành sau nhuộm với SYBR Gold 2.2.4 Kiểm tra hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp tái tổ hợp điều kiện khác Hoạt tính enzyme kiểm tra điều kiện khác thực phản ứng nêu thay đổi yếu tố tương ứng Nồng độ enzyme FMDV RdRp thực phản ứng với nồng độ khác 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 µM Ảnh hưởng hàm lượng mồi lên tổng hợp RNA polymerase kiểm tra với 0,1 µM (20 g/ml) mạch khn poly(rA) bắt cặp với hàm lượng mồi DNA oligo (dT) (18 nt) khác 0, 0,2, 1, 2, 4, 6, 8, 10 g/ml (tương ứng với nồng độ 0, 0,04, 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, µM) Nồng độ chất mạch khn RNA ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, đó, hoạt tính enzyme kiểm tra phản ứng có thay đổi nồng độ chất mạch khuôn poly(rA) bắt cặp với mồi DNA oligo(dT) (18 nt) hàm lượng khác 0, 5, 7,5, 10, 20, 30, 40, 60 g/ml (tương ứng với nồng độ 0, 0,025, 0,037, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3 µM) Thời gian phản ứng kiểm tra cách ủ hỗn hợp phản ứng khoảng thời gian khác 0, 10, 20, 30, 45, 60, 75, 90 phút Nồng độ chất UTP khảo sát phản ứng tương tự với thay đổi nồng độ UTP (0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 300 uM) Yếu tố ức chế hoạt động RNA polymerase kiểm tra với nồng độ khác 3'-Deoxy-5-Methyluridine-5'Triphosphate – DMUT (0, 1, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200 µM) 60 phút 30°C Hỗn hợp sau phản ứng kiểm tra hàm lượng phosphate tạo thành phương pháp so màu với thuốc thử malachite green - molypdate 2.2.4 Phân tích số liệu Các số liệu thu nhận từ phản ứng thực nghiệm sau lần lặp lại phân tích thơng qua phần mềm Prism để xác định giá trị Vmax, km, kcat theo phương trình Mechaelis Menten v=Vmax*x/(km + x) với x nồng độ chất tham gia phản ứng; kcat = Vmax/[E] với E nồng độ enzyme tham gia phản ứng; kobs (hằng số tốc độ phản ứng) theo công thức y = Y max(1- e-kx) với k số tốc độ phản ứng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tinh FMDV RdRp tái tổ hợp Vi khuẩn E coli BL21 mang gen mã hóa enzyme RNA polymerase phụ thuộc mạch khuôn RNA vius gây bệnh tay chân miệng (FMDV RdRp) kiểm tra khả biểu điều kiện nhiệt độ khác khoảng thời gian khác Dịch vi khuẩn sau thời gian biểu thu nhận tinh sắc ký lực Sản phẩm protein tinh phân tích gel SDS-PAGE để kiểm tra khả biểu (hình 2A) Kết phân tích cho thấy protein FMDV RdRp tái tổ hợp với trọng lượng phân tử dự đoán khoảng 52,7 kDa thể điều kiện khảo sát, điều kiện nhiệt độ 16°C khơng phù hợp cho biểu protein với vạch lượng protein tạo không cao sau 16 nuôi ủ Nhiệt độ 37°C cho thấy biểu hàm lượng protein đáng kể sau 16 giờ, nhiên, kết biểu protein tốt quan sát thấy nhiệt độ 28°C thời gian cần thiết cho biểu protein 16 Do đó, nhiệt độ 28°C thời gian 16 chọn cho việc biểu protein FMDV RdRp tái tổ hợp © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY-CHÂN-MIỆNG (FMDV) 69 Hình 2: Kết tinh enzyme FMDV RNA dependent RNA polymerase (FMDV RdRp) (A) Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian cảm ứng lên biểu protein (B) Phân tích SDS-PAGE 12% enzyme FMDV RdRp sau tinh sắc ký lực Nickel 2+, 1-9 phân đoạn thu trình sắc ký lực Nickel2+ (C) Kết điện di SDS-PAGE 12% FMDV RdRp sau tiếp tục tinh với sắc ký lọc gel M thang chuẩn protein Protein FMDV RdRp tái tổ hợp biểu điều kiện thích hợp, tinh sắc ký lực sắc ký lọc gel Sản phẩm thu nhận cho phân tích SDS-PAGE 12% (hình 2B 2C) Sau trình tinh sắc ký lực, mức độ nhiễm tạp thấp (lane 2-5 hình 2B), nhiên kiểm tra hàm lượng cao, nhiễm tạp protein thể rõ rệt với diện nhiều protein khơng mong muốn, đó, protein cần tinh để thu nhận protein tốt Kỹ thuật sắc ký lọc gel sử dụng để tinh protein kết phân tích gel SDS-PAGE cho thấy diện vạch mong đợi không đáng kể Độ tinh sản phẩm protein FMDV RdRp tái tổ hợp đạt 98% sau kiểm tra phần mềm gel analyzer Độ tinh protein ảnh hưởng đến phản ứng enzyme nhiễm tạp chất gây phản ứng khơng mong muốn enzyme Do dó, với độ tinh 98%, FMDV RdRp tái tổ hợp sử dụng nghiên cứu đặc tính enzyme 3.2 Kiểm tra hoạt tính tổng hợp RNA FMDV RdRp tái tổ hợp FMDV RdRp tái tổ hợp kiểm tra hoạt tính tổng hợp RNA phản ứng có chứa mạch khuôn poly(rA) (~600 nt) bắt cặp với mồi DNA oligo(dT) (18 nt) với diện [-32P] UTP (0,4 µCi/nmol) Hoạt tính tổng hợp RNA FMDV RdRp tái tổ hợp quan sát thông qua sản phẩm tạo thành sau trình điện di gel polyacrylamide khơng biến tính 15% (PAGE) có chứa tín hiệu phóng xạ [-32P] UTP Tuy nhiên, để đảm bảo FMDV RdRp tái tổ hợp không bị tạp nhiễm enzyme phân hủy khác, khả phân giải UTP kiểm tra quan sát kết thông qua phương pháp sắc ký mỏng (TCL) trình bày phía Phản ứng thực khoảng thời gian khác (0 – 120 phút) Kết quan sát TCL cho thấy FMDV RdRp tái tổ hợp khơng có khả phân hủy UTP (hình 3A), với sản phẩm quan sát khơng có thay đổi so với trước phản ứng (tại thời gian phút, hình 3A) Điều khẳng định điều kiện phản ứng bố trí cho việc kiểm tra hoạt tính RNA polymerase với mạch khn poly(rA) (~600 nt) không bị ảnh hưởng yếu tố khác Hỗn hợp phản ứng kiểm tra hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp sau thời gian phản ứng (60 phút) phân tích gel PAGE 15% cho thấy có diện sản phẩm RNA mong đợi điều kiện phản ứng có chứa enzyme mạch khuôn tương ứng, sản phẩm RNA không quan sát thấy phản ứng không chứa enzyme khơng chứa mạch khn (hình 3B) Kết thể hoạt tính tổng hợp RNA phụ thuộc RNA FMDV RdRp tái tổ hợp Như vậy, FMDV RdRp tái tổ hợp thu thích hợp để nghiên cứu cho đặc tính khả xúc tác enzyme thí nghiệm © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 70 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY-CHÂN-MIỆNG (FMDV) Hình 3: Hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp tái tổ hợp (A) Kiểm tra hoạt tính phân giải UTP FMDV RdRp sắc ký mỏng TCL (thin chromatography layer) (B) Kết kiểm tra hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp phân tích gel polyacrylamide khơng biến tính 15% (PAGE) 3.3 Xác định hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp tái tổ hợp Động học phản ứng FMDV RdRp tái tổ hợp kiểm tra theo phương pháp so màu quang phổ Điều kiện phản ứng với nồng độ enzyme khác (0, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 µM FMDV RdRp) kiểm tra để xác nhận nồng độ enzyme thích hợp cho kiểm tra động học enzyme Phản ứng thực 60 phút đo lượng Pi tạo thành sau phản ứng theo sơ đồ thể hình Kết cho thấy sản phẩm tổng hợp RNA tạo thành tăng dần theo gia tăng nồng độ enzyme RdRp phản ứng Kết phân tích gel PAGE cho thấy sản phẩm RNA tạo thành có diện enzyme sản phẩm tạo thành rõ rệt nồng độ enzyme tham gia phản ứng 2uM (Hình 4A) Phân tích với phần mềm Prism, nồng độ 2,5 µM RdRp cho kết đạt 50% hoạt tính tổng hợp RNA tối đa Do đó, nồng độ 2,5 µM enzyme RdRp sử dụng cho thí nghiệm để khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất mạch khuôn RNA thời gian lên hoạt tính enzyme Mạch khn RNA poly(rA) bắt cặp với mồi DNA oligo (dT) (18 nt) sử dụng để kiểm tra hoạt tính enzyme, hàm lượng mồi DNA oligo(dT) (18 nt) kiểm tra nồng độ khác 0,1 µM (20 µg/ml) trình bày Kết cho thấy hoạt tính tổng hợp RNA đạt cao hàm lượng mồi bắt cặp với mạch khuôn nồng độ µg/ml (Hình 4B) khơng quan sát thấy biểu hoạt tính khơng có kiện diện mồi Điều cho thấy phụ thuộc mồi enzyme trình biểu hoạt tính polymerase Sự gia tăng hàm lượng mồi cho thấy giảm hoạt tính tổng hợp RNA, nguyên nhân tự bắt cặp mồi với mạch khuôn hạn chế không gian phản ứng tổng hợp RNA Do đó, điều kiện nồng độ mồi µg/ml (tương ứng 1,2 µM) sử dụng để bắt cặp với 20 µg/ml (0,1 µM) RNA poly(rA) để tạo thành chất mạch khuôn RNA cho phản ứng tổng hợp RNA Hoạt tính RNA polymerase kiểm tra phản ứng có chất mạch khuôn RNA bắt cặp với mồi với nồng độ khác Phản ứng xác định sau 60 phút sản phẩm RNA tổng hợp quan sát sau q trình điện di gel khơng biến tính (PAGE) (Hình 4C) Phân tích với phần mềm Prism, kết cho thấy hoạt tính tổng hợp RNA cao mạch khn RNA đạt 20 µg/ml (tương ứng với 0,1 µM) Nồng độ RNA mạch khn sử dụng cho nghiên cứu tổng hợp RNA enzyme FMDV RdRp Khả tổng hợp UTP lên mạch khuôn RNA xác định phản ứng có chứa nồng độ chất UTP khác Phân tích với phần mềm Prism, theo phương trình Meachelis Menten, vận tốc phản ứng đạt cực đại giải phóng 84 µmol/mL.giờ phosphate (Pi) tương ứng với V max tổng hợp UTP 42 µmol/mL.giờ tổng hợp UTP giải phóng PPi tương ứng với gốc phosphate (Hình 4D) Giá trị km kcat xác định tương ứng với 13,6 µM 0,28 min-1 Ngồi giá trị thể cho khả kết nối xúc tác enzyme, tỷ lệ chuyển đổi chất quan tâm xác định động học enzyme, time-course FMDV RdRp xác định khoảng thời gian khác (0, 10, 20, 30, 45, 60, 75, 90 phút), sản phẩm RNA tạo thành quan sát gel PAGE hàm lượng Pi xác định phương pháp so màu (hình 4E) Phân tích với phần mềm Prism, số tốc độ phản ứng kobs xác định 0,022 min-1, kết © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY-CHÂN-MIỆNG (FMDV) 71 thu tương tự kết số tốc độ phản ứng xác định nghiên cứu Hanh Thi Dieu Nguyen cộng sự, 2013 [18] Hình 4: Hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp tái tổ hợp (A) Ảnh hưởng nồng độ enzyme lên phản ứng RNA polymerase (B) Ảnh hưởng nồng độ primer lên tổng hợp RNA enzyme tái tổ hợp (C) Ảnh hưởng nồng độ chất mạch khuôn RNA lên phản ứng (D) Ảnh hưởng thời gian phản ứng lên trình tổng hợp RNA Kết phân tích sản phẩm phản ứng phương pháp điện di gel polyacrylamide khơng biến tính 15% (PAGE) quan sát sau nhuộm với SYBR Gold (các hình ảnh bên đồ thị) 3.4 Ảnh hƣởng chất ức chế lên hoạt tính tổng hợp RNA polymerase FMDV RdRp tái tổ hợp Hoạt tính RNA polymerase FMDV RdRp kiểm tra diện chất ức chế cho hoạt tính enzyme DMUT (3'-Deoxy-5-Methyluridine-5'-Triphosphate) có cấu trúc tương đồng với UTP chất ức chế cạnh tranh với UTP tham gia vào tổng hợp RNA FMDV RdRp, gắn DMUT vào mạch RNA ức chế việc tổng hợp mạch thiếu nhóm -OH đầu 3' cho việc tổng hợp [10] Hoạt tính RNA polymerase giảm dần theo tăng dần chất ức chế cạnh tranh DMUT hoạt tính cịn 51,2% nồng độ DMUT 100 µM cịn 42,8% nồng độ DMUT tăng lên 200 µM (Hình 5A) Phân tích với phần mềm Prism với nồng độ DMUT phản ứng khác nhau, kết cho thấy nồng độ DMUT để ức chế 50% hoạt tính RNA polymerase FMDV 26,79 µM (Hình 5B) Kết tương tự nghiên cứu trước với nồng độ c ch 50% l 37,3 àM [18] â 2020 Trng Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY-CHÂN-MIỆNG (FMDV) 72 Hình 5: Ảnh hưởng chất ức chế DMUT lên hoạt tính tổng hợp RNA polymerase RdRp điều kiện nồng độ khác (A) giá trị IC50 (B) KẾT LUẬN Virus gây bệnh tay chân miệng với nhiều kiểu gen khác nhau, gây bệnh nhiều đối tượng động vật khác nhau, đặc biệt động vật móng guốc, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế ngành chăn nuôi Hiện nay, vaccine đa hiệu cho việc phòng ngừa chưa chứng nhận mục tiêu để kiểm sốt virus enzyme có vai trị quan trọng nhân lên virus RNA polymerase phụ thuộc RNA - RdRp Việc nghiên cứu đặc tính sinh hóa RdRp góp phần hiểu rõ hoạt động enzyme chu trình sống virus hỗ trợ việc sàng lọc loại thuốc tiềm cho việc phòng ngừa điều trị bệnh Để xác định đặc tính sinh hóa RdRp, protein RdRp tái tổ hợp FMDV biểu tinh với kết tinh 98% Hoạt tính enzyme điều kiện nồng độ mồi khác cho thấy hoạt tính tổng hợp RNA phụ thuộc mồi enzyme giá trị động học enzyme xác nhận Các giá trị Vmax, km, kcat, kobs enzyme tính toán Các giá trị IC50 chất ức chế cạnh tranh DMUT xác định Kết đạt tạo sở cho việc sàng lọc loại thuốc tiềm tương lai LỜI CẢM ƠN Kết nghiên cứu thực phịng thí nghiệm Nucleic Acid Biochemistry phịng thí nghiệm Global, đại học Konkuk, Seoul, Hàn Quốc Do đó, tơi xin chân thành cảm ơn giáo sư Kang LinWoo, giáo sư Kim Dong-Eun tạo điều kiện thuận lợi cho thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Alexandersen, S and N Mowat, Foot-and-mouth disease: host range and pathogenesis Curr Top Microbiol Immunol, 2005 288: p 9-42 Ellingham, M., et al., Selection and characterization of RNA aptamers to the RNA-dependent RNA polymerase from foot-and-mouth disease virus RNA, 2006 12(11): p 1970-9 Du, J., et al., Effective inhibition of foot-and-mouth disease virus (FMDV) replication in vitro by vector- delivered microRNAs targeting the 3D gene Virol J, 2011 8: p 292 Li, C., et al., Foot-and-mouth disease virus type O specific mutations determine RNA-dependent RNA polymerase fidelity and virus attenuation Virology, 2018 518: p 87-94 Grubman, M.J and B Baxt, Foot-and-mouth disease Clin Microbiol Rev, 2004 17(2): p 465-93 Knowles, N.J and A.R Samuel, Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus Virus Res, 2003 91(1): p 65-80 Mason, P.W., M.J Grubman, and B Baxt, Molecular basis of pathogenesis of FMDV Virus Res, 2003 91(1): p 9-32 © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY-CHÂN-MIỆNG (FMDV) 73 Paton, D.J., et al., Selection of foot and mouth disease vaccine strains a review Rev Sci Tech, 2005 24(3): p 981-93 Grubman, M.J., Development of novel strategies to control foot-and-mouth disease: marker vaccines and antivirals Biologicals, 2005 33(4): p 227-34 10 Durk, R.C., et al., Inhibitors of foot and mouth disease virus targeting a novel pocket of the RNA-dependent RNA polymerase PLoS One, 2010 5(12): p e15049 11 Ryan, M.D., G.J Belsham, and A.M King, Specificity of enzyme-substrate interactions in foot-and-mouth disease virus polyprotein processing Virology, 1989 173(1): p 35-45 12 De Clercq, E., Strategies in the design of antiviral drugs Nat Rev Drug Discov, 2002 1(1): p 13-25 13 Menendez-Arias, L., Mechanisms of resistance to nucleoside analogue inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase Virus Res, 2008 134(1-2): p 124-46 14 Saez-Alvarez, Y., et al., Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs Sci Rep, 2019 9(1): p 5397 15 Smertina, E., et al., Calicivirus RNA-Dependent RNA Polymerases: Evolution, Structure, Protein Dynamics, and Function Front Microbiol, 2019 10: p 1280 16 Cristina Ferrer-Orta, A.A., Rosa Perez-Luque, Cristina Escarmis, Esteban Domingo, Nuria Verdaguer, Structure of Foot-and-Mouth Disease Virus RNA-dependent RNA Polymerase and Its Complex with a TemplatePrimer RNA JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2004 279(45): p 47212–47221 17 Hanh Thi Dieu Nguyen, N.-A.N., Gia-Buu Tran,Tan-Viet Pham, The DEAD-box protein CshA in Staphylococcus aureus contains ATP-independent DNA strand annealing and exchange activities Journal of Sciences and Technology-Industrial University in Ho Chi Minh City, 2019 (in press) 18 Nguyen, H.T.D., An efficient colorimetric assay for RNA synthesis by viral RNA-dependent RNA polymerases, using thermostable pyrophosphatase Analytical biochemistry, 2013 v 434(no 2): p pp 284-2862013 v.434 no.2 19 Feng, J., et al., An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application Anal Biochem, 2011 409(1): p 144-9 Ngày nhận bài: 30/12/2019 Ngày chấp nhận đăng: 25/02/2020 © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh ...66 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY- CHÂN-MIỆNG (FMDV) thực để tìm loại thuốc cho việc phòng ngừa điều trị bệnh tay chân miệng. .. Hồ Chí Minh TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY- CHÂN-MIỆNG (FMDV) 69 Hình 2: Kết tinh enzyme FMDV RNA dependent RNA polymerase. .. Thành phố Hồ Chí Minh 68 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA RNA POLYMERASE PHỤ THUỘC RNA (RdRp) TỪ VIRUS GÂY BỆNH TAY- CHÂN-MIỆNG (FMDV) Sự tổng hợp RNA enzyme RNA polymerase giải phóng