Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus, an toàn trong thực phẩm, sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh sạch, xác định một số, đặc tính của enzyme
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP HỌC VIỆN Tên đề tài: “Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus an toàn thực phẩm sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme” Mã số : T2017-08-57 Người chủ trì : TS Nguyễn Hồng Anh Thời gian thực : Tháng 3/2017 –Tháng 3/2018 Hà Nội 2018 DANH SÁCH Những người tham gia thực đề tài đơn vị phối hợp I Những người tham gia thực đề tài TS Nguyễn Hoàng Anh ThS Phạm Thị Dịu KS Nguyễn Thị Hồng SV Đặng Thị Nga (CNSH B, K58) SV Nguyễn Thị Diên (CNTP B, K60) SV Lê Thị Lan Anh (CNTP B, K60) II Đơn vị phối hợp i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v PHẦN THỨ NHẤT: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2.1 Mục đích .5 1.2.2 Yêu cầu - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme: ảnh hưởng nhiệt độ, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.2 Nội dung nghiên cứu 13 - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme: ảnh hưởng nhiệt độ, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme .13 3.3 Phương pháp nghiên cứu 13 4.1 Kết sàng lọc chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23 5.1 Kết luận 30 5.2 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Viết tắt Tên đầy đủ CATA CA EDPIM IPM JAR Check all that apply Correspondence Analysis Euclidean Distance Ideal Point Mapping Ideal profile method Just about right iii DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v PHẦN THỨ NHẤT: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2.1 Mục đích .5 1.2.2 Yêu cầu - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme: ảnh hưởng nhiệt độ, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.2 Nội dung nghiên cứu 13 - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme: ảnh hưởng nhiệt độ, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme .13 3.3 Phương pháp nghiên cứu 13 4.1 Kết sàng lọc chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23 4.1 Kết sàng lọc chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23 5.1 Kết luận 30 5.2 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 iv DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v PHẦN THỨ NHẤT: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2.1 Mục đích .5 1.2.2 Yêu cầu - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme: ảnh hưởng nhiệt độ, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.2 Nội dung nghiên cứu 13 - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme: ảnh hưởng nhiệt độ, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme .13 3.3 Phương pháp nghiên cứu 13 4.1 Kết sàng lọc chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23 4.1 Kết sàng lọc chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23 5.1 Kết luận 30 5.2 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 v vi TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP HỌC VIỆN Tên đề tài: Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus an toàn thực phẩm sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme Mã số: T2017-08-57 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Hoàng Anh Tel.: 0978973346 E-mail: hoanganhcntp@vnua.edu.vn Cơ quan chủ trì đề tài: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Cơ quan cá nhân phối hợp thực hiện: Thời gian thực hiện: Tháng 3/2017 –Tháng 3/2018 Mục tiêu: Mục tiêu chung Tuyển chọn định danh vi khuẩn Bacillus an toàn thực phẩm có khả sinh enzyme β- galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh xác định đặc tính enzyme Mục tiêu cụ thể - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus định danh sơ từ ngân hàng chủng cuả Khoa cơng nghệ thực phẩm có khả sinh enzyme β-galactosidase - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt - Định danh chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme: ảnh hưởng nhiệt độ, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme Nội dung chính: Nội dung 1: Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus định danh sơ từ ngân hàng chủng cuả Khoa cơng nghệ thực phẩm có khả sinh enzyme βgalactosidase Nội dung 2: Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt Nội dung 3: Định danh chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA Nội dung 4: Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme: ảnh hưởng nhiệt độ, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme Kết đạt (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế – xã hội,…) 3.1 Kết khoa học - Tuyển chọn 24 chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme β-galactosidase - Tuyển chọn 01 chủng Bacillus NT2.8 có khả bền nhiệt độ 60 oC (sau 50 ủ 60ºC hoạt độ enzyme 50,6% so với hoạt độ ban đầu ) Kết định danh phương pháp sinh học phân tử chùng Bacillus NT2.8 Bacillus flexus - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme β-galactosidase tử chủng Bacillus flexus NT2.8 - 01 báo đăng tạp chí Khoa học nông nghiệp Việt Nam 3.2 Kết đào tạo Hướng dẫn 01 sinh viên đại học, 01 nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tên đề tài: Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus an toàn thực phẩm sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme Mã số: T2017-08-57 Chủ nhiệm: TS Nguyễn Hoàng Anh Thời gian thực hiện: Tháng 3/2017 –Tháng 3/2018 Kinh phí thực hiện: 50 triệu đồng (tự túc) Cơ quan chủ trì: Học viện Nơng nghiệp Việt nam KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC Các sản phẩm đề tài - Tuyển chọn 24 chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme β-galactosidase - Tuyển chọn 01 chủng Bacillus NT2.8 có khả bền nhiệt độ 60 oC (sau 50 ủ 60ºC hoạt độ enzyme 50,6% so với hoạt độ ban đầu ) Kết định danh phương pháp sinh học phân tử chùng Bacillus NT2.8 Bacillus flexus - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme β-galactosidase tử chủng Bacillus flexus NT2.8 - 01 báo đăng tạp chí Khoa học nơng nghiệp Việt Nam Thông tin kết nghiên cứu đăng tải website Học viện Nông nghiệp Việt Nam (Website: www.vnua.edu.vn) Về bí cơng nghệ công nghệ sản phẩm Ứng dụng sản xuất hiệu kinh tế Ứng dụng sản xuất sản phẩm sữa chế biến từ sữa không lactose doanh nghiệp Đào tạo: Hướng dẫn 01 sinh viên đại học, 01 nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học Tình hình sử dụng kinh phí: hồn tất thủ tục thanh/quyết tốn với tổng kinh phí tự túc 50 triệu đồng năm 2017 Xác nhận quan chủ trì (ký, đóng dấu) Ngày tháng năm Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Nguyễn Hoàng Anh PHẦN THỨ NHẤT: ĐẶT VẤN ĐỀ 10X Taq Buffer : 2.5 µl µM 27F : µl µM 1492R : µl DNA template : µl Taq DNA pol : 0.3 µl H2 O : 17.5 µl Tổng thể tích phản ứng : 25 µl - Chu trình nhiệt 95ºC 95ºC phút 45 giây x1 vòng 56ºC phút x30 vòng 72ºC 72ºC phút 30 giây phút x1vòng 3.3.5.3 Chạy điện di * Chuẩn bị: - Dung dịch đệm TAE 0,5x - Bản gel: Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE0,5x sau lắc nhẹ lọ để hòa tan agarose Sau đun lò vi sóng – phút, bổ sung Ethidium Bromide theo tỷ lệ 100ml dung dịch gel cho 4µl, lắc đều, để lọ nhiệt độ phòng Khi dung dịch agarose 1% nằm khoảng 400C đổ vào khn có đặt lược tạo lỗ khn Để khn nhiệt độ phòng - Các tube chứa 0,5ml chứa sản phẩm PCR (đã đánh số thứ tự) cho vào tube 4µl loading Dye X6, đảo spin giây *Tiến hành - Sau 30 giây để khuôn nhiệt độ phòng tiến hành rút lược - Đặt khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 0,5x phủ ngập gel - Nhỏ mẫu vào giếng: dùng pipet hút - 10µl dung dịch mẫu cần chuẩn đoán cho vào giếng theo thứ tự Ngồi mẫu chạy PCR nhỏ thêm giếng marker làm chuẩn - Cắm nguồn điện cho máy điện di Đặt hiệu điện 100V 25 phút, tắt máy điện di, đặt gel kiểm tra ánh sáng tử ngoại Quan sát vệt DNA lên chụp ảnh 3.3.5.3 Giải trình tự chuỗi 16S RNA ribosome 18 Sản phẩm PCR tinh chiết từ gel agarose dùng kit tinh chiết PureLink TM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR tinh chiết giải trình tự trực tiếp mồi PCR hãng Firs-base, Malaysia 3.3.5.3 Phân tích trình tự Kết giải trình tự tự gene so sánh với trình tự gene công bố từ trước NCBI (The National Center for Biotechnology Information) nhờ phần mềm tìm kiếm BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 3.3.6 Tinh enzyme bằng (NH4)2SO4 Tiến hành tinh enzyme cách cho từ từ (NH 4)2SO4 bão hòa 30, 40, 50, 60 70% vào dịch ni cấy sau ly tâm khuấy cho tan hết Sau để kết tủa tủ 40C vòng ly tâm lấy tủa ( 6000 v/p 40C phút) Phần dịch tủa hòa tan đêm photphate pH = 6,5 Dịch enzyme β- galactosiase tinh dùng để xác định hoạt tính hoạt tính riêng từ xác định độ tinh enzyme hiệu suất thu hồi phương pháp (Nguyễn cs, 2006) Hoạt tính riêng enzyme đặc trưng cho độ tinh chế phẩm enzyme Hoạt tính riêng biểu thị số đơn vị enzyme/mg protein (U/mg protein) số đơn vị enzyme (hay hoạt tính enzyme U/ml) xác định theo phương pháp 3.3.3, tổng hoạt tính tính theo thể tích dịch enzyme cuối thu sau tinh muối (NH4)2SO4 Hàm lượng protein xác định theo phương pháp Bradford, protein tổng số tính theo thể tích dịch enzyme cuối thu sau tinh muối NH4)2SO4 3.3.7.Phương pháp định lượng protein tổng số phương pháp Bradford Phương pháp xác định protein tổng số theo Bradford, 1976 mô tả sau: Nguyên tắc: Phương pháp dựa thay đổi bước sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid chưa kết nối với protein thuốc nhuộm dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm kết hợp với protein thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương hấp thu cực đại bước sóng 595nm Tiến hành: Bước 1: Để xác định protein mẫu, ta xây dựng đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn biết trước nồng độ Dung dịch protein chuẩn sử 19 dụng bovine serum albumin (BSA) Sau cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu xuất phút bền tới Dựng đường chuẩn protein: Bảng 3.8 Pha dãy đường chuẩn protein Ống nghiệm BSA ( 1mg/ml)(µl) 80 60 Nước cất (µl) 20 40 Nồng độ BSA (mg/ml) 0.8 0.6 Hút từ ống nghiệm 25µl dịch protein chuẩn 40 20 10 60 80 90 0.4 0.2 0.1 vào ống nghiệm khác có chứa sẵn 1000µl thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue, lắc máy lắc vontex, để yên 20 phút bóng tối Sau 20 phút, tiến hành đo dung dich máy đo quang phổ kế bước sóng 595nm ta giá trị OD, độ hấp thu tỷ lệ với lượng protein mẫu Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (mg/ml) với mật độ quang Abs 595 ta phương trình tuyến tính y= ax + b Dựa vào đường tuyến tính y= ax + b ta tính lượng protein có mẫu thí nghiệm Kết : Đường chuẩn có phương trình y= 0.3161x + 0.0387, x giá trị BSA (mg/ml), y giá trị OD bước sóng 595 nm (hình 3.2) Hình 3.2 Đường chuẩn protein Bước 2: Mẫu thí nghiệm Các mẫu thí nghiệm làm tương tự, thay 25µl mẫu protein chuẩn 25µl mẫu thí nghiệm Lượng protein mẫu tính dựa vào phương trình đường chuẩn protein: 20 x = Trong đó: x: lượng protein mẫu (mg) y: OD595 đo mẫu 3.3.8 Phương pháp xác định đặc tính enzyme β- galactosidase 3.3.8.1 Xác định nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt enzyme β- galactosidase Xác định nhiệt độ tối thích enzyme β- galactosidase trình bày 3.3.3 điều kiện nhiệt độ khác (20, 30 0C, 370C, 400C, 500C, 550C, 600C, 650C, 700C, 750C, 800C) Các điều kiện thí nghiệm thời gian thí nghiệm phần 3.3.3 khác nhiệt độ phản ứng Sau xác định nhiệt độ tối ưu cho phản ứng thủy phân, tiến hành xác định độ bền nhiệt enzyme nhiệt độ tối ưu 60 0C, thời gian khác nhau, enzyme lấy để xác định hoạt tính Hoạt tính enzyme xác định phần 3.3.3 Thời gian kéo dài tới thời gian bán hủy enzyme (thời gian mà hoạt tính enzyme 50%) 3.3.8.2 Phương pháp xác định pH tối ưu độ bền pH Tiến hành thử nghiệm với mức pH từ đến đệm Britton- Robinson (40mM sodium citrate, 40mM sodium phosphate, 40mM borate, sử dụng NaOH 0,2M để chỉnh pH giá trị mong muốn) Hoạt tính enzyme xác định dựa vào cách xác định hoạt tính enzyme chuẩn phần 3.3.3 Độ bền pH xác định pH 3, 4, 5, 6, 7, 37 0C Tại thời điểm khác nhau, enzyme lấy để xác định hoạt tính, hoạt tính enzyme xá định phần 3.3.3 Thời gian kéo dài đến thờ gian bán hủy enzyme (thời gian mà hoạt tính enzyme 50%) 3.3.8.3 Phương pháp xác định ảnh hưởng cation kim loại đến hoạt tính enzyme β- galactosidase Các cation kim loại bổ sung vào chất oNPG đệm phosphate với nồng độ 5-15 mM, sau phản ứng tiến hành với phản ứng enzyme chuẩn phần 3.3.3 xác định hoạt tính enzyme β-glalactosidase Sự ảnh hưởng cation kim loại đến hoạt tính enzyme β-glalactosidase xác định cách so 21 sánh hoạt tính enzyme mẫu có cation khơng có cation thêm vào điều kiện Phản ứng thực có mặt cation Ca 2+, Cu2+, Fe2+, K+, Zn2+ 22 PHẦN THỨ TƯ – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết sàng lọc chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase Từ 160 chủng vi khuẩn Bacillus sử dụng nghiên cứu có 26 chủng vi khuẩn có khả thủy phân X-gal, tạo khuẩn lạc màu xanh, mức độ đậm nhạt màu sắc thời gian xuất màu xanh khuẩn lạc thể hình bảng Chủng có màu xanh đậm NT 2.8 Chủng có màu xanh nhạt NT 2.6 chủng khơng xuất màu xanh (NT2.9, DC3,TO2.5) Hình Màu khuẩn lạc thủy phân X-gal chủng minh họa (NT2.8, NT2.6, NT 2.9) Bảng Kết định tính thủy phân X-gal vi khuẩn Bacillus STT 10 11 12 13 Mức độ màu sắc NT2.6 + NT2.7 +++ NT2.8 ++++ DC1 +++ DC2 +++ DC6 ++ DC2.6 + DC4.8 + DC5.3 + TO1.1 +++ TO1.8 +++ TO2.4 + TO2.6 + Chú thích: DC, TO, NT mã hố lần Ký hiệu chủng STT 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 lượt Mức độ màu sắc TO2.10 + TO3.10 + TO4.5 ++ TO5.5 ++ TO6.1 ++ TO6.6 + TO7.1 + TO7.2 + TO7.3 + TO8.6 + TO9.9 + TO10.1 + TO10.6 + cho mẫu phân lập từ cỏ bò, Tên chủng tương ớt nước thải nhà máy sữa Kết bảng cho thấy 26 chủng có hoạt độ β-galactosidase có chủng NT2.7, NT2.8, DC1, DC2, TO1.1 TO1.8 cho màu xanh đậm coi 23 chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme β- galactosidase cao Chủng có màu sắc đậm chủng NT2.8 chủng sử dụng để tiếp tục xác định hoạt độ enzyme 4.2 Xác định hoạt độ enzyme β–galactosidase vi khuẩn Kết xác định hoạt độ β-galactosidase chủng thể bảng Bảng Kết xác định hoạt độ β-galactosidase ngoại bào chủng vi khuẩn STT Tên chủng NT2.8 NT2.7 DC1 DC2 TO1.1 TO1.8 U/L dịch nuôi 42.4 5.4 5.3 6.2 5.2 6.5 Kết bảng cho thấy chủng vi khuẩn chọn để xác định hoạt độ β-galactosidase chủng Bacillus NT2.8 cho hoạt độ cao, trội đạt 42.4 U/l Kết xác định khả sinh β-galactosidase phương pháp đĩa thạch có tương đồng với phương pháp xác định hoạt độ enzyme Chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 sử dụng cho nghiên cứu 4.3 Xác định đặc tính β-galactosidase từ chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 4.3.1 Xác định vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy phân có đặc tính chịu nhiệt Nhiệt độ có tác động mạnh mẽ tới độ bền enzyme, gây ảnh hưởng đến hoạt độ xúc tác enzyme Dịch enzyme thô ủ nhiệt độ 30oC, 50oC 60ºC vòng 50 giờ, thời gian giờ, giờ, giờ,… 50 enzyme thô lấy để xác định độ bền nhiệt mô tả mục 2.2.3 Kết thể hình 24 Hình Độ bền nhiệt β-galactosidase tử chủng Bacillus NT2.8 30, 50 60oC Kết hình so sánh độ bền enzyme nhiệt độ 30oC, 50oC 60oC Hoạt độ enzyme bền 30oC, giảm dần nhiệt độ tăng lên thấp 60oC Mặc dù vậy, kết cho thấy enzyme bền 60oC Cụ thể, sau ủ 60oC hoạt độ enzyme lại 80,3% so với hoạt độ ban đầu, hoạt độ enzyme giảm chậm suốt 50 ủ lại 50,6% so với hoạt độ sau 50 So sánh với nhiệt độ 50oC, hoạt độ enzyme 50 lại 71% cao so với hoạt độ enzyme nhiệt độ 60 oC Từ kết ta kết luận chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 có khả sinh enzyme β-galactosidase bền nhiệt độ nghiên cứu, kể 60oC Kết tương tự kết Chen W cs, 2008 nghiên cứu tính bền nhiệt β-galactosidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus stearothemophilus, 60ºC 50 hoạt độ enzyme giữ 50% so với hoạt độ ban đầu Nghiên cứu Shaikh SA cs, 1999 enzyme β-galactosidase sinh từ nấm ưa nhiệt Rhizomucor sp có khả bền nhiệt độ 60ºC vòng giờ, hoạt độ enzyme lại 50% so với ban đầu 2,5 Kết cho thấy βgalactosidase từ vi khuẩn Bacillus NT2.8 có khả bền nhiệt cao nhiều so với β-galactosidase từ Rhizomucor sp 4.4 Định danh chủng tuyển chọn phương pháp xác định định trình tự gen 16S rRNA Kết định tính, định lượng kiểm tra đặc tính enzyme cho thấy vi khuẩn Bacillus NT2.8 có khả sinh enzyme β-galactosidase cao, chịu nhiệt 60ºC Vì vậy, chủng tiếp tục định danh phương pháp sinh học phân tử 3.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số DNA tổng số sau tách chiết kiểm tra độ tinh cách chạy điện di agarose / 25 Hình Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối vi khuẩn chủng Bacillus NT2.8 Giếng số 1: Thang DNA chuẩn 100 bp DNA ladder, New England Biolabs Giếng số 2: DNA tổng số tinh Kết hình cho thấy mẫu tách chiết xuất vạch lớn so với thang DNA chuẩn, khẳng định DNA tổng số sạch, sử dụng cho chạy phản ứng PCR 4.4.2 Kết PCR với cặp mồi 27F/1492R Để định danh xác chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 phân lập từ nước thải nhà máy sữa, phản ứng PCR thực với cặp mồi 27F 1492R để nhân toàn vùng gen mã hóa tiểu phần 16S RNA ribosome Kết PCR thể hình Hình Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 26 Giếng số 1: Thang DNA chuẩn thang DNA chuẩn 100 bp DNA ladder, New England Biolabs Giếng số 2: sản phẩm PCR Kết PCR cho thấy mẫu vi khuẩn NT2.8 tạo băng sản phẩm ~ 1500bp dự kiến Sản phẩm PCR tinh sử dụng làm khn để giải trình tự gene 4.4.3 Kết xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA Trình tự thu từ vùng gen mã hóa 16S rRNA có kích thước 1500bp, tín hiệu rõ khơng nhòe, khơng bị trùng đỉnh tín hiệu Sau tiến hành xử lý tín hiệu nhiễu, trình tự đoạn gen so sánh ngân hàng Gen (Genebank) sử dụng công cụ BLAST Kết so sánh trình tự cho thấy Bacillus NT2.8 phân lập từ nước thải nhà máy sữa vi khuẩn Bacillus flexus đặt tên Bacillus flexus NT2.8 Bacillus flexus thường phân lập từ đất nuôi gia cầm, đất tự nhiên, nhiệt độ phát triển từ 17 – 37 oC, nhiệt độ phát triển tối ưu 30 oC, khoảng pH phát triển từ 4,5 – 9,5 với nồng độ muối từ – 10% Nghiên cứu Francois cs, 2014 vi khuẩn Bacillus flexus XJX-1 có khả sinh đồng thời enzyme amylase kiềm, lipase kiềm protease kiềm, ứng dụng công nghiệp chất tẩy rửa Cho đến nay, chưa có nghiên cứu cơng bố vi khuẩn Bacillus flexus có khả sinh βgalactosidase bền nhiệt 4.5 Kết tinh enzyme protease muối (NH4)2SO4 Dịch β-galactosidase tinh chủng Bacillus flexus NT2.8 xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford, hàm lượng protein mẫu tính theo phương trình đường chuẩn protein Hoạt tính protease xác định phương pháp mục 3.3.3 Thí nghiệm ln lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết thu (bảng 3) Bảng Kết tinh enzyme (NH4)2SO4 Thể tích Tổng hoạt Tổng Hoạt tính Hiệu suất (ml) tính (U) protein(mg) riêng (U/mg) thu hồi (%) Trước tinh 25 11.265 56.8 0.198 100 40% 3.244 14.277 0.227 28.80 50% 7.957 11.746 0.677 70.63 Tinh 27 60% 9.75 15.257 0.639 86.55 70% 5.352 20.098 0.266 47.51 Chúng tơi dựa vào hoạt tính riêng enzyme β-galactosidase để xác định khả kết tủa enzyme β-galactosidase (NH 4)2SO4 Hoạt tính riêng cao chứng tỏ khả kết tủa (NH4)2SO4 tốt, độ enzyme cao Qua khảo sát kết ml enzyme tinh với nồng độ muối (NH4)2SO4 khác nhau, chúng tơi nhận thấy hoạt tính riêng enzyme tinh 60% muối (NH 4)2SO4 cao 0.639 (U/mg) 4.6 Kết xác định đặc tính enzyme 4.6.1 Kết xác định độ bền nhiệt độ cao (60°C) enzyme sau tinh Sau tinh tiếp tục xác định khả bền nhiệt enzyme β-galactosidase từ chủng Bacillus NT2.8 Kết đươc thể hình Hình Độ bền nhiệt β-galactosidase từ chủng Bacillus NT2.8 60oC Kết hình xác định độ bền enzyme 60oC Kết cho thấy enzyme sau tinh bền 60oC Cụ thể, sau 30 đầu ủ 60oC hoạt độ enzyme lại 83,02% so với hoạt độ ban đầu, hoạt độ enzyme giảm chậm suốt 50 ủ lại 55,42% so với hoạt độ sau 50 Từ kết ta kết luận chủng vi khuẩn Bacillus NT2.8 có khả sinh enzyme β-galactosidase bền nhiệt 60oC 4.6.2 Kết xác định pH tối ưu enzyme sau tinh Dịch β-galactosidase sau tinh chủng Bacillus flexus NT2.8 xác 28 định hàm pH tối ưu theo phương pháp mô tả mục 3.3.8.2.Kết thể hình đây: Hình pH tối ưu enzyme β-galactosidase tử chủng Bacillus NT2.8 Từ hình ta thấy hoạt tính enzyme β-galactosidase tăng lên pH tăng từ đến Ở pH = họat tính tương đối enzyme 19.41% tăng dần lên đạt giá trị cao pH = Ở pH từ đến đến hoạt tính enzyme giảm hoạt tính tương đối 65% Vậy pH tối ưu cho hoạt động enzyme β-galactosidase pH =7 29 PHẦN THỨ NĂM – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - 26/160 chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu có kết sinh enzyme βgalactosidase định tính mơi trường có X-gal chất cảm ứng IPTG Trong chủng (NT2.7, NT2.8, DC1, DC2, TO1.1,TO1.8) có màu xanh đậm thời gian xuất màu sớm tuyển chọn để tiến hành xác định hoạt tính enzyme - Từ chủng tuyển chọn, sau xác định hoạt tính enzyme xác định chủng NT 2.8, có hoạt độ cao đạt 42.4 U/l trội sử dụng để kiểm tra tính bền nhiệt độ 60ºC + Độ bền nhiệt: Enzyme bền nhiệt 60ºC, hoạt độ enzyme 50 lại 71% cao so với hoạt độ ban đầu - Đã giải trình tự định danh chủng Bacillus NT 2.8 vi khuẩn Bacillus flexus đặt tên Bacillus flexus NT 2.8 - Sau tinh enzyme β-galactosidase muối (NH4)2SO4 nhận thấy hoạt tính riêng enzyme tinh muối (NH 4)2SO4 60% cao 0.639 (U/mg) - Đã xác định pH tối ưu enzyme β-galactosidase từ chủng Bacillus flexus NT 2.8 pH 5.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên điều kiện nghiên cứu hạn chế nên chúng tơi bước đầu tinh muối (NH 4)2SO4 xác định số đặc tính enzyme β-galactosidase mà chưa tiến hành số thí nghiệm mong muốn Vì chúng tơi có số đề nghị cho nghiên cứu sau: - Tinh enzyme β-galactosidase từ chủng NT 2.8 sắc ký lọc gel - Điện di để xác định khả tinh enzyme 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chen, W., Chen, H., Xia, Y., Zhao, J., Tian, F., Zhang, H (2008) Production, purification, and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus J Dairy Sci 91(5):1751-58 Coenen, T.M.M; Bertens, A.M.C; Hoog, S.C.M.de; Verspeek Rip, C.M (2000) Safety evaluation of a lactase enzyme perpartion derived from Kluyveromyces Đặng Thị Thu cộng (2012), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học Kỹ thuật Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách, Bùi Thị Hải Hòa (2007) Tuyển chọn nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Tạp chí Khoa học công nghệ 45 (1): 23 - 31 Davail, S., Feller, G., Narinx, E., Gerday, C (1994) Cold adaptation of protein J Biol Chem, 269 Driks A (1999) Bacillus subtilis spore coat, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63 Francois N, N., Sunils S, M (2014) Concomitant production of detergen compatible enzymes by Bacillus flexus XJX-1 Braz J Microbiol 45(3): 903 – 910 Harju M, Kallioinen H, Tossavainen O (2012), Lactose hydrolysis and other conversions in dairy products: technological aspects, Int Dairy J, 22, 104-109 Nakayama, T., Amachi, T (1999) β-galactosidase, enzymology Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation 3: 1291-1305 Ngô Xuân Mạnh, Võ Nhân Hậu, Nguyễn Thị Tú (2006) Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho việc thu nhận α-amylase chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus lichenifomis Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp 5(1): 412 – 416 Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 31 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nôi Tập Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm, luận văn thạc sĩ trường Đại học sư phạm TP HCM, Nguyen, H A., Nguyen, T H., Kren, V., Eijsink, V G H., Haltrich, D., Peterbauer, C K (2012) Heterologous Expression and Characterization of an N-Acetyl-β-Dhexosaminidase from Lactococcus lactis ssp lactis IL1403, J Agricultural and food chemistry 60 (12): 3275-81 Nguyen, TH., Splechtna, B., Steinböck, M., Kneifel, W., Lettner, H.P., Kulbe, K.D., Haltrich, D (2006) Purification and Characterization of Two Novel βGalactosidases from Lactobacillus reuteri J Agricultural and food chemistry 54: 4989-4998 Parmjit S, P., Shweta, K., Reeba, P (2010) Protential Applications of Ininiobilized βgalactosidase in Food Prossesing Industries Enzyme Research Priest FG and Grigorova R (1991), Method for studying the ecology of endosporeforming bacteria, Method in microbiology 22, 565-591 Rosovitz M J, Voskuil M I, Chambliss G (1998), Bacillus, In: A Balows and B I Duerden (Eds), Systematic Bacteriology Arnold PRESS, London: 709-720 Shaikh, SA., Khire, JM., Khan, MI (1999) Characterization of a thermostable extracellular beta-galactosidase from a thermophilic fungus Rhizomucor sp Biochim Biophys Acta 1472: 314-322 Trương Nam Hải (2004) Nghiên cứu, phân lập tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzyme beta-galactosidase có hiệu suất cao ứng dụng thực phẩm Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật 32 ... enzyme (hay hoạt tính enzyme U/ml) xác định theo phương pháp 3. 3 .3, tổng hoạt tính tính theo thể tích dịch enzyme cuối thu sau tinh muối (NH4)2SO4 H m lượng protein xác định theo phương pháp Bradford,... phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA - Bước đầu tinh xác định số đặc tính enzyme: ảnh h ởng nhiệt độ, ảnh h ởng pH, ảnh h ởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme 3. 3 Phương pháp nghiên cứu 3. 3.1... sữa không lactose doanh nghiệp Đào tạo: H ớng dẫn 01 sinh viên đại h c, 01 nhóm sinh viên nghiên cứu khoa h c Tình h nh sử dụng kinh phí: h n tất thủ tục thanh/quyết tốn với tổng kinh phí tự