Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày quá trình tinh sạch và một số tính chất của Enzim thủy phân Fibrin được tách chiết từ loài giun quế. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
28(3): 77-82 Tạp chí Sinh học 9-2006 Tinh xác định số tính chất enzim thủy phân fibrin đợc tách chiết từ loài giun quế (Perionyx excavatus) Lý Thị Bích Thủy, Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Dao Viện Công nghệ sinh học Trên giới, số ngời chết bệnh tim mạch ngày tăng thay đổi môi trờng nh lối sống, nớc phát triển Bệnh tim mạch có nhiều thể khác nh: chứng tràn máu não, tăng huyết áp, xơ cứng động mạch Nguyên nhân chủ yếu fibrin bị đóng cục, gây tắc mạch cản trở lu thông máu Vì vậy, việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng việc điều trị bệnh tim mạch Trớc đây, để điều trị bệnh nghẽn mạch, ngời ta dựa vào việc sử dụng chất kháng đông nh heparin coumarin Ngày nay, ngời ta phát cách tốt để điều trị bệnh nghẽn mạch sử dụng enzim thủy phân fibrin Urokinaza chất hoạt hóa plasminogen đợc sử dụng rộng rãi việc xử lý tắc mạch Tuy nhiên, chúng đắt không hiệu uống qua đờng miệng Từ phát nhà khoa học Nhật Bản Trung Quốc enzim thủy phân fibrin mạnh có loài giun ®Êt Lumbricus rubellus vµ Eisenia foetida [6, 7, 10], chóng đặt vấn đề tìm kiếm Việt Nam loài giun đất có enzim thủy phân fibrin mạnh Vì thế, khảo sát hoạt tính số loài giun đất Việt Nam chọn đợc loài giun có hoạt tính cao loài giun quế, Perionyx excavatus [5] Trong báo này, trình bày trình tinh số tính chất enzim thủy phân fibrin đợc tách chiết từ loài giun quế I phơng pháp nghiên cứu Đối tợng Loài giun quế Perionyx excavatus đợc lấy từ Trung tâm chăn nuôi Dê Thỏ Ba Vì, tỉnh Hà Tây Giun đợc lấy vào mùa hè, mùa giun sinh trởng phát triển mạnh Hóa chất Các hãa chÊt dïng cho thÝ nghiƯm ®Ịu ë møc ®é phân tích, bao gồm hóa chất sau: plasmin, thrombin, fibrinogen cđa h·ng Sigma (Mü), Na2HPO4 vµ NaH2PO4 hãng Fluka, maker protein Fermentas hóa chất cần thiết khác Phơng pháp tinh enzim Giun đất đợc rửa ngâm nớc cất để thải loại hết chất cặn bã đờng tiêu hóa Chỉ giun sống đợc sử dụng để nghiền NaCl 0,9% máy nghiền đồng thể; mẫu đợc đặt đá Dịch nghiền đồng thể đợc ly tâm 20.000 v/phút 60 phút 4C thu dịch Dịch đợc đông khô bảo quản tủ lạnh -84C để dùng trình thí nghiệm Khi tách chiết, bột giun đông khô đợc hòa đệm phốtphát natri 50 mM, pH 7,5 Muối sun-phát amôn đợc cho vào dịch enzim (trong đệm phốt-phát 50 mM, pH 7,5) để đạt nồng độ 35% bão hòa, để yên 1-2 (thỉnh thoảng khấy), sau ly tâm 10.000 v/phút 10 phút; loại tủa, tiếp tục bổ sung muối sun-phát amôn vào dịch để đạt nồng độ 60% bão hòa; ly tâm 10.000 v/phút 10 phút để thu tủa Tủa đợc hòa tan lại đệm cho qua cột lọc gel sephacryl S200, cột cân đệm phốt-phát natri 50 mM, pH 7,5 Tốc độ dòng chảy ml/phút, chia thành 120 phân đoạn, phân đoạn ml Các phân đoạn đợc xác định hoạt tính thủy phân fibrin hàm lợng protein; phân đoạn có hoạt tính riêng cao tiếp tục đợc tinh cột DEAE xen-lu-lô Dịch enzim đợc đa lên cột DEAE xen-lu-lô rửa protein không hấp phụ lần thể tích cột đệm Phần hấp phụ 77 lần lợt đợc đẩy khỏi cột gradien nồng ®é muèi NaCl biÕn thiªn tõ 0-1 M pha ®Ưm phèt-ph¸t natri 50 mM, pH 7,5 víi tèc ®é 0,5 ml/phút, thu 50 phân đoạn, thể tích phân đoạn ml Các phân đoạn đợc xác định hoạt tính thủy phân fibrin, phân đoạn có hoạt tính cao đợc tiếp tục tinh cột superdex G75 Cột đợc cân đệm phốt-phát natri 50 mM, pH 7,5, tốc độ dòng chảy 0,3 ml/phút, thu 50 phân đoạn, thể tích phân đoạn 0,5 ml Các phân đoạn có hoạt tính cao đợc thu lại bảo quản -20oC Quá trình tách chiết đợc thực 4oC - Xác định hoạt tính thủy phân fibrin: Hoạt tính đợc xác định theo phơng pháp đĩa fibrin ASTRUP MULLERTZ (1952) sử dụng plasmin làm chuẩn [1] enzim tập trung đỉnh sắc ký đồ (từ phân đoạn 25 đến 30) kDa 116 66,2 45 35 25 18,4 14,4 - Xác định hàm lợng protein: Hàm lợng protein đợc xác định theo phơng pháp Bradford (1976) [2] - Xác định trọng lợng phân tử tơng đối: Trọng lợng phân tử tơng đối enzim đợc xác định theo phơng pháp điện di protein gel polyacrylamit 12,5% Laemmli (1970) [4] so sánh với thang protein chuẩn - Xác định yếu tố ảnh hởng đến hoạt tính enzim: nhiệt độ, pH, ion kim loại, EDTA cách so sánh hoạt tính thủy phân fibrin mẫu enzim điều kiện khác (nhiệt độ, pH, nồng độ ion kim loại, nồng độ EDTA) - Xác định thành phần axit amin: Thành phần axit amin enzim tinh đợc xác định máy phân tích axit amin tự động HP Amino Quant Series II (Hewlett Packard) Ii Kết thảo luận Tinh enzim thủy phân fibrin Dịch nghiền đồng thể giun quế, sau ly tâm, đợc tủa phân đoạn (NH4)2SO4 với nồng độ 35 - 60%, thu đợc dịch enzim có hoạt tính riêng tăng 2,6 lần (bảng 1) Dịch enzim đợc cho qua cột sephacryl S200 với tốc độ dòng chảy ml/phút, thu 120 phân đoạn, thể tích phân đoạn ml Việc xác định hoạt tính phân đoạn cho thấy hoạt tính 78 Hình Điện di đồ dịch protein gel polyacrylamit 12,5% (1) dịch thô; (2) đỉnh cột sephacryl S200; (3) thị phân tử protein; (4) đỉnh cột DEAE xen-lu-lô; (5) đỉnh cột DEAE xen-lu-lô Điện di đồ hình cho thấy đỉnh (cột hình 1) có nhiều băng protein Vì vậy, phân đoạn đỉnh đợc tiếp tục cho qua cột DEAE xen-lu-lô Cột đợc cân đệm phốt-phát natri 20 mM, pH 7,5, tốc độ dòng chảy 0,5 ml/phút Sau đa mẫu lên cột rửa protein không bám, tiến hành thu mẫu Gradient nồng độ muối từ 0% dung dịch B (đệm phốt-phát natri 50 mM, pH 7,5, NaCl 1M) đến 100% dung dịch đệm B; thu 50 phân đoạn, thể tích phân đoạn ml Việc kiểm tra hoạt tính thủy phân fibrin phân đoạn thu đợc cho thấy hoạt tính tập trung chủ yếu đỉnh 3, tơng ứng khoảng 80% dung dịch B Đỉnh (cột hình 1) có băng protein có trọng lợng phân tử khoảng 25-35 kDa Hoạt tính riêng đỉnh 207,3 UI Đỉnh đợc tiếp tục phân tách theo trọng lợng phân tử cột lọc gel superdex G75 Mẫu đợc đa lên cột với đệm phốt-phát natri 20 mM, pH 7,5, tốc độ dòng chảy 0,3 ml/phút; thu 50 phân đoạn, thể tích phân đoạn 0,5 ml Hình Sắc ký đồ cột superdex G75 Sắc ký đồ thể hình cho thấy protein đợc phân tách thành đỉnh phân biệt rõ ràng Qua kiểm tra hoạt tính thủy phân fibrin đỉnh, thấy đỉnh có hoạt tính riêng cao (271,3 UI/mg), đỉnh có hoạt tính thủy phân fibrin cao nhng thấp đỉnh 1(126 UI/mg) kDa 116 66,2 45 35 34 28 25 18,4 14,4 Hình Điện di đồ dịch enzim tinh (1) thị phân tử protein; (2) dịch enzim đỉnh 2; (3) dịch enzim đỉnh 1; (4) dịch enzim trớc chạy qua cột superdex G75 Chúng đánh giá mức độ tinh xác định trọng lợng phân tử tơng đối phơng pháp điện di gel polyacrylamit 12,5%, sử dụng thị phân tử protein hãng Fermentas làm chuẩn Điện di đồ hình cho thấy enzim thu đợc Đỉnh có băng protein khoảng 34 kDa; đỉnh có băng protein khoảng 28 kDa So với enzim lumbrokinaza mà nhà khoa học Nhật Bản tách chiết từ loài giun Lumbricus rubellus [6, 7] enzim mà tách chiết đợc có trọng lợng phân tử hoạt tính xấp xỉ (lumbrokinaza có trọng lợng phân tử 29,66 24,66 tơng ứng với hoạt tính 204 223 UI) Nh vậy, từ dịch protein ban đầu có hoạt tính riêng 20,5 UI, tinh đợc enzim có trọng lợng phân tử khoảng 34 kDa 28 kDa, với hoạt tính riêng tơng ứng 271,3 UI 126 UI Mẫu enzim tinh (đỉnh 1) đợc xác định thành phần axit amin máy phân tích axit amin tù ®éng HP Amino Quant Series II (Hewlett Packard) Kết cho thấy enzim tinh có loại axit amin nhiỊu nhÊt lµ axit aspartic (17%) Theo Mihara vµ cs., thành phần axit amin lumbrokinaza chứa nhiều axit aspartic [3] 79 Các bớc tinh enzim thđy ph©n fibrin ThĨ tÝch (ml) 50 14 10 2 Các bớc tinh Dịch thô Tủa sun-phát amôn Sephacryl S200 (đỉnh 2) DEAE xen-lu-lô (đỉnh 3) §Ønh Superdex G75 §Ønh Protein tæng (mg) 500 153 45,2 19 5,5 9,3 Ho¹t tÝnh tỉng (UI) 10250 8048 4457 3939 1492 1172 Hoạt tính riêng (UI/mg) 20,5 52,6 98,6 207,3 271,3 126 Độ tinh 2,6 4,8 10,1 13,2 6,1 HiÖu suÊt (%) 100 78 43 38 26 Ghi chó: hiƯu st tÝnh theo ho¹t tÝnh Hoạt tính tơng đối (%) a ảnh hởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính enzim 150 100 50 0 10 20 30 40 50 60 70 Nhiệt độ (oC) Hình ảnh hởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính enzim Dịch enzim đệm phốt-phát natri 50 mM, pH 7,5 đợc ủ đĩa fibrin nhiệt độ khác 20C-60C đo diện tích vòng phản ứng sau ủ để xác định hoạt tính tơng đối Khi nhiệt độ phản ứng tăng từ 20C lên 35C hoạt tính thủy phân fibrin tăng dần lên (hình 4) Hoạt tính enzim đạt cao nhiệt độ 35C đến 45C (100%) Khi nhiệt độ tăng lên 45C hoạt tính enzim giảm dần xuống 65C So với hoạt tính nhiệt độ tối u, hoạt tính 65C giữ đợc 72% Nh vậy, nhiệt độ hoạt động tối u enzim thủy phân fibrin 35C-45C b ảnh hởng nhiệt độ đến độ bền enzim 80 Để nghiên cứu tính bền nhiệt enzim, dịch enzim đệm phốt-phát natri 50 mM, pH 7,5 đợc ủ nhiệt độ 40, 50, 60, 70 80C, khoảng thời gian 10, 20, 30, 40, 50 60 phút Hoạt tính lại đợc xác định phơng pháp đĩa fibrin sau ủ Hoạt tính tơng đối (%) Các yếu tố ảnh hởng đến hoạt tÝnh cña enzim 120 100 80 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60 70 Thêi gian (phút) Hình ảnh hởng nhiệt độ đến độ bỊn cđa enzim 40°C; 50°C; ∆ 60°C; 70°C; 80°C ë nhiƯt ®é 40°C, diƯn tÝch cđa vòng phản ứng cao (100%) không thay đổi với khoảng thời gian (hình 5) nhiệt độ 50C 60C, hoạt tính enzim có giảm dần giảm nhanh theo thời gian nhiệt độ 60C (còn 65% hoạt tính sau thời gian ủ 60 phút) nhiệt độ 70C, hoạt tÝnh cđa enzim vÉn cßn 20% sau 60 đ nhng 80C hoạt tính enzim nhiều sau 30 phút (còn 9%) hoàn toàn sau 50 phút Nh vậy, so với enzim khác biết enzim thủy phân fibrin tách từ loài giun quế tơng đối bền với nhiệt độ c ảnh hởng pH đến độ bền enzim Hoạt độ tơng đối % Dịch enzim đợc nhỏ lên đĩa fibrin đệm phốt-phát natri khác có pH khoảng 5,5-8,5; ủ nhiệt độ 50o, 60o, 70o 80C Hoạt tính enzim đợc thể diện tích vòng phản ứng 120 100 80 60 40 20 Một chất kìm hãm đặc hiệu enzim có nhóm ngoại mang ion kim loại EDTA Chúng nghiên cứu ảnh hởng EDTA (với nồng độ khác từ 1-10 mM) đến hoạt tính enzim Kết thí nghiệm cho thấy hoạt tính thủy phân fibrin enzim không thay đổi so với ban đầu (dịch enzim không đợc bổ sung EDTA) tất nồng độ EDTA khoảng Nh vậy, EDTA tác dụng kìm hãm enzim enzim thủy phân fibrin tách chiết đợc không thuộc nhóm enzim có kim loại Kết gợi ý rằng, bổ sung EDTA vào dịch enzim trình tách chiết để ức chế proteaza kim loại Iii Kết luËn 5,5 6,5 7,5 8,5 pH Hình ảnh hởng pH đến độ bền cña enzim 50°C; 60°C; ∆ 70°C; 80°C nhiệt độ 50C, hoạt tính enzim mạnh khoảng pH 7-7,5 giảm dần khoảng pH (hình 6) Khi ủ 60C hoạt tính enzim lại khoảng pH từ đến 8,5; ủ 70C hoạt tính cđa enzim vÉn cßn víi pH 6,5-7,5; đ ë 80°C hoạt tính enzim lại (7%) với pH trung tính bị hoàn toàn với khoảng pH kiềm axit Điều chứng tỏ enzim bỊn ë kho¶ng pH trung tÝnh d ¶nh h−ëng ion kim loại EDTA đến hoạt tính enzim Để đánh giá ảnh hởng ion kim loại đến hoạt tính thủy phân fibrin, dịch enzim đợc thêm vào ion kim loại khác với nồng ®é 2-10 mM, ë nhiƯt ®é phßng 30 phót, xác định hoạt tính Kết nhận đợc nh sau: Ion Ca2+ với nồng độ 2,5 mM không làm thay đổi hoạt tính enzim; nồng độ 10 mM, hoạt tính enzim tăng nhẹ (10%) Các ion kim loại Mg2+, Co2+, Fe3+ Ni2+ không ảnh hởng đến hoạt tính enzim Các ion kim loại Pb2+, Cu2+ Zn2+ ức chế mạnh (hoạt tính 60-40%) nồng độ 2-10 mM Hg2+ ức chế hoạt tính enzim mạnh nhất, hoạt tính 30-40% nồng độ 2,5 mM ức chế hoàn toàn nồng độ 10 mM Chúng xác định đợc quy trình thích hợp để tách chiết enzim có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ loài giun quế Perionyx escavatus Quy trình gồm bớc chính: kết tủa phân đoạn muối sun-phát amôn, qua cột lọc gel sephacryl S200, cột trao đổi anion DEAE xenlu-lô cột lọc gel superdex G75 Thực quy trình tách chiết này, thu đợc enzim có trọng lợng phân tử khoảng 34 28 kDa, tơng ứng với hoạt tính 271 126 UI Kết xác định thành phần axit amin cho thấy enzim giàu axit aspartic (17%) Đây enzim bền với nhiệt, với nhiệt độ tối u 35C-45C; enzim hoạt động khoảng pH rộng bền pH trung tính; enzim không bị kìm hãm EDTA, đợc kích thích nhẹ Ca2+, bị kìm hãm ion Zn2+, Cu2+, Fe3+, Pb2+ bị kìm hãm mạnh ion Hg2+ Tài liệu tham khảo Astrup T., Mullertz S., 1951: Arch Biosci Biochem Biophys., 40: 346-351 Bradford M M., 1976: Anal Biochem., 72: 248-254 Mihara H et al., 1991: Jpn J Physiol., 41: 461-472 Laemmli U K., 1970: Nature, 227: 680-685 Lý ThÞ BÝch Thủy, Nguyễn Trờng Giang, Nguyễn Thị Ngọc Dao, 2003: Những vấn đề nghiên cứu khoa học sèng: 531-534 Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt Hµ Néi 81 Nakajima N., Mihara H., Sumi H., 1993: Biosci Biotechnol Biochem., 57: 17261730 Sumi H., Nakajima N., Mihara H A., 1993: Comp Biochem Physiol., 106: 763766 Th¸i Trần Bái, Nguyễn Văn Cảnh, 2004: Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống: 31-34 Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Thị Hồng Thúy, Nguyễn Trần Giáng Hơng, 2003: Tạp chí Dợc häc, 325: 17-19 10 Zhou Y C., Zhu H., Chen Y C., 1988: Acta Biochim Biophys Sin., 20: 35-42 Purification and identification of some characters of the fibrinolytic enzyme isolated From the earthwom Perionyx excavatus Ly Thi Bich Thuy, Do Thi Tuyen, Nguyen Thi Ngoc Dao Summary A strong fibrinolytic enzyme was isolated and purified from an earthworm of Vietnam: Perionyx excavatus The purification procedure was described as follows: the earthworms were washed to remove the attached mud and then were left to evacuate the casts from their alimentary tract in distilled water The living earthworms were homogenized in 0.9% NaCl The homogenate was centrifuged at 20.000 rmp/min for one hour The obtained supernatant was precipitated with a 35% and then 60% saturation of ammonium sulfate The resultant precipitate was dissolved in the 0.02 M sodium phosphate buffer, pH and subjected on the sephacryl S200 gel filtration column The strongest fibrinolytic fraction was further fractionated by the column chromatography on DEAE cellulose and then on the superdex G75 gel filtration column The particular activities of two obtained enzymes were 271 and 126 IU/mg and theirs molecular weights were 34 and 28 kDa, respectively The obtained enzymes were heat-stable and had broad pH range; the optimum temperature was at range 35oC – 45oC and the optimum pH was at range 7-7.5 Ngµy nhËn bµi: 27-6-2005 82 ... hoạt tính enzim mạnh nhất, hoạt tính 30-40% nồng ®é 2,5 mM vµ øc chÕ hoµn toµn ë nång độ 10 mM Chúng xác định đợc quy trình thích hợp để tách chiết enzim có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ loài. .. Nh vậy, so với enzim khác biết enzim thủy phân fibrin tách từ loài giun quế tơng đối bền với nhiệt độ c ảnh hởng pH đến độ bền enzim Hoạt độ tơng đối % Dịch enzim đợc nhỏ lên đĩa fibrin đệm phốt-phát... Quá trình tách chiết đợc thực 4oC - Xác định hoạt tính thủy phân fibrin: Hoạt tính đợc xác định theo phơng pháp ®Üa fibrin cđa ASTRUP vµ MULLERTZ (1952) sư dơng plasmin làm chuẩn [1] enzim tập