Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ chượp mắm có khả năng sinh tổng hợp ectoines

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI LÝ THỊ NGHĨA PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN TỪ CHƢỢP MẮM CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ECTOINES LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI LÝ THỊ NGHĨA PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN TỪ CHƢỢP MẮM CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ECTOINES Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐOÀN VĂN THƢỢC HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn chân thành đến Thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Đoàn Văn Thược, người Thầy kính mến tận tình hướng dẫn, dạy bảo trình học tập thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn TS Trần Hữu Phong, dạy dỗ, tận tình bảo, quan tâm động viên khuyến khích giúp đỡ suốt trình thực đề tài luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh- Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị em, bạn bè làm việc với phòng thí nghiệm CNSH-Vi sinh tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn thương yêu tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2017 Học viên Lý Thị Nghĩa CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AsD : L-aspartate-beta-semialdehyde dehydrogenase AsK : Aspartate kinase AsT : Aspartate transaminase CDW (cell dry weight) :Khối lượng tế bào khô CNSH : Công nghệ sinh học Cs : Cộng DA : L-2,4-diaminobutyrate EctA : Diaminobutyric acid acetyltransferase EctB : Transaminase acid L-2,4-diaminobutyric EctC : Ectoine synthase EctD : Ectoine hydroxylase LDH : Lactate dehydrogenase MSG : Monosodium glutamate NANA : Nγ-acetyl-L-2,4diaminobutyrate PFK : Phosphofructokinase UV (untraviolet) : Tia tử ngoại MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược chượp mắm 1.2 Ectoines đường sinh tổng hợp ectoines 1.2.1 Sự tích lũy ectoines 1.2.2 Con đường sinh tổng hợp ectoines 1.3 Các nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp ectoines 1.4 Sản xuất ứng dụng ectoines 16 1.4.1 Sản xuất ectoines 16 1.4.2 Ứng dụng ectoines 19 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Địa điểm, thời gian, môi trường nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp phân lập 24 2.3.2 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn 24 2.3.3 Phương pháp giữ giống vi khuẩn 25 2.3.4 Phương pháp ho t h chủng vi huẩn tuyển chọn 25 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào 25 2.3.6 Phương pháp đông hô 26 2.3.7 Phương pháp định lo i vi khuẩn kỹ thuật di truyền phân tử 26 2.3.8 Phương pháp lên men thu sinh hối tế bào 26 2.3.9 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng củ điều kiện nuôi cấy dinh dưỡng đến khả sinh trưởng phát triển chủng tuyển chọn 27 2.3.9.1 ghiên cứu ảnh hưởng củ pH đến sinh trưởng phát triển chủng tuyển chọn 27 2.3.9.2 chọn ghiên cứu ảnh hưởng củ nhiệt độ đến sinh trưởng củ chủng tuyển 27 2.3.9.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng tích lũy ectoines chủng tuyển chọn 28 2.3.9.4 Phương pháp nuôi cấy hai pha nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh tổng hợp ectoines chủng tuyển chọn 28 2.3.9.5 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn itơ đến sinh trưởng phát triển chủng tuyển chọn 28 2.3.9.6 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn C cbon đến sinh trưởng phát triển chủng tuyển chọn 29 2.3.9.7 Nghiên khả sinh trưởng sinh tổng hợp ectoines chủng tuyển chọn sử dụng nguồn cacbon nguồn nito tốt nồng độ NaCl khác nhau… 29 2.3.9.8 Nuôi cấy hai pha ghiên cứu khả sinh trưởng sinh tổng hợp ectoines chủng tuyển chọn sử dụng môi trường dinh dưỡng khác 29 2.3.10 Phương pháp phân tích hàm lượng ectoines tế bào vi khuẩn 30 2.3.11 Nghiên cứu sản xuất ectoines từ chủng tuyển chọn sử dụng nồi lên men 10L…… 30 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp ectoines 33 3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học định loại chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 3.2.1 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào 35 3.2.2 Kết tách chiết ADN tổng số và PCR đo n trình tự gen 16S rDNA… 38 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường yếu tố dinh dưỡng đến khả sinh trưởng, phát triển tích lũy ectoines chủng tuyển chọn 41 3.3.1 Ảnh hưởng củ pH đến sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn tuyển chọn 41 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển chủng tuyển chọn 42 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ Cl đến sinh trưởng, phát triển khả tích lũy ectoine chủng vi khuẩn tuyển chọn 43 3.3.4 Nuôi cấy hai pha nghiên ảnh hưởng nồng độ Cl đến khả sinh tổng hợp ectoines chủng tuyển chọn 45 3.4 Ảnh hưởng nguồn Nito đến khả sinh trưởng phát triển chủng Salinivibrio sp M7 47 3.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng phát triển của chủng Salinivibirio sp M7 tuyển chọn 48 3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp ectoines chủng Salinivibrio sp.M7 sử dụng nguồn cacbon glucose nguồn nito cao nấm men 48 3.7 Nuôi cấy hai pha nghiên cứu khả sinh trưởng sinh tổng hợp ectoines chủng tuyển chọn sử dụng môi trường khác pha nồng nồng độ NaCl khác 50 3.8 Nghiên cứu lên men sản xuất ectoines sử dụng chủng Salinivibrio sp M7 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC : GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S rDNA DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Vi sinh vật sản xuất ectoines: chủng điều kiện Bảng 2.1 Công thức loại môi trường sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Khả sinh trưởng hàm lượng ectoine tích lũy tế bào 18 chủng vi khuẩn có khả phát triển dải muối rộng 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Chượp mắm giai đoạn lên men Hình 1.2 Cấu trúc hóa học ectoines Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp ectoines vi khuẩn Hình 1.4 Sơ đồ trình công nghiệp sản xuất ectoine 17 Hình 1.5 Một số sản phẩm y tế sử dụng ectoine thị trường 22 Hình 1.5 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng ectoine sắc kí lỏng 31 Hình 1.6 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng Hydroxyectoine 32 sắc kí lỏng 32 Hình 3.1 Nuôi cấy chủng tuyển chọn nồng độ muối khác 33 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào kính hiển vi thường (B) kính hiển vi điện tử (C) chủng M7 35 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào kính hiển vi thường (B) chủng M92 36 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào kính hiển vi thường (B) kính hiển vi điện tử (C) chủng M312 36 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào kính hiển vi thường (B) kính hiển vi điện tử (C) chủng M313 37 Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào kính hiển vi thường (B) kính hiển vi điện tử (C) chủng M316 37 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào kính hiển vi thường (B) kính hiển vi điện tử (C) chủng M7 38 Hình 3.8 Kết điện di (A)DNA tổng số (B) sản phẩm phản ứng PCR.39 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 Hình 3.10 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng, phát triển chủng tuyển chọn 41 Hình 3.11 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển chủng tuyển chọn 42 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến sinh trưởng phát triển(A),sinh tổng hợp ectoine(B) chủng vi khuẩn tuyển chọn 44 Hình 3.13 Khả sinh trưởng (A), sinh tổng hợp ectoine (B) H-ectoine (C) chủng tuyển chọn 46 Hình 3.14 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng chủng Salinivibrio sp.M7 47 Hình 3.15 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng phát triển chủng Salinivibrio sp M7 48 Hình 3.16 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh trưởng, phát triển 49 sinh tổng hợp ectoines chủng Salinivibrio sp.M7 49 Hình 3.17 Nuôi cấy hai pha ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp ectoines chủng Salinivibriosp M7Error! Bookmar Hình 3.18 Động thái trình lên men sản xuất ectoine chủng Salinivibrio sp M7 51 3.7 Nuôi cấy hai pha nghiên cứu khả sinh trƣởng sinh tổng hợp ectoines chủng Salinivibrio sp M7 sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng khác Dựa vào kết nghiên cứu 3.3.3 3.6 cho thấy glucose cao nấm men nguồn dinh dưỡng tốt cho sinh trưởng chủng Salinivibrio sp M7, nhiên môi trường có chứa glucose cao nấm men hàm lượng ectoines tích lũy lại thấp nhiều so với môi trường sử dụng cao thịt pepton.Vì vậy, tiến hành thí nghiệm nuôi cấy hai pha nghiên cứu khả sinh trưởng sinh tổng hợp ectoines chủng Salinivibrio sp M7 nồng độ NaCl khác Ở pha 1, tiến hành nuôi cấy chủng Salinivibrio sp M7 môi trường thu sinh khối Sau 24 lên men thu mẫu xác định khối lượng tế bào khô ectoines tích lũy, li tâm thu toàn sinh khối để chuyển vào môi trường nuôi cấy pha Pha 2: Sử dụng môi trường MPA nồng độ NaCl khác 7%, 10%, 13% Sau 30 lên men, tiến hành thu mẫu xác định CDW hàm lượng ectoines tích lũy Nồng độ NaCl (%) CDW (g/l) Ectoines tích lũy (% CDW) Pha 4,58±0,13 0,05 Pha 5,32±0,12 4,2 10 4,78±0,07 4,4 13 4,77±0,06 4,37 Kết thu cho thấy, nuôi cấy chủng Salinivibrio sp.M7 hai pha sử dụng môi trường khác nhau, chủng sinh trưởng tốt CDW đạt 5,23 g/l nồng độ 7% NaCl, nhiên hàm lượng ectoines tích lũy đạt 4,4% Như sử dụng glucose cao nấm men pha (pha sinh trưởng) khả tích lũy ectoine pha bị ảnh hưởng 3.8 Nghiên cứu lên men sản xuất ectoines sử dụng chủngSalinivibrio sp M7 Động thái lên men chủng Salinivibrio sp M7 nghiên cứu nồi lên men 10Lvới thể tích 4L Ở pha chủng nuôi môi trường MPA với nồng độ NaCl tối ưu Sau 24 nuôi cấy, sinh khối thu lại nhờ 50 hệ thống lọc luân hồi chuyển sang môi trường MPA có nồng độ NaCl cao Hàm lượng ectoine (%CDW) NaCl (%) 4.0 14 3.5 12 CDW (g/l) 3.0 10 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 12 18 Pha 24 30 33 36 39 42 Thời gian 45 48 51 54 Nồng độ NaCl hàm lượng ectoine (%) CDW (g/l) Pha Hình 3.18 Động thái trình lên men sản xuất ectoine chủng Salinivibrio sp.M7 Kết hình 3.18 cho thấy, pha 1(lên men 24 giờ) sau 18h lên men sinh khối tế bào tăng lên cực đại (CDW 2,23g/l) giảm dần Pha (lên men 30 giờ), sinh khối tế bào tăng nhanh sau lên men chuyển vào môi trường (CDW 2,9g/l) Sau bổ sung muối từ từ sinh khối tế bào tăng chậm đạt giá trị cực đại 3,29 g/l hàm lượng ectoine đạt giá trị cực đại 10,4% CDW sau 24 nuôi cấy nồng độ NaCl 10% Hàm lượng tương đương với hàm lượng ectoine tích lũy nuôi cấy chủng bình tam giác 10,3% Khi tiếp tục tăng nồng độ NaCl, sinh khối tế bào hàm lượng ectoine tích lũy có xu hướng giảm dần Ở nồng độ muối cao ectoine bị chuyển hóa thành hydroxyectoine 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã phân lập 334 chủng vi khuẩn từ mẫu chượp mắm, từ tuyển chọn 18 chủng có khả sinh trưởng dải muối rộng (520%) Kết phân tích HPLC cho thấy có đến 17/18 chủng tuyển chọn có khả sinh tổng hợp ectoine có chủng tích lũy ectoine tế bào 10% CDW Chủng M312 sinh trưởng tốt nồng độ 6% NaCl, chủng M7, M313 phát triển tốt nồng độ 9% NaCl , chủng M316 M318 phát triển tốt nồng độ 12% NaCl Nhiệt độ tối ưu cho chủng tuyển chọn 35-40 O C, pH tối ưu cho tất chủng dao động khoảng 6,5-7 Kết giải đoạn trình tự gen 16S rDNA cho thấy: chủng M92 thuộc chi Vibrio, chủng lại (M7, M312, M313, M316 M318) thuộc chi Salinivibrio Chủng Salinivibrio sp.M7 có khả sinh trưởng, phát triển tốt với nguồn cacbon glucose, nguồn nito cao nấm men Tuy nhiên khả tích lũy ectoines bị giảm sử dụng nguồn dinh dưỡng Lên men chủng Salinivibrio sp M7 thiết bị lên men 10L theo phương pháp nuôi cấy hai pha lên men mẻ, sinh khối đạt cao sau 48 nuôi cấy (CDW 3,29 g/l), hàm lượng ectoine tích lũy đạt 10,4% nồng độ 10% NaCl Kiến nghị chủng vi khuẩn nghiên cứu có tiềm ứng dụng sản xuất ectoines Việt Nam, cần có nghiên cứu để đưa chủng vào sản xuất 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở vi sinh vật học Tập I, NXB Đại học sư phạm Hà Nội, Tr 10-33 Mai thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học NXB Đại học sư phạm Hà Nội, Tr 37-45 Lê Thị Thanh Loan, Lê Thị Mỹ Phước, Phạm Thành Hổ (2003) Sưu tập giống vi sinh vật t o hương Hội nghị Khoa học toàn quốc lần Nghiên cứu Sinh học, Nông nghiệp, Y học - Huế Phan Thị Thanh Quế (2005), Công nghệ chế biến thủy hải sản Nxb ĐH Cần Thơ, Cần Thơ Tiếng Anh Aston JE, Peyton BM (2007), “Response of Halomonas campisalis to saline stress: changes in growth kinetics, compatible solute production and membrane fatty phospholipid acid composition” FEMS Microbiology Letters 274, pp 196-203 Banciu HL, Sorokin DY, Tourova TP, Galinski EA, Muntyan MS, Kuenen JG, Muyzer G (2008), “Influence of salts and pH on growth and activity of a novel facultatively alkaliphilic, extremely salt-tolerant, obligately chemolithoautotrophic sufur-oxidizing Gam- maproteobacterium Thioalkalibacter halophilus gen nov., sp nov from South- Western Siberian soda lakes” Extremophiles 12, pp 391-404 Bernard T, Jebbar M, Rassouli Y, Himdikabbab S, Hamelin J, Blanco C (1993), “Ectoine accumulation and osmotic regulation in Brevibacterium linens” Journal of General Microbiology 139, pp 129-136 Borges N, Ramos A, Raven NDH, Sharp RJ, Santos H (2002), “Comparative study of the thermostabilizing properties of mannosylglycerate and other compatible solutes on model enzymes” Extremophiles 6, pp.209-216 53 Bunger J, Degwert J, Driller H (2001), “The protective function of compatible solute ectoine on the skin cells and its biomolecules with respect to UV- radiation, immunosuppression and membrane damage” IFSCC Mag 4, pp.1-6 Bünger J, Driller H (2004), “Ectoine: an effective natural substance to prevent UVA-induced premature photoaging” Skin Pharmacology and Physiology 17, pp 232-237 Bursy J, Kuhlmann AU, Pittelkow M, Hartmann H, Jebbar M, Pierik AJ Bremer E (2008), “ Synthesis and uptake of the compatible solutes ectoine and 5-hydroxyectoine by Streptomy- ces coelicolor A3(2) in response to salt and heat stresses” Applied and Environmental Microbiology 74, pp.7286-7296 Bursy J, Pierik AJ, Pica N, Bremer E (2007), “Osmotically induced synthesis of the compatible solute hydroxyectoine is mediated by an evolutionarily conserved ectoine hydroxylase” Journal of Biological Chemistry 282, pp 31147-31155 Canamas TP, Vinas I, Usall J, Magan N, Morello JR, Teixido N (2007), “Relative importance of amino acids, glycine-betaine and ectoine synthesis in the biocontrol agent Pantoea agglomerans CPA-2 in response to osmotic, acidic and heat stress” Letters in Applied Microbiology 45, pp 6-12 10.Canovas D, Borges N, Vargas C, Ventosa A, Nieto JJ, Santos H (1999), “Role of Nγ-acetyldiaminobutyrate as an enzyme stabilizer and an intermediate in the biosynthesis of hydroxyectoine” Applied and Environmental Microbiology 65, pp 3774-3779 11.Canovas D, Vargas C, Iglesias-Guerra F, Csonka LN, Rhodes D, Ventosa A, Nieto JJ (1997), “ Isolation and characterization of salt-sensitive mutants of the moderate halophile Halomonas elongata and cloning of the ectoine synthesis genes” Journal of Biological Chemistry 272, pp 2579425801 54 12.Fallet C, Rohe P, Franco-Lara E (2010), “Process optimization of the integrated synthesis and secretion of ectoine and hydroxyectoine under hyper/hypo-osmotic stress” Biotechnology and Bioengineering 107, pp.124-133 13.Fernandez-Linares L, Faure R, Bertrand JC, Gauthier M (1996), “Ectoine as the predominant osmolyte in the marine bacterium Marinobacter hydrocarbonoclasticus grown on eicosane at high salinities” Letters in Applied Microbiology 22, pp 169-172 14.Frings E, Sauer T, Galinski EA (1995), “ Production of hydroxyectoinehigh cell-density cultivation and osmotic downshock of Marinococcus strain M52” Journal of Biotechnology 43, pp 53-61 15.Galinski EA, Pfeiffer HP, Trüper HG (1985), “1,4,5,6-Tetrahydro-2methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid A novel cyclic amino acid from halophilic phototrophic bacteria of the genus Ectothiorhodospira” European Journal of Biochemistry 149, pp 135-139 16.Garcia-Estepa R, Argandoña M, Reina-Bueno M, Capote N, IglesiasGuerra F, Nieto JJ, Vargas C (2006), “The ectD gene, which is involved in the synthesis of the compatible solute hydroxyectoine, is essential for thermoprotection of the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens” Journal of Bacteriology 188, pp 3774-3784 17 Gilmour D (1990), Halotolerant and halophilic microorganisms, In Edwards C (ed), Microbiology of extreme environments McGraw-Hill Publishing Co, NewYork, p 147-178 18 Goller K, Ofer A, Galinski EA (1998), “Construction and characterization of an NaCl-sensitive mutant of Halomonas elongata impaired in ectoine biosynthesis” FEMS Microbiology Letters 161, pp 293-300 19 Guzman H, Van-Thuoc D, Martin J, Hatti-Kaul R, Quillaguaman J (2009), “A process for the production of ectoine and poly(3- 55 hydroxybutyrate) by Halomonas boliviensis” Applied Microbiology and Biotechnology 84, pp.1069-1077 20 Heinrich U, Garbe B, Tronnier H (2007), “In vivo assessment of Ectoin: A randomized, vehicle-controlled clinical trial” Skin Pharmacology and Physiology, 20(4), pp 211-218 21 Inbar L, Lapidot A (1988), “The structure and biosynthesis of new tetrahydropyrimidine derivatives in actinomycin D producer Streptomyces parvulus” Journal of Biological Chemistry 263, pp 16014-16022 22 Kuhlmann AU, Bremer E (2002), “Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp” Applied and Environmental Microbiology 68, pp 772-783 23.Kuhlmann AU, Bremer E (2002), “Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp” Applied and Environmental Microbiology 68, pp.772-783 24.Kunte HJ, Galinski EA, Trüper HG (1993), “A modified FMOC-method for the detection of aminoacid type osmolytes and tetrahydropyrimidines (ectoines)” Journal of Microbiological Methods 17, pp 129-136 25 Kunte HJ, Lentzen G,A, Galinski E (2014), “ Industrial production of the cell protectant ectoine: protection mechanisms, processes, and products” Current Biotechnology 3, pp 10-25 26 Lapidot A, Iakobashvili R, Malin G (1999), Methods for DNA amplification and sequencing, Patent WO1999041410 1999 August 19 27.Lentzen G, Schwarz T (2006), “Extremolytes: natural compounds from extremophiles for versatile applications” Applied Microbiology and Biotechnology 72, pp 623-634 28.Lippert G, Galinski EA (1992), “Enzyme stabilization by ectoine-type compatible solutes: protection against heating, freezing and drying” Applied Microbiology and Biotechnology 37, pp 61-65 29.Louis P, Galinski EA (1997), “Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine from Marinococcus 56 halophilus and osmoregulated expression in Escherichia coli” Microbiology 143, pp 1141-1149 30.Louis P, Trüper HG, Galinski EA (1994), “Survival of Escherichia coli during drying and storage in the presence of compatible solutes” Applied Microbiology and Biotechnology 41, pp.684-688 31.Malin G, Lapidot tetrahydropyrimidine A (1996), derivatives “ in Induction of Streptomyces” synthesis of Journal of Bacteriology 178, pp.385-395 32.Manzanera M, de Castro AG, Tondervik A, Rayner-Brandes M, Strom AR, Tunnacliffe A (2002), “Hydroxyectoine is superior to trehalose for anhydrobiotic engineering of Pseudomonas putida KT2440” Applied in Environmental Microbiology 68, pp 4328-4333 33.Manzanera M, Vilchez S, Tunnacliffe A (2004), “High survival and stability rates of Escherichia coli dried in hydroxyectoine” FEMS Microbiology Letters 233, pp 347-352 34.Maskow T, Babel W (2001), “Calorimetrically obtained information about the efficiency of ectoine synthesis from glucose in Halomonas elong t ” Biochimica et Biophysica Acta 1528, pp 60-70 35 Morbach S, Kramer R (2002), “Body shaping under water stress: osmosensing and osmoreg- ulation of solute transport in bacteria” Chembiochem, 3:384-397 36 Nagata S, Wang Y, Oshima A, Zhang L, Miyake H, Sasaki H (2008), “Efficient cyclic system to yield ectoine using Brevibacterium sp JCM 6894 subjected to osmotic downshock” Biotechnology and Bioengineering 99, pp.941-948 37.Nagata S, Wang YB (2001), “Accumulation of ectoine in the halotolerant Brevibacterium sp JCM 6894” Journal of Bioscience and Bioengineering 91, pp 288-293 38.Naughton LM, Blumerman SL, Carlberg M, Boyd EF (2009), “Osmoadaptation among Vibrio species and unique genomic features and 57 physiological” Applied and Environmental Microbiology 75, pp 28022810 39.Ono H, Okuda M, Tongpim S, Imai K, Shinmyo A, Sakuda S, Kaneko Y, Murooka Y, Takano M (1998), “Accumulation of compatible solutes, ectoine and hydroxyectoine, in a moderate halophile, Halomonas elongata KS3 isolated from dry salty land in Thailand” Journal of Fermentation and Bioengineering 85, pp 362-368 40.Onraedt AE, Walcarius BA, Soetaert WK, Vandamme EJ (2005), “Optimization of ectoine synthesis through fed-batch fermentation of Brevibacterium epidermis” Biotechnology Progress 21, pp 1206-1212 41.Oren A (1999), “Bioenergetic aspects of halophilism” Microbiology and Molecular Biology Reviews 63, pp 334-348 42.Pastor JM, Salvador M, Argandona M, Bernal V, Reina-Bueno M, Csonka LN, Iborra JL, Vargas C, Nieto JJ, Canovas M (2010), “Ectoines in cell stress protection: uses and biotechnological production” Biotechnology Advances 28,pp.782-801 43.Peters P, Galinski EA, Trüper HG (1990), “The biosynthesis of ectoine” FEMS Microbiology Letters 71, pp 157-162 44.Peters A, von Klot S, Heier M, Trentinaglia I, Hormann A, Wichmann HE, Lowel H (2004), “Exposure to traffic and the onset of myocardial infarction” The New England Journal of Medicine 351, pp.1721-1730 45.Pflughoeft KJ, Kierek K, Watnick PI (2003), “Role of ectoine in Vibrio cholerae osmoadaptation” Applied and Environmental Microbiology 69, pp.5919-27 46 Roberts MF (2000), “Osmoadaptation and osmoregulation in archaea” Frontiers in Bioscience 5D, pp 796-812 47.Roberts MF (2005), “Organic compatible solutes of halotolerant and halophilic microorganisms” Saline Systems 1:5 58 48.Sauer T, Galinski EA (1998), “Bacterial milking: a novel bioprocess for production of compatible solutes” Biotechnology and Bioengineering 57, pp 306-313 49.Saum SH, Müller V (2008), “Growth phase-dependent switch in osmolyte strategy in a moderate halophile: ectoine is a minor osmolyte but major stationary phase solute in Halobacillus halophilus” Environmental Microbiology 10, pp 716-726 50.Schiraldi C, Maresca C, Catapano A, Galinski EA, De Rosa M (2006), “High-yield cultivation of Marinococcus M52 for production and recovery of hydroxyectoine” Research in Microbiology, 157, pp 693699 51.Schmitz RPH, Galinski EA (1996), “Compatible solutes in luminescent bacteria of the genera Vibrio, Photobacterium and Photorhabdus (Xenorhabdus): occurrence of ectoine, betaine and glutamate” FEMS Microbiology Letters 142, pp 195-201 52.Schnoor M, Voß P, Cullen P, Böking T, Galla HJ, Galinski EA, Lorkowski S (2004), “Characterization of the synthetic compatible solute homoectoine as a potent PCR enhancer” Biochemical and Biophysical Research Communications 322, pp 867-872 53 Schubert T, Maskow T, Benndorf D, Harms H, Breuer U (2007), “Continuous synthesis and excretion of the compatible solute ectoine by a transgenic, nonhalophilic bacterium” Applied and Environmental Microbiology 73, pp.3343-3347 54 Severin J, Wohlfarth A, Galinski EA (1992), “The predominant role of recently discovered tetrahydropyrimidines for the osmoadaptation of halophilic eubacteria” Journal of General Microbiology 138, pp.16291638 55 Van-Thuoc D, Guzman H, Guillaguaman J, Hatti-Kaul R (2010), “High productivity of ectoines by Halomonas boliviensis using a combined two- 59 step fed-batch culture and milking process” Journal of Biotechnology 147, pp.46-51 56.Van-Thuoc D, Hashim SO, Hatti-Kaul R, Mamo G (2013), “Ectoine mediated protection of enzyme from the effect of pH and temperature stress: a study using Bacillus halodurans xylanase as a model” Applied Microbiology and Biotechnology 97, pp 6271-6278 57 Vargas C, Argandoña M, Reina-Bueno M, Rodríguez-Moya J, Fernández-Aunión C, Nieto JJ (2008), “Unravelling the adaptation responses to osmotic and temperature stress in Chromohalobacter salexigens, a bacterium with broad salinity tolerance” Saline Systems 4:14 DOI: 10.1186/1746- 1448-4-14 58.Welsh DT (2000), “ Ecological significance of compatible solute accumulation by micro-organisms: from single cells to global climate” FEMS Microbiology Reviews 24, pp 263-290 59.Wohlfarth A, Severin J, Galinski EA (1990), “The spectrum of compatible solutes in heterotrophic halophilic eubacteria of the family H lomon d ce e” Journal of General Microbiology 136, pp 705-712 60.Yasuhiko Y, Yoshio K, Eiichiro K, Yasuhiro T, Seichi S (1997), “ Production of L- amino acid by fermentation method using ectoine” Japanese Patent JP9271382 61 Zhang LH, Lang YJ, Nagata S (2009), “ Efficient production of ectoine using ectoine-excreting strain” Extremophiles 13, pp 717-724 60 PHỤ LỤC : GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S rDNA M7 CGTCTCCCATGCGGTCTACTTATGCGTTAGCTCCGAAAGCCAAAGTCT TAAACCTCAGCCTCCAAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAG GGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGCATCTGAGCGTCAGT CTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACTGGTATTCCTTCAGATCTCTA CGCATTTCACCGCTACACCTGAAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCT AGCCTGCCAGTTTCAAATGCGGTTCCGAGGTTGAGCCCCGGGCTTTC ACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCATGCGCTTTACGCCCAGTAATT CCGATTAACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGA GTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGCTAACGTCAAGCAATGCACGTATT AAGTACACTACCTTCCTCACTGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGG CCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTCTCCCCC M92 TCAGGGAGTCTCCCAGGCGGTCTACTTAACGCGTTAGCTCCGAAAGC CACGGCTCAAGGCCACAACCTCCAAGTAGACATCGTTTACGGCGTGG ACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCATCTGA GTGTCAGTATCTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTTCA GATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGAAATTCTACCCCCCTCTAC AGTACTCTAGTCTGCCAGTTTCAAATGCTATTCCGAGGTTGAGCCCCG GGCTTTCACATCTGACTTAACAAACCACCTGCATGCGCTTTACGCCCA GTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGC ACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGTCGCTAACGTCAAACAACGCCG CTATTAACGACGCCGCCTTCCTCACGACTGAAAGTACTTTACAACCC GAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCC ATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCTCCCCCGTAGGAACCTTCCCC M312 CGTACTCAAGGCGGTCTAACTTTATGCGTTAGCTCCGAAAGCCAAAGT CTTAAGCCTCAACCTCCAAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCA GGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGCATCTGAGTGTCAGT CTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACTGGTATTCCTTCAGATCTCTAC GCATTTCACCGCTACACCTGAAATTCTACCCCCCTCTACAATACTCTAG CCTGCCAGTTTCAAATGCTGTTCCGAGGTTGAGCCCCGGGCTTTCACAT CTGACTTAACAAACCACCTGCATGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATT AACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCC GGTGCTTCTTCTGTAGCTAACGTCAAGCAATGCACGTATTAACTACACT ACCTTCCTCACTACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACA CACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTCGCCCCCAT M313: TCTCCAGGCGGTCTACTTAATGCGTTAGCTCCGAAAGCCAAAGTCTT AGGCCTCAGCCTCCAAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGG GTATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGCATCTGAGCGTCAGTC TTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACTGGTATTCCTTCAGATCTCTAC GCATTTCACCGCTACACCTGAAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTA GCCTGCCAGTTTCAAATGCGGTTCCGAGGTTGAGCCCCGGGCTTTCA CATCTGACTTAACAAACCGCCTGCATGCGCTTTACGCCCAGTAATTCC GATTAACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGT TAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGCTAACGTCAAGCAATGCACGTATTAA GTACACTACCTTCCTCACTGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCC TTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTCT M316 TCTCCAGGCGGTCTACTTATGCGTTAGCTCCGAAAGCCAAAGTCTTAAA CCTCAGCCTCCAAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC TAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGCATCTGAGCGTCAGTCTTTGTCC AGGGGGCCGCCTTCGCCACTGGTATTCCTTCAGATCTCTACGCATTTCA CCGCTACACCTGAAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAG TTTCAAATGCGGTTCCGAGGTTGAGCCCCGGGCTTTCACATCTGACTTA ACAAACCGCCTGCATGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCG CACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCT TCTGCAGCTAACGTCAAGCAATGCACGTATTAAGTACACTACCTTCCTC ACTGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCA TGGCTGCATCAGGGTCTCCCCCAT M318 TCTCCAGGCGGTCTACTTATGCGTTAGCTCCGAAAGCCAAAGTCTTA AACCTCAGCCTCCAAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGG TATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGCATCTGAGCGTCAGTCT TTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACTGGTATTCCTTCAGATCTCTACG CATTTCACCGCTACACCTGAAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAG CCTGCCAGTTTCAAATGCGGTTCCGAGGTTGAGCCCCGGGCTTTCAC ATCTGACTTAACAAACCGCCTGCATGCGCTTTACGCCCAGTAATTCC GATTAACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGT TAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGCTAACGTCAAGCAATGCACGTATTAA GTACACTACCTTCCTCACTGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCC TTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTCTCCCCCAT ... hợp ectoines 1-2 chủng vi khuẩn phân lập từ chượp mắm Nội dung nghiên cứu: - Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp ectoines - Nghiên cứu đặc điểm sinh học định loại chủng vi khuẩn. .. phát từ lý định tiến hành thực đề tài: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn từ chƣợp mắm có khả sinh tổng hợp ectoines Mục tiêu đề tài: Phân lập tuyển chọn, nghiên cứu đánh giá khả sinh tổng hợp. .. Vi t Nam chưa có công trình nghiên cứu khả sinh tổng hợp ectoines chủng vi khuẩn nói chung chủng vi khuẩn chượp mắm nói riêng Do vậy, vi c nghiên cứu tìm kiếm chủng vi sinh vật từ chượp mắm có