Bước đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Sinh viên thực luận văn Trần Chi Phúc LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ gia đình ln bên cạnh, cổ vũ, động viên giúp đỡ gặp khó khăn suốt q trình q trình học tập thực Đồ án Em xin cám ơn thầy, thuộc khoa CƠNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƢỜNG, Trƣờng Đại Học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh tận tình dạy truyền đạt cho em đầy kiến thức suốt trình học tập trƣờng Đặc biêt, em chân thành cám ơn Ts Nguyễn Hồi Hƣơng tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn truyền đạt cho em nhiều kiến thức suốt thời gian nghiên cứu thực đồ án Em xin cám ơn quý thầy, phụ trách Phòng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƢƠNG, Trƣờng Đại Học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt giúp cho em thực hoàn thành Đồ án tốt nghiệp Tơi xin cám ơn giúp đỡ nhiệt tình cộng tất bạn làm việc phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học giúp đỡ cho tơi suốt q trình thực Đồ án tốt nghiệp TP Hồ Chi Minh, ngày … tháng … năm 2014 Trần Chí Phúc Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Độc tố nấm mốc 1.2 Độc tố aflatoxin 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 1.2.2 Tính chất vật lý phân loại 1.2.3 Sự tạo thành aflatoxin nấm mốc 1.2.4 Cơ chế gây độc aflatoxin 1.2.5 Độc tính aflatoxin 1.2.6 Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin 10 1.2.7 Tình hình nhiễm độc aflatoxin 11 1.2.8 Phương pháp phát aflatoxin 12 1.3 Phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin 15 1.3.1 Phương pháp vật lý học 15 1.3.2 Phương pháp hóa học 17 1.3.3 Phương pháp sinh học 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Thời gian – địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất 20 2.2.1 Vật liệu 20 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 20 2.2.3 Mơi trường – Hóa chất 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.1 Phương pháp luận 22 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 23 2.3.3 Một số phương pháp khảo sát sinh hóa vi khuẩn 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Phân lập chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ 40 3.1.1 Khảo sát khả đối kháng chủng khuẩn phân lập với nấm phương pháp đồng nuôi cấy môi trường hỗn hợp 40 3.1.2 Khảo sát khả đối kháng với nấm dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn môi trường hỗn hợp 42 3.2 Phân lập chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai 43 3.2.1 Khảo sát khả đối kháng chủng khuẩn phân lập với nấm mốc môi trường PDA 47 3.2.2 Khảo sát khả ức chế khả sinh aflatoxin chủng khuẩn phân lập với nấm môi trường CCA 48 3.3 Khảo sát sinh hóa chủng khuẩn phân lập đƣợc 50 3.3.1 Nhuộm bào tử 50 3.3.2 Thử nghiệm Simmon citrate 51 3.3.3 Thử nghiệm catalase 52 3.3.4 Thử nghiệm protease 52 3.3.5 Thử nghiệm chitinase 53 3.3.6 Thử nghiệm lên men carbohydrate 53 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 57 4.1 Kết luận 57 4.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TĂT A.O.A.C: Association of Analytical Communities CCA: coconut cream agar Ctv: cộng tác viên ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FDA: Food and Drug Administration HPTLC : high ferformane thin layer chromatography TLC NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth PDA: Potato dextrose agar PDB: Potato dextrose broth ppb: parts per billion TFA: Tryfloacetic acid TLC: Thin layer chromatographi UV: Ultraviolet iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 1.1 Tính chất hóa lý số aflatoxin .5 Bảng 1.2 Một số lồi nấm có khả sinh aflatoxin .6 Bảng 1.3 Ảnh hƣởng aflatoxin có mặt thức ăn đến biểu bệnh lý vật nuôi Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin số nƣớc theo tiêu chuẩn FDA .10 Bảng 1.5 Những quy định tạm thời cho phép thức ăn chăn nuôi nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi Việt Nam 11 Bảng 1.6 Các phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin đƣờng sinh học 16 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái nguồn gốc chủng vi khuẩn phân lập 40 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn CS1b 51 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH TRANG Hình 1.1 Cơ chế tác dụng aflatoxin B1 mức tế bào gan Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin 23 Hình 2.2 Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ 24 Hình 2.3 Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ hai 29 Hình 3.1 Kết đối kháng chủng vi khuẩn phân lập đƣợc môi trƣờng hỗn hợp 41 Hình 3.2 Kết đối kháng nấm dịch tăng sinh môi trƣờng PDA 44 Hình 3.3 Chủng vi khuẩn CS1a phân lập từ trái cà phê 45 Hình 3.4 Chủng vi khuẩn CS1b phân lập từ trái cà phê 46 Hình 3.5 Kết đối kháng nấm dịch ly tâm canh trƣờng với nấm mốc môi trƣờng PDA 48 Hình 3.6 Kết ức chế phát triển khả tổng hợp aflatoxin nấm mốc dịch ly tâm canh trƣờng vi khuẩn môi trƣờng CCA 49 Hình 3.7 Kết nhuộm bào tử khuẩn CS1b 51 Hình 3.8 Thử nghiệm Simmon citrate CS1b cho kết dƣơng tính 51 Hình 3.9 Thử nghiệm catalase CS1b cho kết dƣơng tính 52 Hình 3.10 Thử nghiệm protease Chủng CS1b cho kết dƣơng tính 52 Hình 3.11 Kết thí nghiệm chintinase Chủng CS1b cho kết âm tính 53 Hình 3.12 Kết lên men Glucose Chủng CS1b cho kết dƣơng tính 54 Hình 3.13 Kết lên men Lactose Chủng CS1b cho kết âm tính 54 Hình 3.14 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính 55 Hình 3.15 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính 55 v Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề - Mycotoxin hay độc tố nấm mốc nhóm độc chất tự nhiên nấm mốc sản xuất trình phát triển Ngƣời ta phát hàng ngàn loại mycotoxin (đƣợc sinh chủ yếu nhóm nấm mốc Aspergillus, Penicillium Fusarium), phải kể đến aflatoxin Aflatoxin vừa gây độc cấp tính (ở liều lƣợng lớn gây chết số loài gia súc, gia cầm) vừa gây độc mãn tính (ở liều lƣợng thấp tích tụ gan, gây rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thối hóa gan thận…) Một số nghiên cứu chứng minh aflatonxin nguyên nhân gây ung thƣ cho động vật thí nghiệm, nguy hiểm ngƣời Nhóm độc tố aflatoxin sinh chủ yếu hai loài nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus parisiticus Các loài nấm mốc có mặt nhiều số loại lƣơng thực nhƣ ngơ, lạc… vài loại hạt có chứa dầu Trong điều kiện nhiệt độ độ ẩm tƣơng đối cao nhƣ nƣớc ta, việc bảo quản nguồn lƣơng thực sau thu hoạch nhƣ nguồn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi cần thiết Nếu khơng có điều kiện bảo quản thích hợp điều kiện thuận lợi cho xâm nhập phát triển nấm mốc sinh aflatoxin Ngoài việc làm giảm chất lƣợng dinh dƣỡng cho lƣơng thực ngun liệu làm thức ăn chăn ni, mà gây tích tụ độc tố nguồn Điều gây tổn thất lớn cho ngành chăn ni nói chung cho ngƣời nơng dân nói riêng Bên cạnh đó, việc sử dụng nguồn lƣơng thực thực phẩm có tích tụ độc tố aflatoxin ảnh hƣởng không nhỏ đến sức khỏe ngƣời tiêu dung - Nhận đƣợc tình hình thực tế đó, nhà khoa nƣớc giới có nhiều nghiên cứu nhằm giải vấn đề Các tác nhân nhƣ vật lí, hóa học đƣợc đƣa thí nghiệm nhằm làm hiệu lực aflatoxin Đặc biệt, xu hƣớng đƣợc trọng dựa vào tác nhân vi sinh vật Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus…) đƣợc thử nghiệm khả làm giảm aflatoxin thu đƣợc kết khả quan Đồ án tốt nghiệp - Vì lí thực tiễn nhƣ trên, chúng tơi định chọn đề tài: “ Bƣớc đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin.” Trong khóa luận tốt nghiệp Mục đích - Phân lập tuyển chọn đƣợc vi khuẩn có khả kháng nấm Mục tiêu đề tài - Bƣớc đầu phân lập tuyển chọn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có khả kháng nấm sinh aflatoxin Nơi dung đồ án - Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin - Sàng lọc tuyển chọn vi khuẩn dựa hoạt tính đối kháng hoạt tính ức chế sinh tổng hợp aflatoxin nấm mốc - Định danh sơ vi khuẩn xác định chế kháng nấm mốc sinh aflatoxin thử nghiệm sinh hóa Kết cấu đồ án - Chƣơng I: Tổng quan tài liệu – nội dung chƣơng đề cập đến nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu - Chƣơng II: Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu – nội dung chƣơng đề cập đến dụng cụ, thiết bị phƣơng pháp nghiên cứu đồ án - Chƣơng III: Kết thảo luận – nội dung chƣơng đƣa kết mà đề tài thực đƣợc đƣa thảo luận, biện chứng cho kết thu đƣợc - Chƣơng IV: Kết luận đề nghị - nội dung chƣơng tóm lại kết mà đề tài đạt đƣợc đề nghị cho hƣớng cần cải thiện thêm đề tài Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 - Độc tố nấm mốc: Độc tố nấm mốc hay gọi mycotoxin hợp chất có phân tử nhỏ, bền điều kiện, sản phẩm trao đổi chất thứ cấp trình phát triển loài vi nấm Các mycotoxin dễ dàng xâm nhập giữ đƣợc độc tính chuỗi thức ăn khó khăn để loại bỏ tiêu diệt - Độc tố nấm mốc đƣợc phát lần đầu liên vào năm 1960, sau chết hàng loạt hàng trăm cá thể trang trại gà tây Anh (T Asao ctv,1963; F.Wu P Khlangwiset, 2010) - Cho đến có 300 loại độc tố nấm mốc đƣợc phát nghiên cứu Nhƣng có 20 loại độc tố nấm mốc có độc tính gây hại - Bệnh nấm mốc ngƣời động vật khơng có khả lây lan chúng tác nhân độc tố (hóa học) gây ra.Tuy nhiên, hầu nhƣ tất sản phẩm thực vật chất cho phát triển nấm mốc tạo mycotoxin tiếp theo, có khả nhiễm trực tiếp cho thực phẩm ngƣời Khi gia súc ăn thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng khơng chịu tác dụng trực tiếp mà nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, nhƣ tạo nhiễm mycotoxin cho ngƣời 1.2 Độc tố aflatoxin: 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu: - Aflatoxin mycotoxin đƣợc phát sớm vào năm 1961 nhà khoa học Butler Qua việc xác định đƣợc loài Aspergillus flavus tiết độc tố gây chết hàng loạt gà tây Anh, ông đặt tên cho độc tố aflatoxin (độc tố sinh Aspergillus flavus) (W.H Butler, 1964) - Các cơng trình nghiên cứu sau xác nhận Aflatoxin đƣợc tạo nấm Aspergillus flavus nguyên nhân gây khối u gan động vât (Halver, 1969; Wales, 1970; New, 1987 trích dẫn Chaver-Sanchelez, 1994) Đồ án tốt nghiệp - Từ trở có nhiều cơng trình nghiên cứu độc tố Aflatoxin Các nhà khoa học xác định đƣợc công thức phân tử công thức cấu tạo Aflatoxin 1.2.2 Tính chất vật lý phân loại: - Aflatoxin nhóm khoảng 20 chất sản phẩm trao đổi nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Bốn nhóm aflatoxin đƣợc tạo tự nhiên B1, B2, G1 G2 Bốn chất đƣợc phân biệt sở màu phát quang chúng B chữ viết tắt Blue (màu xanh nƣớc biển), G chữ viết tắt Green (màu xanh cây) Aflatoxin B1 B2 sữa bò đƣợc chuyển hóa gọi aflatoxin M1 aflatoxin M2 (M chữ viết tắt Milk) (F Wu P Khlangwiset, 2010) - Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B1 đƣợc tìm thấy nồng độ cao nhất, sau G1, B2 G2 tồn nồng độ thấp chúng có cơng thức cấu tạo nhƣ sau: O O O O O O O OCH3 O O Aflatoxin B1 O O O O O OH OH OCH3 O O O Aflatoxin M2 O O O OCH3 O Aflatoxin M1 O OCH3 Aflatoxin B2 O O O O O O O O OCH3 O Aflatoxin G2 Aflatoxin G1 O OCH3 Đồ án tốt nghiệp - Các aflatoxin tan methanol, acetone chloroform, không tan dung môi không phân cực Aflatoxin tƣơng đối không ổn định tiếp xúc với ánh sáng, đặc biêt tiếp xúc với tia cực tím, tác nhân oxy hóa, dung mơi phân cực hay dung dịch có pH nhỏ hay lớn 10 Aflatoxin có nhiệt độ nóng chảy từ 2370C (G1) đến 2990C (M1), nhƣng không bị phá hủy điều kiện nấu ăn bình thƣờng Có thể phân hủy hoàn toàn chúng nồi hấp tiệt trùng có bổ sung thêm ammoniac xử lý chất tẩy rữa Bảng 1.1 Tính chất hóa lý số aflatoxin Công Trọng thức phân lƣợng tử phân tử B1 C17H12O6 312 268-269 Xanh lam B2 C17H14O6 314 268-289 Xanh lam G1 C17H12O7 328 244-246 Xanh lục G2 C17H14O7 330 229-231 Xanh lục M1 C17H12O7 328 299 Xanh lam tím M2 C17H14O7 320 293 Tím Aflatoxin Điểm nóng chảy (0C) Huỳnh quang Nguồn: Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc Diệp, 2003 1.2.3 Sự tạo thành aflatoxin nấm mốc: - Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu đƣợc tìm thấy hai chủng nấm mốc Asp.flavus Asp parasiticus Các chủng tạo aflatoxin Asp flavus phổ biến thƣờng đƣợc phân lập từ nguồn khác nhƣ lạc, hạt bông, hạt gạo, lúa Theo số liệu Schoroder Boller (1976), có từ 20-98% chủng phân lập Asp flavus có khả tạo aflatoxin - Ngoài hai loài Asp flavus Asp parasiticus có số lồi khác có khả sinh aflatoxin nhƣng yếu nhƣ Asp nominus (C.P Kurtzman ctv, 1987) Asp bombycis (S.W Peterson ctv,2001) Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2 Một số lồi nấm mốc có khả sinh aflatoxin Lồi nấm mốc Aflatoxin G1 Tác giả B1 B2 G2 Aspergillus flavus + + Aspergillus parasiticus + + + + Coduer ctv, 1963 Aspergillus nomius + + + + Kurzman vad ctv, 1987 Aspergillus oryzae + Basappa ctv, 1967 Aspergillus niger + Kulik Holaday, 1967 Aspergillus wentii + Kulik Holaday, 1967 Aspergillus ruber + Kulik Holaday, 1967 Aspergillus ostianus + Aspergillus orchraceus + Penicillium puberulum + Penicillium variabile + Kulik Holaday, 1967 Penicillium frequentans + Kulik Holaday, 1967 Penicillium citrinum + Kulik Holaday, 1967 Rhizopus sp + Van Walbeck ctv, 1968 Sargeant ctv, 1961 + Scot ctv, 1968 Van Walbeck ctv, 1968 + + + Kulik Holaday, 1967 Nguồn: Phạm Hồng Thái, 2007 - Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh độc tố aflatoxin nhƣ chủng nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ nƣớc, yếu tố môi trƣờng… - Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, cực đại cho tạo aflatoxin 120C, 270C 40 – 420C theo thứ tự Một số chủng nấm mốc bị hoạt tính sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp mơi trƣờng khơng thích hợp, nhƣng khả sinh độc tố tăng chủng nấm mốc đƣợc cấy chuyển môi trƣờng thích hợp - Mơi trƣờng có bổ sung nấm men peptone axit amin với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ 26 – 280C) điều kiện tốt cho tạo thành độc tố aflatoxin Đồ án tốt nghiệp 1.2.4 Cơ chế gây độc aflatoxin - Aflatoxin có khả liên kết với DNA nhân tế bào Sự liên kết gây ức chế enzym polymerase RNA Nó gây tác dụng hạn chế tổng hợp RNA ức chế polymerase t-RNA Đây nguyên nhân gây hạn chế tổng hợp protein tế bào Ngƣời ta chứng minh vòng α,β -lacton khơng bão hòa có phân tử aflatoxin làm cho hợp chất có hoạt tính gây ung thƣ vòng lacton gây ức chế tổng hợp DNA nhân tế bào, làm rối loạn tăng trƣởng bình thƣờng tế bào (M.F.Nexterin V.I.A Vixarinova, 1971, trích dẫn Lê Anh Phụng, 2001) - Để gây độc với tế bào gan nhƣ tạo khối u, aflatoxin phải trải qua trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 – dhd) gan Theo Neal cộng (1981), hợp chất nguyên nhân gây hủy hoại gan nhanh Nhóm dialdehyde phản ứng với nhóm amin protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA gây nhiễm độc cấp tính (Hình 1.1) Hình 1.1 Cơ chế tác dụng aflatoxin B1 mức tế bào gan (Cliford Rces,1967 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc, 2003) Đồ án tốt nghiệp 1.2.5 Độc tính aflatoxin: Theo Dƣơng Thanh Liêm (2002), aflatoxin gây tác hại lớn cho thể ngƣời động vật Những tác hại nhƣ sau: - Gây tổn thƣơng tế bào gan: tất trƣờng hợp xác nhận ngộ độc aflatoxin có bệnh tích giống gan động vật bị nhiễm hƣ hại nặng Tùy theo mức độ nhiễm hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích gan có biểu khác Biểu chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tƣơi, mật sƣng Sau gan sƣng to lên, mật căng phồng bắt đầu mụt nhỏ bề mặt gan làm cho gồ ghề đơi có nốt hoại tử màu trắng Sau nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể - Thận bị sƣng to làm cho việc thải chất độc khỏi thể trở nên khó khăn Từ làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng - Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả tiêu hóa chất dinh dƣỡng thức ăn Đôi thấy tổn thƣơng miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn - Làm giảm khả đề kháng động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể Do nhiễm aflatoxin thể mẫn cảm với bệnh thơng thƣờng, gây tử vong cho thú - Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thƣờng, gây rối loạn sinh sản - Làm giảm thèm ăn thức ăn phát triển nấm mốc làm mùi thức ăn - Làm thay đổi thành phần dinh dƣỡng có thức ăn, giá trị dinh dƣỡng bị hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển - Làm giảm thấp sinh trƣởng giá trị kinh tế vật nuôi Hậu cuối gây chết cho vật ni Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3 Ảnh hƣởng aflatoxin có mặt thức ăn đến biểu bệnh lý vật ni (Allcroff, 1969 trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc, 2003) Loại gia súc Lợn (20-70kg) Lợn (40-100kg) Lợn (70-100kg) Lợn nái (có chửa) Gà tây (1 ngày tuổi) Gà thịt (1 ngày tuổi) Vịt (7 ngày tuổi) Bê (4 ngày tuổi) Lƣợng Thời aflatoxin kỳ thức ăn nuôi ngày dƣỡng (mg/kg) (tuần) 0.14 12 Trung bình Bình thƣờng 0.28 12 Nhẹ Giảm sút 0.41 12 Nhẹ Giảm sút 0.28 0.41 20 Nhẹ Giảm sút 0.69 Trung bình Bình thƣờng 0.3-0.55 Rõ 0.25 Rõ 0.2 Nhẹ 0.42 Nhẹ 0.5 Nặng 0.03 0.2 16 Ảnh hƣởng tới Tổn thƣơng gan phát triển hiệu thức ăn Suy giảm số chết Chậm phát triển giảm trọng lƣợng Giảm trọng lƣợng tuần Đặc điểm điển hình Giảm trọng lƣợng, nhiễm aflatoxin chết 50% Trung bình Giảm trọng lƣợng từ 0-3 tháng Giảm lƣợng sữa Bò sữa 1.5 Trung bình Aflatoxin M1 có mặt sữa Đồ án tốt nghiệp 1.2.6 Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin Trƣớc thực trạng nhiễm aflatoxin lƣơng thực, thực phẩm mức độ cao - nhƣ tính độc aflatoxin động vật kinh tế ảnh hƣởng sức khỏe ngƣời, nhiều quốc gia giới có quy định giới hạn aflatoxin nhiễm lƣơng thực, thực phẩm Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin số nƣớc theo tiêu chuẩn FDA Giới han Aflatoxin cho phép Nƣớc 20 ppb Loại thức ăn Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm tất giai đoạn khác Hàm lƣợng tối đa cho phép thức ăn Mỹ 20 ppb cho gia súc, gia cầm nguyên liệu bột ngô Châu Âu ppb Thực phẩm sử dụng cho ngƣời Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng số Canada 15ppb tất loại độc tố aflatoxin B1, B2, G1, G2 Úc 15 ppb 10 ppb Nhật Châu Á - 100 ppb Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tƣơng lạc Cho tất loại thực phẩm chứa B1 Cho loại nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi 30 ppb Tất loại lƣơng thực, thực phẩm 120 ppb Trong sản phẩm từ lạc Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn quy định hàm lƣợng tối đa aflatoxin B1 hàm lƣợng tổng số aflatoxin (B1+ B2 + G1+ G2) đƣợc tính mg 1kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm (ppb) 10 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.5 Những quy định tạm thời cho phép thức ăn chăn nuôi nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi Việt Nam (Tài liệu Vụ KHKT CLSP Bộ Nông nghiệp PTNT) Lƣợng Aflatoxin Nguyên liệu B1 tối đa (ppb) Tổng số Aflatoxin B1 + B2 + G1 + G2 (ppb) Ngô hạt 100 150 Sắn khô 50 100 Đậu tƣơng 50 100 Cám gạo 50 100 Bột cá 10 20 Thức ăn cho gà (1 – 21 ngày tuổi) 10 30 Thức ăn cho gà (nhóm lại) 30 50 Thức ăn cho vịt (1 – 21 ngày tuổi) 10 Thức ăn cho vịt (nhóm lại) 10 20 Thức ăn cho lơn (1 – 60 ngày tuổi) 20 50 Thức ăn cho lợn (nhóm lại) 100 200 Bò ni lấy sữa 20 50 1.2.7 Tình hình nhiễm độc aflatoxin - Aflatoxin có mặt nhiều sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt loại hạt có dầu nhƣ lạc, đậu tƣơng ngơ (Blaney, 1985 trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc, 2003) Ở vùng Đông Nam Á Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin sản phẩm nông nghiệp đáng kể - Nhiễm aflatoxin điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập sâu mọt bảo quản tạo điều kiện thuận lợi cho lây lan phát triển nhanh chóng Aspergillus flavus Trong điều kiện thuận lợi, Asp flavus tăng nhanh sau – ngày bảo quản 11 Đồ án tốt nghiệp - Nhiễm độc aflatoxin lợn vấn đề quan trọng, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu Smith (1976) số 94 trƣờng hợp phát aflatoxin có thức ăn chăn ni có đến 83 trƣờng hợp gây ngộ độc lợn, trƣờng hợp bò trƣờng hợp gia cầm Hàm lƣợng aflatoxin trung bình có thức ăn chăn ni 389 ppb ngô nguyên liệu làm thức ăn 518 ppb (Trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê thị Ngọc Diệp, 2003) - Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét Ginting (1985) Widiastut (1988), ngô thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lƣợng lên tới 200 ppb Ở Úc, theo Barry J Balaney, 161 mẫu thức ăn cho gia cầm đƣợc phân tích có 13 mẫu chứa aflatoxin, có mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lƣợng lên đến 50 ppb (Trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê thị Ngọc Diệp, 2003) 1.2.8 Phƣơng pháp phát aflatoxin: 1.2.8.1 - Phương pháp phát quang sinh học : Dùng tia cực tím tạo huỳnh quang màu vàng xanh sáng từ acid kojic (acid đƣợc tạo loại nấm sản sinh aflatoxin, gián tiếp phát có mặt aflatoxin) Phƣơng pháp không thông du ̣ng vì it́ chin ́ h xác 1.2.8.2 - Phương pháp "ELISA test": Dƣ̣a nguyên tắ c kháng thể kháng nguyên p hát aflatoxin (và độc tố khác) thông qua phƣơng tiện phát nhanh, rẻ, dễ thực hiện, sử dụng kháng thể để "bắt" (có lựa chọn) độc tố đặc biệt đƣợc tách chiết từ hạt hay thành phần thƣ́c ăn Sau chiết, sử dụng kiểm tra thêm chất thị màu Cƣờng độ màu sắc thị có độc tố hay khơng 1.2.8.3  - Phân tích aflatoxin phương pháp sắc kí Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatographi-TLC ) Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định hàm lƣợng aflatoxin lần vào năm 1960 Ngƣời ta sử dụng mỏng đƣợc tráng silicagel để xác định aflatoxin 12 Đồ án tốt nghiệp - Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy mỏng chloroforin: methnol choloroform: aceton Việc thêm nƣớc vào hệ thống dung mơi làm tăng khả hòa tan aflatoxin - Hệ dung môi gồm nƣớc: aceton: chloroform (1.5:12:88 v/v) đƣợc đánh giá có khả hòa tan aflatoxin tốt Các mỏng đƣợc chảy qua dung môi chạy đƣợc đƣa vào đèn tử ngoại (UV) 365nm Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh Và có độ dài Rf đƣợc so sánh với vết aflatoxin tiêu chuẩn Phƣơng pháp đƣợc xác định lƣợng từ 0.3-0.4 mg - Nhƣợc điểm phƣơng pháp phụ thuộc vào ngƣời phân tích Khi so sánh mẫu vết độc tố chuẩn có sai lệch kết từ 20-30% - Hội hóa học phân tích (A.O.A.C-1980) lƣu ý tới phƣơng pháp phân tích định lƣợng sử dụng TLC Phƣơng pháp đƣợc mở rộng thành chƣơng trình phân tích mẫu tổ chức nghiên cứu ung thƣ giới Các kết chƣơng trình phân tích chứng nhận xác phân tích TLC sai số cao Khẳng định có mặt aflatoxin: - Một số chất đƣợc tách từ mẫu dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến khẳng định sai lệch Phƣơng pháp khẳng định có mặt aflatoxin trực tiếp thực sắc kí Dựa vào biến đổi aflatoxin thành đồng phân có màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, aflatoxin chuẩn aflatoxin có mẫu phân tích chuyển sang đồng phân - Thử nghiệm khẳng định có mặt aflatoxin mẫu phân tích đƣợc phát Przybylski (1975) Verhulsdonk (1977) đƣợc hội phân tích hóa học Hoa Kì (A.O.A.C) cơng nhận - Aflatoxin B1 đƣợc đƣợc acid hóa để trở thành đồng phân aflatoxin B2a Đồng phân có màu huỳnh quang màu xanh có độ dài Rf thấp so với độ dài Rf aflatoxin B1 Theo phƣơng pháp Przybylski, aflatoxin Bi đƣợc chuyển thành aflatoxin B2a nhờ acid Tryfloacetic (TFA) phun trực tiếp lên mỏng trƣớc chạy dung môi 13 Đồ án tốt nghiệp Acid sufuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời aflatoxin B1 - thành màu vàng Thử nghiệm nhằm khẳng định khơng có mặt aflatoxin vết nghi ngờ khơng chuyển thành màu vàng  Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao (high ferformane thin layer chromatography-HPTLC): Do khiếm khuyết phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đơn - khâu nhƣ chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu dung mơi, phƣơng pháp HPTLC có tính thuyết phục cao khía cạnh sau: đƣa mẫu lên mỏng cách tự động, cải thiện đƣợc đồng lớp hấp phụ, chạy mỏng dung mơi có kiểm sốt Q trình đƣa mẫu vào mỏng đƣợc tự động hóa, vết đƣợc định - vị trí đo lƣờng độ huỳnh quang vết máy densitometess Thể tích mẫu đƣợc dùng HPTLC 1l so với 5-10l mẫu - phƣơng pháp TLC, nhƣ làm giảm nhiều diện tích vết (=1mm) Nồng độ chất chuẩn cần pg phân tích HPTLC, xác định tới 30 pg (0.03 g) aflatoxin B1 lạc Sử dụng kĩ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục phƣơng pháp TLC - nhƣ phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin có hiệu  Phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp (high ferformane liquid chromatogaphy - HPLC): - Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC hệ thơng phân tích đắt tiền, chọn lọc, dùng định lƣợng Aflatoxin Phƣơng pháp HPLC sử dụng hai pha: Pha bình thƣờng pha phản - Hệ thống dựa hấp thụ tia tím (UV) xác định cƣờng độ huỳnh quang - Mẫu phân tích đƣợc tách chloroform: nƣớc Ly tâm chất tác dụng làm qua silicagel pha bình thƣờng sử dụng cột nhồi silicagel 0.5m pha động sử dụng benzen: acetonitrit: acid formic Giới hạn xác định 0.5 m/kg 14 Đồ án tốt nghiệp - Husst (1984) sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định đƣợc Aflatoxin B1, B2, G1, G2 nồng độ 5pg - Davis (1980) sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang đồng phân iot Aflatoxin B1  - Phƣơng pháp sắc kí cột Phƣơng pháp cột mini nhằm xác định nhanh aflatoxin có mẫu Phƣơng pháp đơn giản, tốn kém, xác định định tính - Kĩ thuật nhồi cột mini cột sắc kí hạt thủy tinh hay chất dẻo có kích thƣớc khoảng 3-6 mm chiều rộng 20 cm chiều dài Dung dịch chiết tách đƣợc làm dung môi, dung môi hòa tan lƣợng nhỏ benzen hay chloroform Cột đƣợc nhồi silicagel nhƣ chất hấp thụ quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại (uv) để xác định màu huỳnh quang xanh có mặt aflatoxin - Nhiều tác giả nhƣ Davis cộng (1981), Holaday (1976), Holaday Lansden(1975) cải tiến phƣơng pháp nhằm phát nhanh aflatoxin mẫu Phƣơng pháp cột mini Romes (1975) đƣợc A.O.A.C (1980) công nhận Aflatoxin đƣợc tách aceton nƣớc (85: 45), chất tạp đƣợc loại gel cacbonat đồng chloric sắt Sau đó, aflatoxin đƣợc tách pha nƣớc với chloroform - Chloroform tách đƣợc đƣa vào cột có chứa lớp bột nhơm trung tính, silicagel florisil phía dƣới, sunfat canxi khơ dƣới Cột đƣợc chạy choloroform aceton (9:1) để giữ aflatoxin đỉnh lớp flosisil 1.3 Phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin: 1.3.1 Phương pháp vật lý học: - Phân hủy aflatoxin khơng khí nóng: dùng khơng khí nóng thổi qua ngun liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lƣợng aflatoxin đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu, phƣơng pháp đem lại nhiều kết đáng kể Nếu nhiệt độ không khí nóng đƣa vào 100 - 1450C ngơ hạt lƣợng aflatoxin B1 giảm từ 877 ppb 452 ppb, từ 378 ppb 213 ppb 15 Đồ án tốt nghiệp - Nếu tăng nhiệt độ lên tới 1650C làm cho lƣợng aflatoxin B1 giảm từ 66 - 67%.(Lee, 1969; Waltking, 1971; Elkady, 1981; Frank, 1974; trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) - Phân hủy aflatoxin hấp ƣớt áp suất cao: phƣơng pháp hấp ƣớt nhiệt độ cao dƣới áp lực nƣớc đem lại kết khả quan Quá trình phá hủy nhanh chóng vòng lacton cấu trúc phân tử aflatoxin Theo Rehana (1979) nhận thấy gạo nhiễm aflatoxin từ 400 - 4000 ppb đƣợc hấp ƣớt phút 1200C (thêm nƣớc vào gạo tỷ lệ 1:4) làm giảm hàm lƣợng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 đƣợc hấp ƣớt 1200C giảm 370 ppb Ở hàm lƣợng aflatoxin thấp (760 ppb) đƣợc hấp 1,5 atm vòng phân hủy hồn tồn aflatoxin (Rehana, 1979 trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) - Làm giảm aflatoxin chất hấp phụ kết dính độc tố: chất hấp phụ thƣờng chất vô hữu (tự nhiên nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao Các chất có khả hấp phụ aflatoxin gồm: than hoạt tính, số polymer hữu vơ có chất aluminosilicat nhƣ bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), số polymer hữu tự nhiên (alfalfa) nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) Những chất không đƣợc hấp phụ qua ruột mà đƣợc thải (Charmley, 1994; trích dẫn Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) - Tách aflatoxin dung môi hữu cơ: phƣơng pháp áp dụng thức ăn nguyên liệu làm thức ăn chăn ni, có khả tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin thu hồi đƣợc dung môi mà không ảnh hƣởng đến thành phần dinh dƣỡng thức ăn - Những kết có nhiều hứa hẹn thu đƣợc việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan – etanol - nƣớc, hexan –aceton - nƣớc Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44% hexan 2% nƣớc (tính theo trọng lƣợng) hệ thống thành cơng đƣợc tìm thấy, đồng thời 16 Đồ án tốt nghiệp loại trừ dầu từ bánh ép khô lạc gồm 12% - 15% dầu dƣ lƣợng lipid gần 1% mức aflatoxin thấp 40μg/kg - Phân hủy aflatoxin tia xạ: aflatoxin mẫn cảm với tia cực tím Ở bƣớc sóng 365 nm, khả hấp phụ aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978) nhận thấy, lƣợng aflatoxin bắp (150 ppb 250 ppb) giảm tới 30% 16% 10 tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) 1.3.2 Phương pháp hóa học: - Phƣơng pháp sử dụng chất oxi hóa-khử: chất oxy hóa-khử nhƣ natrihypochloride (NaOCl), hydroperoxide (H2O2) đƣợc sử dụng để làm độc tính aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin làm màu sắc hạt biến chất acid amin Khí ozon (O3) đƣợc thử nghiệm khả phân hủy aflatoxin mẫu đạt đƣợc hiệu tốt, song có chứng chất lƣợng thành phần thức ăn bị giảm đặc biệt protein, vitamin - Phƣơng pháp sử dụng chất kiềm: hydroxit amon (NH4OH) hyroxit natri (NaOH) chất kiềm đƣợc sử dụng làm vô hoạt afaltoxin Các chất có hoạt tính mạnh, phá vỡ vòng lacton cấu trúc phân tử aflatoxin - Phƣơng pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm chứng minh hiệu việc dùng khí NH3 làm vơ hoạt aflatoxin Xử lý ngơ khí NH3 đƣợc đặc biệt quan tâm ứng dụng Ngƣời ta nhận thấy, hàm lƣợng NH3 0,5 1,5% nhiệt độ bên 250C, 14 ngày tiếp xúc, lƣợng aflatoxin từ 200ppb giảm xuống 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) 17 Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Phương pháp sinh học: - Mặc dù biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đƣợc khuyến cáo áp dụng, nhƣng nhiễm aflatoxin ngô, lạc mức độ cao giới hạn tránh đƣợc điều kiện bảo quản bất lợi Vấn đề khử nhiễm aflatoxin đƣờng sinh học nhằm thay cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin hóa chất có giá thành cao làm biến đổi phẩm chất lƣợng lƣơng thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản đƣợc chứng minh phƣơng pháp hứa hẹn Khử nhiễm độc tố aflatoxin phƣơng pháp sinh học đƣợc định nghĩa nhƣ phân giải enzyme hay chuyển hóa sinh độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật Bảng 1.6 Các phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin đƣờng sinh học Tên vi khuẩn Bacillus pumilus Đối tƣợng Cơ chế khử nhiễm Tác giả Aspergillus Sử dụng sản phẩm trao đổi parasiticus chất ngoại bào, sinh q C Munimbazi trình ni cấy B pumilus, ức chế LB.Bullerman, phát triển trình tổng 1997 hợp độc chất aflatoxin nấm Asp parasiticus Streptomyces sp Aspergillus Streptomyces sp tổng hợp đƣợc M Ono parasiticus Aflastatin A, hợp chất có ctv ,1996 chất protein, ức chế số T Kondo enzyme esterase tham gia ctv, 2001 trình tổng hợp độc chất aflatoxin nấm Asp parasiticus Achromobacter Aspergillus A xylosoxidan tổng hợp PS Yan xylosoxidans parasiticus Cyclo(L-leucyl-L-prolyl), ctv, 2004 cyclodipeptide, ức chế phát triển tổng hợp aflatoxin nấm Asp parasiticus 18 Đồ án tốt nghiệp Tên vi khuẩn Đối tƣợng Lactobacillus Aspergillus casei flavus Cơ chế khử nhiễm Tác giả Sử dụng sản phẩm trao đổi I Chang JD Kim, chất ngoại bào, sinh 2007 trình ni cấy L casei, ức chế phát triển trình tổng hợp độc chất aflatoxin nấm Asp flavus Bacillus subtilis Aspergillus B subtilis tổng hợp enzyme R Thakaew flavus ngoại bào nhƣ protease, ctv, 2013 chitinase, β-1,3-glucanase làm ức chế phát triển nấm Asp flavus 19 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian – địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ ngày - - 2014 đến ngày 30 - - 2014 - Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM 2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 2.1.1 Vật liệu - Nguồn nấm đối kháng: chủng nấm Aspergillus sp.X3 có khả tổng hợp aflatoxin, sinh viên Nguyễn Vân Hƣơng phân lập đƣợc từ đậu phộng (Xem phụ lục B) - Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn:  Mẫu hạt đậu phộng đƣợc mua từ chợ  Mẫu vỏ đậu phộng  Mẫu hạt cà phê đƣợc lấy từ Đà Lạt  Mẫu trái cà phê đƣợc lấy từ Đà Lạt  Mẫu đât trồng rau Quận 12 TP Hồ Chí Minh 2.1.2 Thiết bị dụng cụ - Thiết bị: tủ ủ, tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), máy li tâm, cân phân tích, máy soi UV, máy nƣớc cất, bếp từ, kính hiển vi quang học, … - Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, cốc thủy tinh (bacher), bình tam giác (erlen), ống đong, pipet thủy tinh, micropipet, đầu típ, ống li tâm eppendorf, que cấy, đèn cồn, y tế, không thấm, bao PE,… 2.1.3 Mơi trường - Hóa chất 2.1.3.1 Mơi trường (Xem phụ lục A) - Môi trƣờng Potato Dextrose Broth (PDB) - Môi trƣờng Potato Dextrose Agar (PDA) - Môi trƣờng tăng sinh Nutrient Broth _ NB1 (bổ sung tơ nấm) - Môi trƣờng tăng sinh Nutrient Broth (NB) - Môi trƣờng Nutrient Agar (NA) 20 Đồ án tốt nghiệp - Môi trƣờng Coconut Cream Agar (CCA) - Môi trƣờng Simmon Citrate - Môi trƣờng Phenol red carbohydrate broth - Mơi trƣờng kiểm tra hoạt tính  Mơi trƣờng Casein 1%  Mơi trƣờng Chitin 1% 2.1.3.2 Hóa chất - Dịch chiết khoai tây - Dịch tơ nấm - Dịch nƣớc cốt dừa - D- Glucose - Peptone - Cao thịt (meat extract) - Casein - Chitin - NaCl - Agar - Chloramphenicol - Phenol red - Thuốc nhuộm: crystal violet, lugol, malachite green, fushin - Hydro peroxide (H2O2) 30% 21 Đồ án tốt nghiệp 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp luận - Để thực đề tài bƣớc đầu phân lập vi khuẩn Bacillus spp có hoạt tính kháng nấm, chúng tơi sử dụng hai cách tiếp cận  Cách tiếp cận thứ nhất, vi khuẩn đƣợc phân lập từ nguồn mẫu nông sản (hạt cà phê, đậu phộng) bị nhiễm nấm Sau khảo sát khả đối kháng trực tiếp vi khuẩn với nấm sinh aflatoxin phƣơng pháp đồng nuôi cấy  Cách tiếp cận thứ hai, nguồn mẫu nông sản (trái cà phê, vỏ đậu phộng, đất trồng) bị nhiễm nấm, đƣợc tăng sinh mơi trƣờng có chứa chất cảm ứng sinh khối nấm mốc đƣợc sàng lọc dựa khả kháng nấm sinh aflatoxin mẫu tăng sinh Sau phân lập chủng khiết khảo sát khả đối kháng với nấm dịch ly tâm canh trƣờng chủng khiết 22 Đồ án tốt nghiệp 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 23 Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ 24 Đồ án tốt nghiệp  Tăng sinh: - Mục đích: Phục hồi vi khuẩn lại mẫu sau q trình thu thập vận chuyển - Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng NB đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút - Cân xác g mẫu cho vào bình tam giác chứa 9ml mơi trƣờng NB hấp khử trùng Tăng sinh lắc 150 vòng/phút 48h  Pha lỗng mẫu: - Mục đích: Làm giảm mật độ vi khuẩn có mặt dịch tăng sinh mẫu, giúp cho việc phân lập riêng lẻ tế bào vi khuẩn dễ hàng - Chuẩn bị ống nƣớc muối sinh lý (nồng độ NaCl 0.85%) tích 9ml đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút - Hút 1ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ chứa 9ml nƣớc muối sinh lí, ta đƣợc dịch có nồng độ pha lỗng 10-1 so với mẫu Tiếp tục hút 1ml từ ống thứ cho vào ống thứ hai chứa 9ml nƣớc muối sinh lí, ta đƣợc dịch có nồng độ pha lỗng 10-2 so với mẫu Tiếp tục tiến hành tƣơng tự nồng độ cần thiết  Phân lập: - Mục đích: Phân tách riêng chủng vi khuẩn có dịch mẫu tăng sinh, giúp cho việc chọn lọc chủng vi khuẩn đồng - Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng NA đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Đƣợc phối vào đĩa petri đƣợc hấp khử trùng, đĩa khoảng 15ml - Cấy mẫu phân tách khuẩn lạc riêng rẽ: tiến hành cấy trang mẫu độ pha loãng 10-5,10-6,10-7 Mỗi nồng độ tiến hành cấy trang đĩa, sau đƣợc ủ 370C 24 – 48h - Quan sát hình thái khuẩn lạc sau thời gian ủ, ghi nhận kết Cấy ria làm chủng khuẩn cho hình thái khuẩn lạc khác đĩa mơi trƣờng NA 25 Đồ án tốt nghiệp - Khi chủng khuẩn tiến hành giữ giống ống thạch nghiêng môi trƣờng NA giữ giống lạnh sâu eppendorf, phục vụ cho thí nghiệm  Bảo quản giữ giống vi sinh vật - Mục đích: lƣu trữ bảo quản chủng phân lập đƣợc, đảm bảo nguồn giống để thực thí nghiệm nghiên cứu có liên quan đến vi khuẩn Có thể giữ giống hai cách, giữ giống ống thạch nghiêng giữ giống lạnh sâu - Giữ giống ống thạch nghiêng: phƣơng pháp giữ giống đơn giản, vi khuẩn đƣợc cấy môi trƣờng thạch nghiêng ống nghiệm đặt điều kiện thích hợp để phát triển Sau đƣợc bảo quản tủ mát (khoảng 3-50C) Quá trình cần đƣợc lặp lại sau thời gian bảo quản định (tùy vào nhóm vi khuẩn), đảm bảo vi khuẩn không bị chết môi trƣờng khơng dinh dƣỡng bị già Trong nghiên cứu này, vi khuẩn đƣợc cấy lƣu giữ ống thạch nghiêng môi trƣờng NA (đƣợc hấp khử trùng để nguội tạo bề mặt nghiêng) Ủ 370C 24 giờ, sau bảo quản tủ mát Tiến hành cấy chuyển định kì lần tháng - Giữ giống lạnh sâu (giữ giống eppendorf giữ giống glycerol): vi khuẩn đƣợc lƣu điều kiện lạnh sâu Trong điều kiên này, tê bào vi khuẩn bị phá vỡ bi lạnh đông nhiệt độ thấp làm rã đông, làm tan mẫu (do tế bào vi khuẩn bị hinh thành mạng tinh thể nƣớc làm lạnh sâu) Để khắc phục điều ngƣời ta bổ sung chất làm giảm tốc độ lanh đông rã đông nhƣ glycerol Vi khuẩn tiến hành trao đổi chất nhƣ bình thƣờng nhƣng tồn chất bảo quản Thời gian lƣu giữ phƣơng pháp thƣờng dài (có thể từ 3-5 tháng) Trong nghiên cứu này, vi khuẩn đƣợc tăng sinh môi trƣờng NB 24 giờ, hút 2ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf Sau ly tâm (4000 vòng/ phút 15 phút), loại bỏ dich thu sinh khối lại eppendorf Bổ sung 0.9 ml nƣớc muối sinh lí trộn Bổ sung 0.6 ml glycerol tiếp tục trộn Cuối tiến hành bảo quản lạnh sâu nhiệt độ -15oC (Lưu ý: eppendorf, nước muối sinh lí đầu tip cần hấp khử trùng trước thực thao tác) 26 Đồ án tốt nghiệp  Khảo sát khả đối kháng chủng khuẩn phân lập với nấm phƣơng pháp đồng nuôi cấy môi trƣờng hỗn hợp - Mục đích: khảo sát khả ức chế nấm mốc chủng vi khuẩn phân lập Từ chọn chủng khuẩn có khả tiết hoạt chất kháng nấm - Tiến hành:  Các chủng vi khuẩn phân lập cấy vào bình tam giác chứa 10ml mơi trƣờng NB hấp khử trùng Lắc tăng sinh 150 vòng/phút 24  Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng hỗn hợp (tỉ lệ NA : PDA 1:2) đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Đƣợc phối vào đĩa petri đƣợc hấp khử trùng, đĩa khoảng 15ml  Khi thạch đông, bơm 0.1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào đĩa Trang bề mặt thạch Đối chứng đĩa môi trƣờng cấy nấm không bơm dịch tăng sinh vi khuẩn  Cấy nấm mốc vào đĩa môi trƣờng trang dịch tăng sinh vi khuẩn Ủ 300C ngày Đọc kết dựa vào phát triển nấm mốc đĩa thí nghiệm đĩa đối chứng cấy nấm  Khảo sát khả đối kháng với nấm dịch ly tâm canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn mơi trƣờng hỗn hợp - Mục đích: khảo sát khả ức chế nấm mốc sản phẩm trao đổi chất có mặt canh trƣờng tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập Từ chọn chủng khuẩn có khả tiết hoạt chất kháng nấm - Tiến hành:  Các chủng vi khuẩn phân lập cấy vào bình tam giác chứa 10ml môi trƣờng NB hấp khử trùng Lắc tăng sinh 150 vòng/phút 24  Mơi trƣờng sử dụng môi trƣờng hỗn hợp (tỉ lệ NA : PDA 1:2) đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Sau phối vào đĩa petri đƣợc hấp khử trùng, đĩa khoảng 15 ml 27 Đồ án tốt nghiệp  Khi đĩa môi trƣờng hỗn hợp đông, cấy nấm mốc vào tâm đĩa mơi trƣờng Đồng thời đục lỗ thạch góc cách điểm cấy nấm Sau ủ đĩa 300C 24h  Dịch tăng sinh vi khuẩn sau 24h đƣợc đem li tâm 10000 vòng/phút 15 phút Thu dịch loại bỏ sinh khối Tiến hành bơm 0.1ml dịch sau li tâm vào lỗ đĩa thạch ủ nấm đƣợc 24h Đối chứng đĩa nấm không thêm vào dịch li tâm giếng thạch Sau đĩa đƣợc tiếp tục ủ 300C 72h Đọc kết đối kháng dựa vào phát triển nấm mốc đĩa thí nghiệm đĩa đối chứng cấy nấm 28 Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.2 Phân lập tuyển chọn chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai 29 Đồ án tốt nghiệp  Xử lí mẫu: - Mục đích: Loại bỏ tế bào vi khuẩn khơng có khả sinh bào tử, giữ lại vi khuẩn có khả sinh bào tử tồn mẫu - Cân xác gam mẫu, sau tiến hành xử lý nhiệt 800C 10 phút  Phƣơng pháp nuôi cấy thu tơ nấm - Mục đích: thu nhận tơ nấm để bổ sung vào môi trƣờng, tạo nguồn chất cảm ứng cho vi khuẩn sử dụng đƣợc - Tiến hành:  Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng PDB, đƣợc phối vào bình tam giác 10ml, hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút  Dùng que cấy thu bào tử nấm từ ống thạch nghiêng, cấy vào bình mơi trƣờng PDB, lắc tăng sinh 150 vòng / phút 24  Lọc dịch nuôi cấy, thu nhận tơ nấm Hòa trộn vào nƣớc cất tạo huyền phù tơ nấm (10 g/l) Hấp khử trùng bảo quản tủ mát (4-60C)  Tăng sinh: - Mục đích: Phục hồi vi khuẩn lại mẫu sau trình xử lý mẫu Đồng thời tăng lên số lƣợng chủng khuẩn có khả đối kháng vói nấm mốc, mơi trƣờng ta có bổ sung thêm tơ nấm mốc đƣợc xem chất cảm ứng - Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng NB1 đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút - Mẫu đƣợc xử lí xong cho vào bình tam giác chứa 9ml môi trƣờng NB1 hấp khử trùng Tăng sinh lắc 150 vòng/phút 48h  Ly tâm loại bỏ dịch trong: - Mục đích: phá vỡ tế bào chủng khuẩn có mặt dịch tăng sinh Chỉ thu nhận hợp chất có khả kháng nấm sinh giai đoạn tăng sinh - Hút 2ml dịch tăng sinh sau 48 cho vào eppendoft, li tâm 10000 vòng/phút 15 phút Thu dịch loại bỏ sinh khối (Lưu ý: eppendoft đầu tip cần hấp vô trùng 121 0C, 1atm 15 phút) 30 Đồ án tốt nghiệp  Chọn lọc mẫu: - Mục đích: Chọn lọc đƣợc mẫu sau q trình tăng sinh có chứa hợp chất có khả kháng nấm mốc Dựa vào hình ảnh nấm mốc sau ni cấy, chọn lọc đƣợc mẫu tăng sinh có khả chứa hợp chất kháng nấm - Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng PDA đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Sau phối vào đĩa petri đƣợc hấp khử trùng, đĩa khoảng 15 ml - Khi đĩa môi trƣờng PDA đông, cấy nấm mốc vào tâm đĩa môi trƣờng Đồng thời đục lỗ thạch góc cách điểm cấy nấm Sau ủ đĩa 300C 24h - Tiến hành bơm 1ml dịch sau li tâm vào lỗ đĩa thạch cấy nấm đƣợc 24h Đối chứng đĩa nấm không thêm vào dịch li tâm lỗ thạch Sau đĩa đƣợc tiếp tục ủ 300C 24 – 72 Đọc kết đối kháng dựa vào phát triển nấm mốc đĩa thí nghiệm đĩa đối chứng cấy nấm - Lưu ý:  Mỗi dịch mẫu tăng sinh tiến hành lập lại lần Kết so với đối  Cần bơm dịch vừa ngập lỗ thạch, tránh để dịch bị tràn khỏi giếng chứng  Pha loãng mẫu tăng sinh: thực tƣơng tự phƣơng pháp pha lỗng mẫu trình bày mục 2.3.2.1  Phân lập: - Mục đích: Phân tách riêng chủng vi khuẩn có dịch mẫu tăng sinh, giúp cho việc chọn lọc chủng vi khuẩn đồng - Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng NA đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Đƣợc phối vào đĩa petri đƣợc hấp khử trùng, đĩa khoảng 15ml - Cấy mẫu phân tách khuẩn lạc riêng rẽ: tiến hành cấy trang mẫu độ pha loãng 10-5,10-6,10-7 Mỗi nồng độ tiến hành cấy trang đĩa, sau đƣợc ủ 370C 24 – 48 31 Đồ án tốt nghiệp - Quan sát hình thái khuẩn lạc sau thời gian ủ, ghi nhận kết Cấy ria làm chủng khuẩn cho hình thái khuẩn lạc khác đĩa môi trƣờng NA - Khi chủng khuẩn tiến hành giữ giống ống thạch nghiêng môi trƣờng NA giữ giống lạnh sâu eppendorf, phục vụ cho thí nghiệm (thực tƣơng tự phƣơng pháp bảo quản giống vi sinh vật trình bày mục 2.3.2.1)  Khảo sát khả đối kháng với nấm dịch ly tâm canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn mơi trƣờng PDA - Mục đích: khảo sát khả ức chế nấm mốc chủng vi khuẩn phân lập chất cảm ứng bổ sung vào mơi trƣờng NB1 Từ chọn chủng khuẩn có khả tiết hoạt chất kháng nấm - Tiến hành:  Các chủng vi khuẩn phân lập cấy vào bình tam giác chứa 10ml mơi trƣờng NB1 hấp khử trùng Cho lắc máy lắc 150 vòng/phút 24  Đối chứng khảo sát môi trƣờng NB1 không cấy khuẩn  Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng PDA đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Sau phối vào đĩa petri đƣợc hấp khử trùng, đĩa khoảng 15 ml  Cấy nấm mốc vào tâm đĩa môi trƣờng PDA đƣợc chuẩn bị trƣớc Đồng thời đục lỗ thạch góc cách điểm cấy nấm Sau ủ đĩa 300C 24  Dịch tăng sinh vi khuẩn sau 24 đƣợc đem li tâm 10000 vòng/phút 15 phút Thu dịch loại bỏ sinh khối Tiến hành bơm 0.1ml dịch sau li tâm vào lỗ đĩa thạch ủ nấm đƣợc 24 Đối chứng khảo sát đĩa nấm đƣợc bơm 0.1ml môi trƣờng NB1 không cấy khuẩn vào giếng thạch Đối chứng đĩa nấm không thêm vào dịch li tâm giếng thạch Sau đĩa đƣợc tiếp tục ủ 300C 24 – 72 Đọc kết đối kháng dựa vào phát triển nấm mốc đĩa thí nghiệm đĩa đối chứng cấy nấm 32 Đồ án tốt nghiệp  Khảo sát khả ức chế khả tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc dịch ly tâm canh trƣờng chủng khuẩn phân lập mơi trƣờng CCA - Mục đích: khảo sát khả ức chế tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc chủng vi khuẩn phân lập môi trƣờng CCA Từ chọn chủng khuẩn có khả ức chế tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc - Tiến hành:  Các chủng vi khuẩn phân lập cấy vào bình tam giác chứa 10ml mơi trƣờng NB1 hấp khử trùng Lắc tăng sinh 150 vòng/phút 24  Mơi trƣờng sử dụng môi trƣờng CCA đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Sau phối vào đĩa petri đƣợc hấp khử trùng, đĩa khoảng 15ml Khi môi trƣờng đông, cấy nấm mốc vào tâm đĩa môi trƣờng CCA Đồng thời đục lỗ thạch góc cách điểm cấy nấm Sau ủ đĩa 300C 24  Dịch tăng sinh sau 24 đƣợc đem li tâm 10000 vòng/phút 15 phút Thu dịch loại bỏ sinh khối Tiến hành bơm 0.1ml dịch sau li tâm vào lỗ đĩa thạch cấy nấm đƣợc 24 Đối chứng đĩa nấm không thêm vào dịch li tâm giếng thạch Sau đĩa đƣợc tiếp tục ủ 300C 24 – 72 Đọc kết đối kháng dựa vào phát triển nấm mốc đĩa thí nghiệm đĩa đối chứng cấy nấm 33 Đồ án tốt nghiệp 2.3.3 Một số phương pháp khảo sát sinh hóa vi khuẩn 2.3.3.1 - Nhuộm Gram Mục đích: xác định nhóm vi khuẩn vi khuẩn Gram âm (Gram- genative) hay vi khuẩn Gram dƣơng (Gram-positive) Đồng thời việc nhuộm gran cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào vi khuẩn - Nguyên tắc: vi khuẩn Gram dƣơng bắt màu tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng  Đối với vi khuẩn Gram dƣơng, có thành tế bào đƣợc cấu tạo lớp peptidoglycan dày nên khả giữ màu cao đƣợc nhuộm phức hợp tím tinh thể - iod (crystal violet - lugol), việc xử lí tiếp với cồn 960 làm cho lớp peptidoglycan nƣớc, từ làm giảm khoảng trống phân tử thành tế bào bắt màu fushin  Đối với vi khuẩn Gram âm, thành tế bào cấu tạo lớp peptidoglycan mỏng thƣờng có lớp đơi lipid bên ngồi Khi đƣợc xử lí với cồn 960, lớp đơi lipid bên ngồi bị hòa tan Lớp peptidoglycan mỏng khơng thể giữ đƣợc màu phức chất tím tinh thể - iod Cuối tế bào bắt màu hồng đƣợc nhuộm với fushin bƣớc sau - Tiến hành:  Dùng que cấy vòng thu sinh khối (ở dạng rắn lỏng) đặt vào vết bôi lame Hơ nhẹ đèn cồn để cố định tế bào  Nhỏ 1-2 giọt tím tinh thể (crystal violet) để yên 30 giây  Rửa nƣớc giây  Nhỏ 1-2 giọt lugol để yên 60 giây  Rửa nƣớc giây  Rửa côn 960 20 giây  Rửa nƣớc giây  Nhỏ 1-2 giọt fushin để yên 30 giây  Rửa nƣớc giây  Soi kính độ phóng đại X1000 34 Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.2 - Nhuộm bào tử Mục đích: xác định khả sinh bào tử vi khuẩn Bào tử yếu tố giúp vi khuẩn chống chịu tốt với tác nhân bất lợi từ bên ngoài: tia cực tím, tia gama, nhiệt độ mơi trƣờng q cao, chất khử trùng, môi trƣờng thiếu dinh dƣỡng… - Nguyên tắc: điều kiện đun nóng thuốc nhuộm malachite green xâm nhập vào nội bào tử làm chúng bắt màu lục Khi rữa vết bôi nƣớc cất, tế bào dinh dƣỡng màu bào tử giữ màu lục Khi nhuộm bổ sung với fushin, tế bào bắt màu hồng để dễ dàng phân biệt soi kính - Tiến hành:  Dùng que cấy vòng thu sinh khối (ở dạng rắn lỏng) đặt vào vết bôi lame  Hơ nhẹ đèn cồn để cố định tế bào  Nhỏ 2-3 giọt malachite green, đặt lên bacher nƣớc cất đun soi, để yên 10 phút 2.3.3.3 -  Rửa nƣớc 30 giây  Nhỏ 2-3 giọt fushin để yên 30 giây  Rửa nƣớc giây  Soi kính độ phóng đại X1000 Thử nghiệm Simmon citrate Mục đích: xem xét khả vi khuẩn sử dụng citrate nguồn carbon hay không - Nguyên tắc: vi khuẩn biến dƣỡng citrate nguồn carbon, tạo thành CO2 làm kiềm hóa mơi trƣờng Mặt khác, vi khuẩn thƣờng dung ammonium làm nguồn đạm Sự phân giải muối ammonium sinh ammoniac (NH3) làm kiềm hóa môi trƣờng Việc bổ sung chất thị pH với vai trò làm chất chuyển màu mơi trƣờng có thay đổi pH môi trƣờng 35 Đồ án tốt nghiệp Trong thí nghiệm này, mơi trƣờng đƣợc bổ Bromothymol Blue chất - thị pH Khi môi trƣờng kiềm hóa (pH > 7.2) thị chuyển màu xanh dƣơng, mơi trƣờng acid hóa (pH < 6.0) thị giữ nguyên màu xanh - Tiến hành:  Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng Simmon Citrate bổ sung thị Bromothymol Blue, phối vào ống nghiệm đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Môi trƣờng để nguội tạo bề mặt nghiêng  Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn, cấy ria bề mặt môi trƣờng thạch nghiêng Ủ 370C theo dõi 24 – 48 Quan sát chuyển màu mơi trƣờng  Thử nghiệm dƣơng tính: mơi trƣờng chuyển màu xanh dƣơng  Thử nghiệm âm tính: mơi trƣờng giữ nguyên màu môi trƣờng ban đầu 2.3.3.4 - Thử nghiệm Catalase Mục đích: xác định khả tổng hợp enzyme catalase vi sinh vât Enzyme catalase đƣợc tổng hợp vi sinh vật hiếu khí kị khí tùy nghi Với tác phân hủy H2O2 (hydro peroxide) chất làm ngộ độc tế bào - Nguyên tắc: H2O2 30% với có mặt enzyme catalase xuất phản ứng phân hủy tạo thành H2O O2 bay lên (hiện tƣơng sủi bọt khí) Catalase H2O2 - H2O + O2 Tiến hành:  Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn (ở dạng rắn lỏng) đặt lên  Nhỏ vài giọt H2O2 30% lên trên, quan sát sau 1-2 giây  Phản ứng dƣơng tính xuất bọt khí, phản ứng âm tính khơng có lame bọt khí 36 Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.5 - Thử nghiệm protease Mục đích: xác định khả vi sinh vật tổng hợp đƣợc enzyme protease phân hủy chất casein - Nguyên tắc: casein đƣợc xem nguồn carbon lƣợng cho vi khuẩn Nhƣng casein khơng thể thẩm thấu qua màng tế bào (casein loại protein sữa) nên vi khuẩn phải tiết enzyme protease, phân hủy casein thành amino acid để dễ dàng vận chuyển vào bên tế bào Casein đƣợc phối trộn với mơi trƣờng dinh dƣỡng, tạo cho mơi trƣờng có màu trắng đục Khi thời gian ủ, vi khuẩn tiết enzyme protease tạo vòng phân giải (vùng suốt bao chung quanh vi khuẩn) Nếu không môi trƣờng chung quanh vi khuẩn bị đục - Tiến hành:  Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng huyền phù casein 1% bổ sung 1.5% agar, đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Sau phối vào đĩa petri đƣợc hấp khử trùng, đĩa khoảng 15ml Khi thạch đông, tiến hành đục lỗ tạo giếng thạch  Vi khuẩn đƣợc cấy vào bình tam giác chứa 10ml mơi trƣờng NB hấp khử trùng Cho lắc máy lắc 150 vòng/phút 24h  Bơm dịch tăng sinh vào giếng thạch (giếng lại làm đối chứng) Ủ 370C theo dõi 48h Vi khuẫn đƣợc cho có hoạt tính protease môi trƣờng xung quanh giếng thạch tạo thành vùng suốt Có thể tráng qua bề mặt dung dịch TCA 5% để phát kết rõ rang 2.3.3.6 - Thử nghiệm chitinase Mục đích: xác định khả vi sinh vật tổng hợp đƣợc enzyme chitinase phân hủy chất chitin - Nguyên tắc: chitin đƣợc phối trộn vào môi trƣờng dinh dƣỡng Khi vi sinh vật sử dụng enzyme chitinase để phân giải chitin thành dạng có cấu trúc mạnh ngắn n-acetyl-D-glucosamie, hợp chất khơng có phản ứng màu với lugol Do cho thuốc thử lugol, độ lớn vòng suốt không bắt màu lugol 37 Đồ án tốt nghiệp - Tiến hành:  Môi trƣờng sử dụng môi trƣờng huyền phù chitin 1% bổ sung 1.5% agar, đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm 15 phút Sau phối vào đĩa petri đƣợc hấp khử trùng, đĩa khoảng 15ml Khi thạch đông, tiến hành đục lỗ tạo giếng thạch  Vi khuẩn đƣợc cấy vào bình tam giác chứa 10ml mơi trƣờng NB hấp khử trùng Cho lắc máy lắc 150 vòng/phút 24h  Bơm dịch tăng sinh vào giếng thạch (giếng lại làm đối chứng) Ủ 370C theo dõi 48h  Vi khuẩn đƣợc cho có hoạt tính chitinase môi trƣờng xung quanh giếng thạch tạo thành vùng sáng không bắt màu thuốc thử lugol 2.3.3.7 - Thử nghiệm khả lên men nguồn carbohydrate Mục đích: khảo sát khả sử dụng (lên men) nguồn carbohydrate đặc hiệu môi trƣờng nuôi cấy để tạo acid sinh - Nguyên tắc: lên men q trình oxy hóa khử mà chất nhận điện tử cuối oxy mà chất hữu khác Sản phẩm cuối trình lên mên carbohydrate thƣờng acid hữu cơ, alcohol, CO2 … (tùy thuộc vào dòng vi sinh vật, chất lên men, thời gian, nhiệt độ pH môi trƣờng) Trong trƣờng hợp, sản phẩm tạo làm giảm pH mơi trƣờng Các thí nghiệm chuyển hóa carbohydrate đƣợc tiến hành môi trƣờng rắn hay lỏng Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung thêm chất thị, thƣờng chất thị pH để phát sản phẩm làm thay đổi pH sinh trình chuyển hóa Các chất khí sinh đƣợc bẫy lại tạo bọt khí ống Durham (trong trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng lỏng) làm vỡ thạch cấy môi trƣờng thạch sâu (trong trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng rắn) - Trong nghiên cứu sử dụng môi trƣờng Phenol red carbohydrate broth, với chất thị Phenol red Môi trƣờng chuyển màu vàng pH < 6.4, chuyển màu đỏ đến tím pH > 8.2 giữ màu cam mơi trƣờng trung tính 38 Đồ án tốt nghiệp - Tiến hành:  Môi trƣờng Phenol red carbohydrate broth đƣợc pha riêng làm phần dung dịch, tạm gọi dung dịch môi trƣờng sở dung dịch bổ sung carbohydrate Phần dung dịch môi trƣờng sở, cân chất (ngoại trừ nguồn carbohydrate) nhƣ thành phần môi trƣờng, khuấy trộn 800ml nƣớc cất Phần dung dịch bổ sung carbonhydate, hòa tan 10g carbohydrate 200ml nƣớc cất vô trùng  Phối vào ống nghiệm 4.5ml dịch mơi trƣờng sở có bổ sung ống Durham để phát khí tạo thành Hấp khử trùng 121 0C 15 phút Làm nguội môi trƣờng khoảng 42 – 50 0C trƣớc bổ sung dịch carbohydrate Dịch carbohydrate đƣợc khử trùng cách lọc vô trùng qua màng có kích thƣớc lỗ 0.45 µm Bổ sung vào ống nghiệm 0.5ml dịch lọc, lắc nhẹ để trộn Mơi trƣờng có màu đỏ nhạt  Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn (ở dạng rắn lỏng) cấy vào ống nghiệm môi trƣờng Ủ 37 0C theo dõi 24 – 48 Thử nghiệm có kết dƣơng tính (vi khuẩn có khả lên men nguồn carbohydrate), mơi trƣờng chuyển sang màu vàng Kết âm tính, mơi trƣờng chuyển sang màu đỏ tím 39 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ Các nguồn mẫu: hạt cà phê, đậu phộng nhiễm nấm đƣợc tăng sinh môi - trƣờng NB sau 24 Sau tiến hành phân lập mẫu tăng sinh, thu đƣợc chủng vi khuẩn (3 chủng mẫu đậu phộng chủng mẫu cà phê) Hình thái khuẩn lạc chủng phân lập đƣợc thể qua bảng 3.1 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái nguồn gốc chủng vi khuẩn phân lập Tên chủng Nguồn phân lập CP1 Hạt cà phê CP2 Hạt cà phê V1 Đậu phộng V2 Đậu phộng VK2 Đậu phộng - Hình thái khuẩn lạc Tròn, lồi, tâm có màu trắng đục, kích thƣớc khuẩn lạc nhỏ Tròn, lồi, có màu trắng đục, kích thƣớc khuẩn lạc nhỏ Tròn, lồi, nhăn, có màu vàng sậm, kích thƣớc khuẩn lạc lớn Tròn, lồi, nhăn, có màu vàng nhạt, kích thƣớc khuẩn lạc nhỏ Tròn, lồi, bóng, tâm có màu trắng đục, kích thƣớc khuẩn lạc lớn Từ chủng vi khuẩn vừa phân lập đƣợc, chúng tơi tiếp tục tiến hành có khảo sát hoạt tính kháng nấm 3.1.1 Khảo sát khả đối kháng chủng khuẩn phân lập với nấm phương pháp đồng nuôi cấy môi trường hỗn hợp - chủng vi khuẩn phân lập đƣợc tiền hành đối kháng với nâm mốc phƣơng pháp đồng nuôi cấy môi trƣờng hỗn hợp - Sau ngày nuôi cấy, kết đối kháng với nấm mốc chủng khuẩn đƣợc thể qua hình 3.1  Tại đĩa cấy vi khuẩn V2 (hình 3.1.C): Khuẩn lạc nấm mọc lan hết đĩa môi trƣờng  Tại đĩa cấy vi khuẩn VK2 (hình 3.1.B): Khuẩn lạc nấm phát triển so với khuẩn lạc nấm đĩa đối chứng 40 Đồ án tốt nghiệp  Tại đĩa cấy vi khuẩn CP1, CP2 V1 (hình 3.1.D, 3.1.E 3.1.F): khuẩn lạc nấm hầu nhƣ không phát triển hay phát triển Hình 3.1 Kết đối kháng chủng vi khuẩn phân lập đƣợc môi trƣờng hỗn hợp A.Đối chứng cấy nấm B Thí nghiệm cấy vi khuẩn VK2 C Thí nghiệm cấy vi khuẩn V2 D Thí nghiệm cấy vi khuẩn V1 E Thí nghiệm cấy vi khuẩn CP1 F Thí nghiệm cấy vi khuẩn CP2 41 Đồ án tốt nghiệp - Từ kết thí nghiệm, dựa vào ức chế phát triển nấm mốc đĩa thí nghiệm, nhận thấy chủng vi khuẩn có khảng kháng đƣợc nấm Đó chủng CP1, CP2 phân lập từ hạt cà phê VK2, V2 phân lập từ đậu phộng - Tiếp tục tiên hành khảo sát khả đối kháng vi với nấm mốc dịch ly tâm canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 3.1.2 Khảo sát khả đối kháng với nấm dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn môi trường hỗn hợp - chủng vi khuẩn là: CP1, CP2, VK2 V2 đƣợc tăng sinh môi trƣờng NB sau 24 để thu canh trƣờng Sau ly tâm thu dịch loại bỏ sinh khối để tiến hành đối kháng với nấm mốc - Sau thời gian ni cấy đối kháng, lí khách quan (do nấm mốc xảy tƣợng bay bào tử) nên làm ảnh hƣởng đến kết thí nghiệm Nhƣng chất dịch ly tâm canh trƣờng nuôi cấy loại vi khuẩn khơng có khả ức chế nấm mơc, nên đĩa thí nghiệm khuẩn lạc nấm phát triển lấn át phát toàn bền mặt đĩa thạch - Tuy kết khảo sát đối kháng theo phƣơng pháp đồng nuôi cấy cho kết khả quan (4 chủng có khả lất át nấm mốc), nhƣng nồng độ chất kháng nấm canh trƣờng thấp để thấy khả kháng nấm dịch nuôi cấy loại bỏ tế bào - Chúng định khơng tiếp tục thí nghiệm với chủng vừa phân lập Thay vào đó, chúng tơi phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn tù nguồn mẫu khác theo cách tiếp cận thứ hai 42 Đồ án tốt nghiệp 3.2 Phân lập chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai - Do việc phân lập tuyển chọn theo cách tiếp cận thứ không cho kết tốt, định tiếp tục phân lập chủng vi khuẩn nguôn mẫu khác theo cách tiếp cận thứ hai - Theo cách tiếp cận này, việc phân lập đƣợc thu hẹp mẫu phân lập đƣợc sàng lọc (chỉ giữ lại vi khuẩn hiếu khí sinh bào tử qua việc xử lý nhiệt nguồn mẫu 800C, 15 phút trƣớc tăng sinh dựa khả khả kháng nấm dịch ly tâm canh trƣờng tăng sinh nguồn mẫu) Đồng thời quan trọng bổ sung tơ nấm nuôi cấy riêng làm chất cảm ứng, với hy vọng làm tăng khả phân lập chủng khuẩn có khả kháng nấm - Các nguồn mẫu: trái cà phê, vỏ đậu phộng đất trồng rau đƣợc tăng sinh môi trƣờng NB1 (chứa tơ nấm) sau 24 Ly tâm dịch nuôi cấy, thu dịch tiến hành thử khả đối kháng - Kết đối kháng môi trƣờng PDA mẫu tăng sinh sau 72 khảo sát đƣợc thể hình 3.2:  Với mẫu tăng sinh trái cà phê, hình thái nấm mốc phát triển khơng nhƣ đĩa đối chứng Khuẩn lạc nấm bị khuyết vi trí tiếp xúc với giếng bơm dịch ly tâm mẫu tăng sinh Nhƣ dịch tăng sinh mẫu trái cà phê có khả có chứa hoạt tính kháng nấm Chúng tối tiến hành pha loãng dịch tăng sinh mẫu, cấy trang để phân rẽ chủng vi khuẩn  Với hai mẫu tăng sinh vỏ đậu phộng đất trồng rau, hình thái nấm mốc phát triển bình thƣờng tƣơng đối giống với đĩa nấm đối chứng Tại điểm tiếp xúc với giếng bơm dịch ly tâm mẫu tăng sinh, khuẩn lạc nấm phát triển bình thƣờng Nhƣ dịch tăng sinh vi khuẩn từ hai mẫu vỏ đậu phộng đất trồng rau khơng có khả kháng nấm 43 Đồ án tốt nghiệp A1 B1 C1 B2 C2 A2 Hình 3.2 Kết đối kháng nấm dịch tăng sinh môi trƣờng PDA - A1 Mẫu trái cà phê A2 Đối chứng cấy nấm B1 Mẫu đất trồng rau B2 Đối chứng cấy nấm C1 Mẫu vỏ đậu phộng C2 Đối chứng cấy nấm Từ dịch tăng sinh mẫu trái cà phê, cấy trang phân lập nồng độ pha loãng 10-5,10-6,10-7 mẫu tăng sinh để phân rẻ chủng vi khuẩn có chứa dịch tăng sinh - Sau ủ 24 giờ, quan sát đĩa cấy ghi nhận chủng khuẩn có hình thái khuẩn lạc khác Tiến hành cấy ria làm chủng môi trƣờng NA Kết quả, thu nhận đƣợc chủng vi khuẩn có chứa dịch Tiến hành nhuộm gram quan sát tế bào, quan sát hình thái khuẩn lạc kính hiển vi giữ giống để tiến hành thí nghiệm 44 Đồ án tốt nghiệp  Chủng CS1a (Hình 3.3.): cầu khuẩn, gram dƣơng Khuẩn lạc tròn bờ đều, tâm trắng đục, đƣờng kính > 0.5mm Hình 3.3 Chủng vi khuẩn CS1a phân lập từ trái cà phê 45 Đồ án tốt nghiệp  Chủng CS1b (Hình 3.4.): trực khuẩn, gram dƣơng Khuẩn lạc tròn, lồi ít, bờ khơng đều, suốt, đƣờng kính < 0.5mm, khuẩn lạc chuyển sang màu nâu sau 48h ni cấy thạch NA Hình 3.4 Chủng vi khuẩn CS1b phân lập từ trái cà phê 46 Đồ án tốt nghiệp 3.2.1 Khảo sát khả đối kháng chủng khuẩn phân lập với nấm mốc môi trường PDA - Từ kết từ thí nghiệm trên, chúng tơi tiếp tục khảo sát khả kháng nấm hai chủng vi khuẩn CS1a CS1b vừa phân lập đƣợc - Việc khảo sát nhằm chọn đƣợc khả kháng nấm từ hai chủng khuẩn Việc sử dụng dịch ly tâm canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn nhằm xem xét sản phẩm trao đổi chất ngoại bào có phải tác nhân kháng nấm mốc - Song song việc khảo sát hoạt tính kháng nấm hai vi khuẩn CS1a CS1b, thí nghiệm xem xét việc bổ sung chất cảm ứng tơ nấm mốc vào mơi trƣờng có tác động đến phát triển nấm mốc - Sau thời gian 24 - 72 khảo sát, kết đối kháng chủng vi khuẩn CS1a, CS1b tác động chất cảm ứng lên nấm mốc đƣợc thể qua hình 3.5:  So với đối chứng cấy nấm, hình thái nấm mốc đĩa cấy dịch ly tâm canh trƣờng tăng sinh chủng khuẩn CS1a, phát triển khơng có khác biệt Tại điểm bơm dịch ly tâm canh trƣờng, khuẩn lạc nấm phát triển bình thƣờng Nhƣ canh trƣờng tăng sinh khuẩn CS1a khơng có hoạt tính kháng nấm  So với đối chứng cấy nấm, hình thái nấm mốc đĩa cấy dịch ly tâm canh trƣờng tăng sinh chủng khuẩn CS1b, phát triển khơng bình thƣờng Khuẩn lạc nấm bị khuyết vi trí tiếp xúc với giếng bơm dịch ly tâm canh trƣờng Nhƣ canh trƣờng tăng sinh khuẩn CS1b có hoạt tính kháng nấm  So với đối chứng cấy nấm, hình thái nấm mốc đĩa cấy mơi trƣờng NB1, phát triển khơng có khác biệt Tại điểm bơm dịch môi trƣờng, khuẩn lạc nấm phát triển bình thƣờng Nhƣ chất cảm ứng bổ sung vào môi trƣờng không tác động lên phát triển nấm mốc 47 Đồ án tốt nghiệp A1 B1 C1 A2 B2 C2 Hình 3.5 Kết đối kháng nấm dịch ly tâm canh trƣờng với nấm mốc môi trƣờng PDA A1 Dịch ly tâm canh trƣờng khuẩn CS1a A2 Đối chứng cấy nấm B1 Dịch ly tâm canh trƣờng khuẩn CS1b B2 Đối chứng cấy nấm C1 Môi trƣờng NB1 C2 Đối chứng cấy nấm - Kết cho thấy rằng, hai khuẩn phân lập đƣợc có chủng khuẩn CS1b có hoạt tính kháng nấm mốc Và hoạt tính sản phẩm trao đổi chất có mặt canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn - Với kết việc bổ sung chất cảm ứng tơ nấm mốc vào môi trƣờng khảo sát làm đối chứng không phát tác động lên phát triển nấm mốc, chúng tơi khẳng định hoạt tính kháng nấm vi khuẩn phân lập đƣợc tổng hợp 48 Đồ án tốt nghiệp 3.2.2 Khảo sát khả ức chế khả sinh aflatoxin chủng khuẩn phân lập với nấm mơi trường CCA - Từ kết từ thí nghiệm trên, tiếp tục khảo sát khả ức chế tổng hợp aflatoxin từ nấm, chủng vi khuẩn CS1b vừa khảo sát thí nghiệm - Việc khảo sát nhằm xác định canh trƣờng ni cấy vi khuẩn có chứa hợp chất ức chế tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc Từ đƣa kết luận khả tổng hợp đƣợc sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính ức chế tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc - Sau thời gian 24 - 72 khảo sát, kết thí nghiệm ảnh hƣởng vi khuẩn CS1b lên khả tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc đƣợc thể qua hình 3.5:  So với đối chứng cấy nấm, hình thái nấm mốc đĩa cấy dịch ly tâm canh trƣờng tăng sinh chủng khuẩn CS1b, phát triển khơng bình thƣờng Khuẩn lạc nấm bị khuyết vi trí tiếp xúc với giếng bơm dịch ly tâm canh trƣờng Thí nghiệm tiếp tục chứng minh chủng CS1b có khả kháng nấm mốc mơi trƣờng CCA.(hình 3.6) Hình 3.6 Kết ức chế phát triển khả tổng hợp aflatoxin nấm mốc dịch ly tâm canh trƣờng vi khuẩn môi trƣờng CCA 1.Đối chứng nấm Ly tâm canh trƣờng khuẩn CS1b 49 Đồ án tốt nghiệp 3.3 - Khảo sát sinh hóa chủng khuẩn phân lập đƣợc Từ kết thí nghiệm sàng lọc trên, tiến hành khảo sát số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn CS1b - Kết đƣợc ghi nhận vào bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn CS1b Thử nghiệm Bào tử Simmon citrate Catalase Protease Chitinase Lên men nguồn Carbonhydate Glucose Sucrose Manitol Lactose CS1b + + + + + - 3.3.1 Nhuộm bào tử - Do mẫu tăng sinh đƣợc xử lý nhiệt nên vi khuẩn phân lập đƣợc buộc phải có khả sinh bào tử Việc nhuộm bào tử nhằm xác định khả sinh bào tử vi khuẩn CS1b - Sau – ngày nuôi cấy môi trƣờng NA, tiến hành nhuộm bào tử vi khuẩn CS1b Kết phát bào tử vi khuẩn CS1b sinh vào ngày ni cấy thứ (Hình 3.7) 50 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.7 Kết nhuộm bào tử khuẩn CS1b 3.3.2 Thử nghiệm Simmon citrate - Tiến hành cấy vi khuẩn CS1b vào ống nghiệm môi trƣờng Simmon citrate, ống nghiệm làm đối chứng Sau 24 – 48 theo dõi, chúng tối nhận thấy chủng CS1b cho kết dƣơng tính (ống nghiệm mơi trƣờng chuyển sang màu xanh dƣơng) Qua cho thấy chủng khuẩn CS1b sử dụng đƣợc citrate làm nguồn carbon Hình 3.8 Thử nghiệm Simmon citrate CS1b cho kết dƣơng tính A.Ống nghiệm đối chứng âm B.Ống nghiệm cấy chủng CS1b 51 Đồ án tốt nghiệp 3.3.3 Thử nghiệm catalase - Ở vi khuẩn có enzyme catalase, tiếp xúc với hydroperoxide (H2O2) có tƣợng sủi bọt khí Vi khuẩn chuyển hóa H2O2 thành H2O O2 - Kết thí nghiệm, sinh khối chủng CS1b cho kết dƣơng tính Xuất bọt khí nhỏ lên sinh khối CS1b vài giọt H2O2 30% (hình 3.9) Chứng tỏ CS1b có hệ enzyme catalase Hình 3.9 Thử nghiệm catalase CS1b cho kết dƣơng tính 3.3.4 Thử nghiệm protease - Kết thử nghiệm, chủng CS1b phân giải đƣợc chất casein làm xung quanh giếng thạch bị suốt Thử nghiệm đƣợc khẳng định kết tráng lớp TCA 5% vào đĩa thí nghiệm (hình 3.10) Hình 3.10 Thử nghiệm protease Chủng CS1b cho kết dƣơng tính 52 Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm cho thấy chủng CS1b phân lập tổng hợp đƣợc hệ enzyme - protease, đƣợc xem tác nhân ức chế phát triển nấm mốc 3.3.5 Thử nghiệm chitinase - Kết thử nghiệm, chủng CS1b không phân giải đƣợc chất chitin khơng tạo vòng sáng Mơi trƣờng bắt màu lugol (hình 3.11) Hình 3.11 Kết thí nghiệm chintinase Chủng CS1b cho kết âm tính - Nhƣ chủng CS1b khơng tổng hợp đƣợc enzyme chitinase Vậy hoạt tính kháng nấm chủng CS1b chitinase 3.3.6 Thử nghiệm lên men carbohydrate - Sau 24 - 48 nuôi cấy, số nguồn đƣờng khảo sát, chủng CS1b cho kết dƣơng tính với đƣờng Glucose (môi trƣờng nuôi cấy chuyển màu vàng) cho kết âm tính với ba nguồn carbohydrate sucrose, lactose manitol (môi trƣơng nuôi cấy chuyển sang màu đỏ) Kết đƣợc thể qua hình 3.12; hình 3.13; hình 3.14; hình 3.15 - Kết thí nghiệm cho thấy vi khuẩn CS1b có khả lên men Glucose tạo aicd Các sản phẩm acid tác nhân kháng lại phát triến nấm mốc Từ chúng tơi xem xét việc tiến hành bổ sung Glucose vào môi trƣờng nuôi cấy CS1b nhằm thu đƣợc sản phẩm có hoạt tính kháng nấm 53 Đồ án tốt nghiệp ĐC CS1b Hình 3.12 Kết lên men Glucose Chủng CS1b cho kết dƣơng tính ĐC CS1b Hình 3.13 Kết lên men Lactose Chủng CS1b cho kết âm tính 54 Đồ án tốt nghiệp ĐC CS1b Hình 3.14 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính ĐC CS1b Hình 3.15 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính 55 Đồ án tốt nghiệp - Nhƣ kết thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn CS1b phân lập đƣợc phần phù hợp đặc điểm sinh hóa với vi khuẩn Bacillus, chúng tơi kết luận chủng Bacillus sp - Qua có thử nghiệm hóa sinh, chúng tơi nhận thấy khả ức chế tổng hợp aflatoxin nhƣ phát triển nấm mốc sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn CS1b Các sản phẩm khơng có hoạt tính chitinase nhƣng kháng nấm theo chế khác Nhƣ protease β- glucanase, hợp chất hữu khác - Sau thử nghiệm hai phƣơng pháp tiếp cận để phân lập vi khuẩn kháng nấm từ phụ phế phẩm, nhận thấy khơng khó khăn nhiều phân lập đƣợc vi sinh vật kháng nấm tự nhiên Tuy nhiên để nghiên cứu sản xuất hợp chất kháng nấm từ vi sinh vật chất cảm ứng đóng vai trò quan trọng Trong thời gian thực đề tài, sử dụng tơ nấm làm chất cảm ứng Tuy nhiên chƣa sử dụng đơn chất tạo nên sinh khối nấm để làm chất cảm ứng, từ rút kết luận tác nhân kháng nấm vi khuẩn 56 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 4.1 - Kết luận Thử nghiệm hai phƣơng pháp tiếp cân để phân lập vi khuẩn đối kháng nấm sinh aflatoxin cho thấy, muốn khảo sát khả kháng nấm canh trƣờng vi khuẩn loại bỏ tế bào, cần nuôi cấy vi khuẩn môi trƣờng chứa chất cảm ứng thuộc sinh khối nấm mốc - Bằng phƣơng pháp trên, chủng vi khuẩn Bacillus sp đƣợc phân lập trái cà phê nhiễm nấm, có khả tổng hợp chất kháng nấm sinh aflatoxin (Aspergillus sp.) 4.2 - Đề nghị Cần mở rộng nguồn phân lập khác nhƣ đất trồng, trái cây… để tìm kiếm thêm chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm - Định danh vi khuẩn CS1b đến cấp loài nhờ sử dụng API kit giải trình tự gen 16S rRNA - Cần tìm hiểu thêm chế tác động tác nhân vi khuẩn phân lập đƣợc ức chế phát triển hình thành độc tố aflatoxin - Cần có nghiên cứu trích ly hợp chất có canh trƣờng ni cấy vi khuẩn phân lập đƣợc, thu hợp chất tinh khiết có hoạt tính kháng nấm cao - Nghiên cứu xem xét đến hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin, cần mở rộng khảo sát chủng khuẩn Bacillus sp phân lập đƣợc lên nấm sinh độc tố khác nhƣ Fusarium, Aspergillus Penicilium… - Các thí nghiệm nghiên cứu dừng lại cấp độ in vitro Cần thực thí nghiệm in vivo để xác định khả kháng nấm tốt 57 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003) Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi NXB nông nghiệp [2] Dƣơng Thanh Liêm, Bùi Huy Nhƣ Phúc, Dƣơng Duy Đồng, (2002) Thức ăn dinh dưỡng động vật NXB nông nghiệp [3] Lê Anh Phụng( 2001) Bệnh nhiễm độc aflatoxin phương pháp phát aflatoxin Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh [4] Phạm Văn Tất (1996), Tác hại Aflatoxin Tạp chí thuốc sức khỏe số 79 (1- 11 - 1996) [5] Phạm Hoàng Thái (2007) Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân lập Luận án tốt nghiệp Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh [6] Asao T., Buchi G., Adbel-Kader M.M., Chang S.B., Wick E.L., Wogan G.N (1963) Aflatoxins B and G Journal of American Chemical Society, 85, 17061707 [7] Butler W.H, 1964 Acute toxicity of aflatoxin Bl in rats B J Cancer 18:756 [8] Davis N.D., Iyer S.K., Diener U.L 1987 Improved Method of Screening for Aflatoxin with a Coconut Agar Medium Applied and Environmental Microbiology 53:1593-1595 [9] Kondo T., Sakurada M., Okamoto S., Ono M., Tsukigi H., Suzuki A., Nagasawa H., Sakuda S (2001) Effects of aflastatin A, an inhibitor of aflatoxin production, on aflatoxin biosynthetic pathway anh glucose metabolism in Aspergillus parasiticus J Antibiot (Tokyo) 54: 650-657 [10]Kurtzman C.P., Horn B.Q., Heseltine C.W (1987) Aspergillus nomius, a new aflatoxin producing species related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamari Antonie van Leeuwenhoek 53: 147-158 58 Đồ án tốt nghiệp [11]Munimbazi C., Bullerman LB (1998) Inhibition of aflatoxin production of Aspergillus parasiticus NRRL 2999 by Bacillus pumilus Mycopathologia 140: 163-169 [12]Ono M., Sakuda S., Suzuki A., Isogai A (1997) Aflastatin A, a novel inhibitor of aflatoxin production by aflatoxingenic fungi J Antibiot (Tokyo) 50: 111-118 [13]Peterson S.W., Ito Y., Horn B.W., Goto T (2001) Aspergillus bombycis, a new aflatoxigenic species and genetic variation in its sibling species, A monius Mycologia 93: 689-703 [14]Wild CP., Gong YY 2010 Mycotoxins and human disease: a largely ignored global health issue Carcinogenesis 31:71-82 WHO (2008) World Health Statistics (2008) WHO Press, Geneva [15]Wu F., Khlangwiset P 2010 Health economic impacts and cost-effectiveness of aflatoxin reduction strategies in Africa: Case studies in biocontrol and postharvest interventions Food Additives & Contaminants 27:496-509 [16]Yan PS., Song Y., Sakuno E., Nakajima H., Nakagawa H., Yabe K (2004) Cyclo(L-leucyl-L-prolyl) produced by Achromobacter xylosoxidans inhibits aflatoxin production by Aspergillus parasiticus Appl Environ Microbiol 70:7466-7473 59 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG SỬ DỤNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM A.1 Thành phần mơi trƣờng Potato Dextrose Agar (PDA) Môi trƣờng PDA D - Glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml A.2 Thành phần môi trƣờng Potato Dextrose Broth (PDB) Môi trƣờng PDB D - Glucose 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Lưu ý: - Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, cho thêm vào 1000ml đun sôi 30 phút, thu dịch chiết định mức lên 1000ml Bảo quản tủ mát chƣa sử dụng - Khi ni cấy nấm mốc, bổ sung Chloramphenicol vào thành phần môi trƣờng với tỉ lệ 0.02% A.3 Thành phần môi trƣờng Nutrient Broth (NB) Môi trƣờng NB Peptone 5g Meat extract 3g NaCl 5g Nƣớc cất 1000 ml A.4 Thành phần môi trƣờng Nutrient Broth_1 (NB1) Môi trƣờng NB1 Peptone 2.5 g Meat extract 1.5 g NaCl 2.5 g Nƣớc cất 500 ml Dịch tơ nấm (10g/l) 500 ml A.5 Thành phần môi trƣờng Nutrient Agar (NA) Môi trƣờng NA Peptone 5g Meat extract 3g NaCl 5g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 ml A.6 Thành phần môi trƣờng Coconut Cream Agar (CCA) Môi trƣờng CCA Agar 20 g Dịch nƣớc cốt dừa 500 ml Nƣớc cất 500 ml Lưu ý: - Dịch nƣớc cốt dừa: 250g cơm dừa đƣợc trộn phút 500ml nƣớc cất đun sôi Lọc loại bỏ cặn - Khi pha môi trƣờng, cần đun sôi hỗn hợp trƣớc khử trùng bắng autoclave A.7 Thành phần môi trƣờng Simmon citrate Môi trƣờng Simmon citrate MgSO4 0.2 g NH4H2PO4 1g K2HPO4 1g Natri Citrate 2g NaCl 5g Bromothymol Blue 0.08 g Agar 15 g Nƣớc cất 1000 ml A.8 Thành phần môi trƣờng Phenol Red Carbohydrate Broth Môi trƣờng Phenol Red Carbohydrate Broth Tryticase peptone 10 g NaCl 5g Meat extract 1g Phenol red 0.018 g (7.2 ml dung dịch Phenol red 0.25%) Nƣớc cất 1000 ml Carbohydrate A.9 Thành phần môi trƣờng Casein 1% Môi trƣờng CCA Agar 15 g Casein 10 g Đệm Phosphate (pH=7) 1000 ml A.10 Thành phần môi trƣờng Chitin 1% Môi trƣờng CCA Agar 15 g Huyền phù chitin 2% 500 ml Đệm Phosphate (pH=7) 500 ml Lưu ý: - Huyền phù hóa chitin: lấy 10 g chitin hòa vào 100ml HCl đậm đặc Khuấy 10 phút Sau cho từ từ nƣớc cất làm lạnh đến 500ml, chitin huyền phù có màu trắng sữa Để qua đêm ngăn mát tủ lạnh Huyền phù đƣợc rửa cách ly tâm (4000 vòng/10 phút) nhiều lần với dung dich có pH = đến huyền phù đạt pH = Bảo quản huyền phù tủ mát ... có khả kháng nấm sinh aflatoxin Nôi dung đồ án - Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin - Sàng lọc tuyển chọn vi khuẩn dựa hoạt tính đối kháng hoạt tính ức chế sinh tổng... kháng nấm sinh aflatoxin. ” Trong khóa luận tốt nghiệp Mục đích - Phân lập tuyển chọn đƣợc vi khuẩn có khả kháng nấm Mục tiêu đề tài - Bƣớc đầu phân lập tuyển chọn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có. .. giảm aflatoxin thu đƣợc kết khả quan Đồ án tốt nghiệp - Vì lí thực tiễn nhƣ trên, định chọn đề tài: “ Bƣớc đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng