Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus an toàn trong thực phẩm sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh sạch và xác định một sốđặc tính của enzyme

Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus, an toàn trong thực phẩm, sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh sạch, xác định một số, đặc tính của enzyme

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔNHỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

KHOA HỌC CẤP HỌC VIỆN

Tên đề tài: “Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus an toàn trong thực phẩm

sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh sạch và xác định một số

DANH SÁCH

Những người tham gia thực hiện đề tài và đơn vị phối hợp chính

I Những người tham gia thực hiện đề tài

1 TS Nguyễn Hoàng Anh

2 ThS Phạm Thị Dịu

3 KS Nguyễn Thị Hồng

4 SV Đặng Thị Nga (CNSH B, K58)

5 SV Nguyễn Thị Diên (CNTP B, K60)

6 SV Lê Thị Lan Anh (CNTP B, K60)

II Đơn vị phối hợp chính

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

PHẦN THỨ NHẤT: ĐẶT VẤN ĐỀ 3

1.2.1 Mục đích 5

1.2.2 Yêu cầu 5

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh hưởng của nhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của enzyme 5

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

3.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.2 Nội dung nghiên cứu 13

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh hưởng của nhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của enzyme 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 13

4.1 Kết quả sàng lọc các chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23

5.1 Kết luận 30

5.2 Kiến nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

Viết tắt Tên đầy đủ

CATA Check all that apply

CA Correspondence Analysis

EDPIM Euclidean Distance Ideal Point Mapping

IPM Ideal profile method

JAR Just about right

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

PHẦN THỨ NHẤT: ĐẶT VẤN ĐỀ 3

1.2.1 Mục đích 5

1.2.2 Yêu cầu 5

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh hưởng của nhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của enzyme 5

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

3.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.2 Nội dung nghiên cứu 13

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh hưởng của nhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của enzyme 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 13

4.1 Kết quả sàng lọc các chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23

4.1 Kết quả sàng lọc các chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23

5.1 Kết luận 30

5.2 Kiến nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

PHẦN THỨ NHẤT: ĐẶT VẤN ĐỀ 3

1.2.1 Mục đích 5

1.2.2 Yêu cầu 5

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh hưởng của nhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của enzyme 5

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

3.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.2 Nội dung nghiên cứu 13

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh hưởng của nhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của enzyme 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 13

4.1 Kết quả sàng lọc các chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23

4.1 Kết quả sàng lọc các chủng Bacillus có hoạt độ β-galactosidase 23

5.1 Kết luận 30

5.2 Kiến nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP HỌC VIỆN

Tên đề tài: Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus an toàn trong thực phẩmsinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh sạch và xác định một số đặctính của enzyme

Mã số: T2017-08-57

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Hoàng Anh Tel.: 0978973346 E-mail: hoanganhcntp@vnua.edu.vn

Cơ quan chủ trì đề tài: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện:

Thời gian thực hiện: Tháng 3/2017 –Tháng 3/2018

1 Mục tiêu:

Mục tiêu chung

Tuyển chọn và định danh vi khuẩn Bacillus an toàn trong thực phẩm có khả năngsinh enzyme β- galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh sạch và xác định đặc tính củaenzyme

Mục tiêu cụ thể

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus đã được định danh sơ bộ từ ngân hàngchủng cuả Khoa công nghệ thực phẩm có khả năng sinh enzyme β-galactosidase

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt

- Định danh chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt bằngphương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh hưởng củanhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của enzyme

2 Nội dung chính:

Nội dung 1: Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus đã được định danh sơ bộ từ

ngân hàng chủng cuả Khoa công nghệ thực phẩm có khả năng sinh enzyme galactosidase

β-Nội dung 2: Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt Nội dung 3: Định danh chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt

bằng phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA

Nội dung 4: Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh

hưởng của nhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính củaenzyme

3 Kết quả chính đạt được (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế – xã hội,…)3.1 Kết quả khoa học

- Tuyển chọn được 24 chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme β-galactosidase

- Tuyển chọn được 01 chủng Bacillus NT2.8 có khả năng bền ở nhiệt độ 60oC(sau 50 giờ ủ ở 60ºC hoạt độ của enzyme vẫn còn 50,6% so với hoạt độ ban đầu) Kếtquả định danh bằng phương pháp sinh học phân tử chỉ ra rằng chùng Bacillus NT2.8 là

Bacillus flexus.

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme β-galactosidase tử

chủng Bacillus flexus NT2.8

- 01 bài báo được đăng trên tạp chí Khoa học nông nghiệp Việt Nam

3.2 Kết quả đào tạo

Hướng dẫn được 01 sinh viên đại học, 01 nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học

Chủ nhiệm: TS Nguyễn Hoàng Anh

Thời gian thực hiện: Tháng 3/2017 –Tháng 3/2018

Kinh phí thực hiện: 50 triệu đồng (tự túc)

Cơ quan chủ trì: Học viện Nông nghiệp Việt nam

KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC

1 Các sản phẩm của đề tài

- Tuyển chọn được 24 chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme β-galactosidase

- Tuyển chọn được 01 chủng Bacillus NT2.8 có khả năng bền ở nhiệt độ 60oC(sau 50 giờ ủ ở 60ºC hoạt độ của enzyme vẫn còn 50,6% so với hoạt độ ban đầu) Kếtquả định danh bằng phương pháp sinh học phân tử chỉ ra rằng chùng Bacillus NT2.8 là

Bacillus flexus.

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme β-galactosidase tử

chủng Bacillus flexus NT2.8

- 01 bài báo được đăng trên tạp chí Khoa học nông nghiệp Việt Nam

Thông tin kết quả nghiên cứu được đăng tải trên website của Học viện Nông nghiệp Việt Nam (Website: www.vnua.edu.vn)

2 Về bí quyết công nghệ và công nghệ sản phẩm

3 Ứng dụng trong sản xuất và hiệu quả kinh tế

Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm sữa và chế biến từ sữa không lactose ở

các doanh nghiệp

4 Đào tạo:

Hướng dẫn được 01 sinh viên đại học, 01 nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học

5 Tình hình sử dụng kinh phí: đã hoàn tất thủ tục thanh/quyết toán với tổng kinh phí tự túc là 50 triệu đồng năm 2017

Xác nhận của cơ quan chủ trì

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Enzyme β-galactosidase còn được gọi là lactase, là enzyme xúc tác cho quá trìnhthủy phân lactose thành glucose và galactose (Davail và cs, 1994) Nhờ khả năng phângiải lactose mà β- galactosidase được sử dụng nhiều cho ngành công nghiệp thựcphẩm, đặc biệt là trong ngành công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa β-galactosidase được sử dụng để thủy phân lactose nhằm làm tăng khả năng tiêu hóa sữacho người bị dị ứng với lactose, cải thiện các chức năng của các sản phẩm từ sữa, bổsung vào quá trình lên men bơ sữa để tránh sự kết tinh lactose và tăng độ ngọt của sảnphẩm Ngoài ra trong y dược, chúng được sử dụng làm thuốc trợ tiêu hóa cho nhữngngười thiếu khả năng hấp thụ lactose (Trương Nam Hải, 2004) Enzyme β-galactosidase có khả năng chịu nhiệt đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phânlactose ở các sản phẩm chế biến nhiệt độ cao và các sản phẩm sữa lên men Sữa đãđược thủy phân lactose được sử dụng cho việc chế biến hương liệu, phô mai, và sữachua Sự thủy phân lactose trong sữa sẽ ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi chế biến cácsản phẩm sữa cô đặc, các sản phẩm sữa cần gia nhiệt Hơn nữa việc sử dụng β-galactosidase có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao trong sản xuất sữa và các sảnphẩm từ sữa làm tăng hương vị cho sản phẩm (Parmjit và cs, 2010)

β-galactosidase có thể tìm thấy ở động vật, thực vật, nấm men, nấm mốc và vikhuẩn Trong đó, enzyme thu nhận từ vi khuẩn ưu việt hơn cả vì vi khuẩn có sinh khốinhỏ, sinh sản nhanh, nhưng tỉ lệ enzyme trong tế bào lớn Mặt khác, môi trường dinhdưỡng để nuôi cấy vi khuẩn lại rẻ tiền, dễ kiếm nên quy trình sản xuất chế phẩmenzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao và ít tốn kém (Ngô Xuân Mạnh và cs,2006)

Trong các loài vi khuẩn được nghiên cứu và sản xuất β-galactosidase, vi khuẩn

Bacillus được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều bởi đây là loài vi khuẩn sinh bào tử,

phân bố nhiều trong tự nhiên, tồn tại được trong các điều kiện khác nhau, nhiều loài

được coi là an toàn trong thực phẩm Thêm vào đó Bacillus thường sinh enzyme ngoại

bào cho nên dễ dàng thu nhận enzyme ở quy mô công nghiệp, mặt khác các enzymengoại bào của vi khuẩn này có đặc tính cao và khả năng sinh enzyme chịu nhiệt caohơn so với các enzyme ngoại bào của những vi sinh vật khác (Đặng Thị Thu và cs,2007) Cho đến nay trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về tuyển chọn vi

khuẩn Bacillus có khả năng sinh β-galactosidase.Tuy nhiên, việc nghiên cứu và đưa vào

ứng dụng sản xuất của β-galactosidase có đặc tính chịu nhiệt còn rất hạn chế

Từ những cơ sở trên, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu tuyển chọn

được chủng Bacillus sinh enzyme β - galactosidase chịu nhiệt, làm cơ sở cho ứng dụngvào việc chế biến một số loại thực phẩm chứa lactose

1.2 Mục đích – Yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Tuyển chọn và định danh vi khuẩn Bacillus an toàn trong thực phẩm có khả năngsinh enzyme β- galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh sạch và xác định đặc tính củaenzyme

1.2.2 Yêu cầu

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus đã được định danh sơ bộ từ ngân hàngchủng cuả Khoa công nghệ thực phẩm có khả năng sinh enzyme β-galactosidase

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt

- Định danh chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase chịu nhiệt bằngphương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA

- Bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của enzyme: ảnh hưởng của

nhiệt độ, ảnh hưởng của pH, ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của enzyme

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đại cương về enzyme β-galactosidase

2.1.1 Enzyme β-galactosidase

β-galactosidase là enzyme có khả năng xúc tác cho hai kiểu phản ứng: phản ứngthủy phân và phản ứng chuyển gốc galactozyl Phản ứng thủy phân chính của β-galactosidase thủy phân đường đôi lactose thành hai đường đơn glucose và galactose,

và trong một số trường hợp enzyme tham gia phản ứng transgalactosylation chuyểngốc galactose đến cơ chất lactose tạo galacto - oligosaccharides (GOS) (Davail và cs,1994) Galacto - oligosaccharides cùng với fructo - oligosaccharides được nghiên cứunhiều nhất tạo ra prebiotic oligosaccharides có lợi cho con người bằng cách kích thích

sự tăng trưởng và hoạt động của vi khuẩn có lợi trong hệ tiêu hóa của người

Hình 2.1 Sơ đồ thủy phân lactose của enzyme β-galactosidase

2.1.2 Nguồn thu nhận

β-galactosidase trong tự nhiên có thể tìm thấy ở các loài thực vật, động vật và vi

sinh vật Tuy nhiên, tính chất của enzyme được thu nhận từ các nguồn khác nhau có sựkhác nhau rõ rệt Nguồn enzyme từ động vật và thực vật rất khó triển khai theo quy môcông nghiệp vì những hạn chế sinh lí và hạn chế kỹ thuật Enzyme được sản xuất từ visinh vật ngày càng nhiều, là giới sinh vật được sử dụng làm nguồn sản xuất enzymetheo quy mô công nghiệp So với động vật và thực vật, vi sinh vật có rất nhiều ưu điểm(Nguyễn Đức Lượng và cs, 2004) Những ưu điểm đó là:

(1) Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh.Trong một thời gian nuôi cấy ngắn,

ta có thể thu được một lượng sinh khối rất gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinhkhối của động vật và thực vật Để đạt được tốc độ tăng sinh khối lớn như vậy, vi sinh

vật phải chuyển hóa một khối lượng cơ chất rất lớn Cũng từ nghiên cứu trên E coli, nhiều nhà khoa học cho thấy rằng trong vòng 24 giờ, vi khuẩn E coli có thể chuyển

hóa được khối lượng cơ chất lớn hơn một ngàn lần khối lượng cơ thể chúng Đểchuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như vậy, chúng phải tổng hợp ra được lượngenzyme rất lớn Bởi vì, mọi chuyển hóa cơ chất trong tế bào là do enzyme đảm nhận.Chính vì thế, nếu sử dụng vi sinh vật như nguồn sinh học để sản xuất enzyme rất cólợi Trong một khoảng thời gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn(để thu enzyme nội bào) mà còn thu được lượng enzyme ngoại bào vừa nhiều, vừa cóhoạt tính riêng rất cao.

(2) Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao Ưu điểm này gắn liền vớitốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền với tốc độ sinh sản và phát triển của vi sinh vật.(3) Vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp Trong sảnxuất này, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàntoàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài như sản xuất enzyme từ nguồn thực vật vàđộng vật

(4) Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và

dễ kiếm Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng Nhờ đó, ta có thể làm giảm giáthành sản phẩm và có thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới

2.1.3 Enzyme β-galactosidase từ vi khuẩn

β-galactosidase ở vi khuẩn có thể ở dạng ngoại bào hoặc nội bào (Davail và cs,1994) Enzyme ngoại bào dễ tách, không phải phá vỡ tế bào, không lẫn chung với cácthành phần nội bào, nếu có chỉ là một enzyme ngoại bào khác, có tính bền vững mạnh,phương pháp tinh sạch dễ và rẻ tiền Enzyme nội bào khó tách, phải phá vỡ tế bào,thường lẫn chung với các chất khác của tế bào sau khi phá vỡ (acid nucleic, chất nguyênsinh, lipid,…), chỉ bền vững ở trong môi trường nội bào, phương pháp tinh sạch khóthực hiện, quy trình công nghệ phức tạp, giá thành đắt β-galactosidase ngoại bào đượctổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân các hợp chấthữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2004) Đây là mộtenzyme thích ứng điển hình, được tổng hợp khi trong môi trường chỉ có lactose hay cácchất có cấu trúc tương tự lactose như axit lactobiotic β-galactosidase của vi khuẩn cókhối lượng phân tử khá lớn (trên 100 kDa), thường hoạt động tối ưu ở 37ºC trong điềukiện môi trường pH trung tính 6.0 - 8.0 (Trương Nam Hải và cs, 2004)

Vi khuẩn E coli là đối tượng được nghiên cứu đầu tiên Cấu trúc bậc ba của enzyme từ E coli cũng như cơ chế điều hòa phiên mã của gene lacZ đã được khẳng

định tạo điều kiện cho việc nghiên cứu kỹ hơn về cơ chế xúc tác của enzyme này Mặc

dù vậy, việc sử dụng enzyme này vào các quá trình sinh học chỉ được kiểm nghiệm ởquy mô phòng thí nghiệm do vi khuẩn này không được phép có mặt trong thực phẩm

Lĩnh vực chủ yếu của enzyme từ vi khuẩn E coli này là trong nghiên cứu sinh học

phân tử, trong kỹ nghệ và trong hóa miễn dịch

Enzyme β-galactosidase từ Streptcoccus thermophiles – một trong những vi

khuẩn được sử dụng ở công nghệ chế biến các sản phẩm lên men từ sữa cũng đã được

sử dụng để thủy phân lactose trong sữa ở quy mô công nghiệp do tính bền nhiệt mà độ

an toàn khi được sử dụng dưới dạng phụ gia thực phẩm Nó cũng được dùng làm chấtxúc tác cho quá trình sản xuất các galacto-oligosaccharides từ lactose do hoạt tínhchuyển hóa galactozyl của nó cao Đối với vi khuẩn chúng có thể phát triển tối ưutrong dải pH từ 6.5 đến 7.5 Chúng kém phát triển ở pH dưới 4 hoặc trên 8 (Coenen và

cs, 2000)

Một số β-galactosidase từ vi khuẩn để có hoạt tính cần phải có mặt các ion hóa trị

1 hoặc các ion hóa trị 2 Ví dụ như β-galactosidase từ S restivirgula cần phải có mặt

nhiều ion kim loại hóa trị 2 để đạt đến độ bền nhiệt và hoạt tính tối đa Tuy nhiên, một

số β-galactosidase khác lại không cần sự có mặt của các ion kim loại như enzyme từ

Rhizobium melioti (Toru Nakayama và cs, 1996).

2.2 Ứng dụng của β-galactosidase

Enzyme β-galactosidase có vai trò vô cùng to lớn trong ngành công nghiệp thựcphẩm nói chung và ngành công nghiệp chế biến sữa nói riêng, ứng dụng chính là thủyphân lactose trong sữa thành glucose và galactose (Davail và cs, 1994) Thủy phânlactose trong whey là một trong ứng dụng quan trọng của β-galactosidase trong ngànhcông nghiệp chế biến sữa, giúp làm tăng độ ngọt của sản phẩm (Rosenberg M, 2006).Enzyme này được sử dụng trong ngành công nghiệp sữa để sản xuất sữa và các sảnphẩm sữa không có lactose, khắc phục tình trạng không dung nạp lactose ở con người(Haju và cs, 2012)

Ngoài ra, sữa không lactose được sử dụng cho việc chế biến hương liệu sữa, phômai, và sữa chua Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực phẩmcũng ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sản phẩm sữa cô đặc Hơnnữa, việc sử dụng sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm tăngquá trình axit hóa, bởi vì thủy phân lactose thường là bước làm chậm tốc độ của quá

trình, làm giảm thời gian đông đặc của sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc vàhương vị cho pho mát (Parmjit S Panesar và cs, 2010) Chất lượng của sữa đông lạnh

và kem làm từ sữa cũng được cải thiện đáng kể khi thêm enzyme β-galactosidase Nóchống lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose vàlàm giảm cấu trúc cát sạn

Từ những ứng dụng thực tiễn trên mà β-galactosidase đã được các nhà khoa họcquan tâm để sản xuất enzyme từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau, để có tiến hànhnghiên cứu sản xuất ở quy mô công nghiệp

2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất β-galactosidase trong và ngoài nước

2.3.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực của đề tài

Nhóm của Nguyễn Thu Hà và cs, 2006 đã nghiên cứu sự biểu hiện của enzyme

lactase ở 2 chủng Lactobacilus reuteri L103 và L461 với mục đích xác định mức độ

biểu hiện của gene mã hóa cho enzyme này và bước đầu xác định một số đặc tính củaenzyme Kết quả chỉ ra rằng enzyme có cấu tạo gồm 2 tiểu phần (2 chuỗi peptide cótrọng lượng là 35kDa và 85kDa), có khả năng chuyển hóa và tạo ra các prebiotic-oligosaccharide Các enzyme này có khoảng pH hoạt động hẹp, một enzyme từ pH 3.8– 4.0 (chủng L461) và một pH 4.6 – 4.8 (chủng L103) Tuy nhiên, kết quả bền nhiệtkhông được chỉ ra ở nghiên cứu này

Nguyễn Văn Cách và cs, 2008 đã tạo dòng β-galactosidase từ Aspergillus oryzae

và xác định một số tính chất lý-hóa của nó Trần Văn Giang và cs, 2008 đã tạo dòng và

phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1 Tuy nhiên,

các thông tin về độ bền nhiệt của enzyme chưa được đưa ra một cách cụ thể Ngoài racòn có công trình nghiên cứu của Trương Nam Hải và cs với đề tài cấp quốc gia

“Nghiên cứu, phân lập và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợpenzyme beta-galactosidase có hiệu suất cao và ứng dụng trong thực phẩm” đã thànhcông trong biểu hiện của và xác đinh hoạt tính β-galactosidase, nhưng việc biểu hiện

trong E.coli lại không an toàn trong thực phẩm, protein thu được đa phần là enzyme

nội bào dẫn đến gặp khó khăn trong việc thu hồi enzyme có hoạt tính cao ứng dụngtrong quy mô công nghiệp Vì vậy, ở Việt Nam những nghiên cứu về β-galactosidasemới dừng lại ở nghiên cứu cơ bản và chưa đưa vào sản xuất enzyme này Vì vậy, việcnghiên cứu tuyển chọn và định danh được các chủng Bacillus với các ưu điểm nổi bật

so với Escherichia coli như an toàn thực phẩm, dễ sinh enzyme bền ở nhiệt độ cao

(Driks, 1999) Enzyme thu nhận được xác định hoạt tính, kiểm tra khả năng chịu nhiệt

để có thể sử dụng trong các quá trình chế biến cần phải gia nhiệt ở nhiệt độ cao trongcác sản phẩm chế biến từ sữa là hết sức cần thiết

2.1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu nước ngoài thuộc lĩnh vực của đề tài

Trên thế giới việc tạo dòng và nghiên cứu sản xuất enzyme β-galactosidase đãđược biết đến từ lâu Một vài công trình tiêu biểu của Petzelbauer và cs, 2000, Hanson

và Adlercreutz, 2001, Splechtna và cs, 2001, Petzelbauer và cs, 2002, Park và cs, 2008,,… cho thấy nguồn gen mã hóa β-galactosidase đã được phân lập từ các nguồn vi

khuẩn khác nhau và được tạo dòng và biểu hiện trong E.coli Các nghiên cứu này là

các nghiên cứu cơ bản, với mục đích để nghiên cứu sự biểu hiện của gene mã hóa cho

β-galactosidase trong E.coli và thuận tiện cho việc tinh sạch và xác định hoạt tính của

enzyme

Một số công trình công bố về tạo dòng và biểu hiện β-galactosidase từ vi khuẩn

lactic (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri) trong vật chủ là vi khuẩn

Lactobacillus plantarum (Nguyễn TT và cs, 2012) Kết quả chỉ ra rằng enzyme biểu

hiện cao, chịu nhiệt ở 50oC khi có sự bổ sung Ca2+ trong phản ứng Tuy nhiên, mụcđích của nghiên cứu này là sản xuất enzyme xúc tác tạo galactooligosaccharide, vectorbiểu hiện vẫn còn gene kháng kháng sinh nên chưa đảm bảo an toàn trong thực phẩm

2.4 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus

2.4.1 Các đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với

các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng

dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc

chuỗi và chuyển động bằng tiên mao

Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus

Hình 2.5 Hình thái vi khuẩn Bacillus qua kính hiển vi quang học

Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất

dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từrất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,… (Priest FG vàGrigorova R, 1991)

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử

dụng các chất hữu cơ đa dạng như đường, amino acid, acid hữu cơ,… Một vài loài có

thể lên men carbohydrate tạo thành glycerol và butanediol, một vài loài như Bacillus

megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần

amino axit, vitamin nhóm B Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối

ưu là 30-450C, nhưng cũng có một số loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 650C(Rosovitz M J và cs, 1998)

Đa số Bacillus sinh trưởng với pH = 7, một số phù hợp với pH = 9-10 như

Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius (Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009).

2.4.2 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sinh enzyme β-galactosidase

Các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh tổng hợp mạnh mẽ nhiều enzyme khác nhau Enzyme sản sinh bởi vi khuẩn Bacillus hầu hết là emzyme ngoại bào nên

dễ dàng cho việc thu nhận ở quy mô công nghiệp Ngoài ra, trong tự nhiên nhiều

chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng chịu nhiệt của một số chủng vi khuẩn, nên

enzyme ngoại bào của loài vi khuẩn này cũng có tiềm năng cao về tính bền nhiệt ởnhiệt độ cao

Nghiên cứu của Chen và cs (2008) đã chỉ ra được nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt

động của β-galactosidase của vi khuẩn Bacillus Stearothermophilus là ở 70ºC và pH

7.0 Xác định được độ bền nhiệt của enzyme này ở 65ºC trong 50 giờ và 70ºC, trong 9

giờ thì hoạt độ β-galactosidase vẫn giữ được 50% so với ban đầu Enzyme chịu nhiệttái tổ hợp của vi khuẩn này ứng dụng cho cả hai quá trình thủy phân lactose và sảnxuất galactose-oligosaccharides trong chế biến sữa.

Các nghiên cứu chỉ ra được tính bền nhiệt của các chủng vi khuẩn Bacillus chủ

yếu hoạt động ở pH trung tính, những nghiên cứu về khả năng hoạt động ở pH axit của

vi khuẩn Bacillus vẫn còn hạn chế Vì vậy mà việc nghiên cứu khả năng sinh galactosidase có khả năng chịu nhiệt và chịu pH axit từ vi khuẩn Bacillus để ứng dụng

β-trong các ngành công nghiệp thực phẩm trở nên vô cùng cấp thiết