phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp. có khả năng sinh protease và amylase từ chao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN Bacillus spp. CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE VÀ AMYLASE TỪ CHAO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG SINH VIÊN THỰC HIỆN LÂM TRÍ ĐỨC MSSV: 3096816 LỚP: CNSH TT K35 Cần Thơ, Tháng 12/2013 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHẨN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký tên) PGS.Ts. Ngô Thị Phương Dung Lâm Trí Đức DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN Cần Thơ, ngày tháng năm CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký tên) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, xin gửi lời biết ơn chân thành đến cha mẹ người gia đình có công sinh thành nuôi dạy đến ngày hôm nay. Xin cảm ơn tất thầy cô thuộc Viện Ngiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học truyền đạt cho nhiều kiến thức bổ ích trình theo học trường. Xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến cô PGs. Ts. Ngô Thị Phương Dung tận tình hướng dẫn, gợi ý cho lời khuyên bổ ích việc nghiên cứu hoàn thành luận văn này. Cảm ơn thầy Huỳnh Xuân Phong – cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khoá 35 quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt cho trình học tập trường thời gian thực đề tài. Cảm ơn anh chị phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học thực phẩm, Viện Ngiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ hết lòng giúp đỡ suốt trình tiến hành thí nghiệm. Xin cảm ơn tất bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khoá 35 em sinh viên K36, K37 động viên giúp đỡ suốt thời gian qua. Xin kính chúc ba mẹ, quý thầy cô, anh chị dồi sức khoẻ! Chúc tất bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến K35 báo cáo luận văn thành công tốt đẹp. Người thực Lâm Trí Đức Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƯỢC Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. có khả sinh protease amylase từ chao nhằm sưu tầm chọn lọc chủng vi sinh vật có triển vọng hướng tới sản xuất chế phẩm sinh học. Kết có 20 dòng vi khuẩn phân lập từ 10 loại chao thu mua chợ địa bàn thành phố Cần Thơ. Cả 20 dòng vi khuẩn kiểm tra biểu đặc tính sinh hoá thuộc giống vi khuẩn Bacillus spp Tất 20 dòng có khả tổng hợp amylase (6,0 - 16,7 mm) protease (14,7 - 34,7 mm), dòng vi khuẩn B4 có khả tổng hợp amylase protease cao 16,7 mm 34,7 mm. Rỉ đường nguồn carbon thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp. Từ khoá: amylases, Bacillus subtilis, chao, proteases. ABSTRACT Isolation and selection of Bacillus spp. owning the ability to produce of protease and amylase from Chao samples were carried out to select promising microorganisms for the production of probiotics. The first objective of this research was isolation of Bacillus spp. from chao samples. Secondly, determining the ability of Bacillus spp. could synthesize amylases and proteases by agar spot test with starch and skim milk agar methods. The last was study on the carbon sources for increase biomass of Bacillus isolate. As the result, twenty strains were isolated from 10 collected samples from many markets in CanTho city and classically identified by biochemical testing. Twenty of total isolates had capable to synthesize amylases and proteases. Significantly, B4 isolate obtained the highest amount of amylases and proteases with 16.7 mm and 34.7 mm of diameter of zone, respectively. Molasses was a suitable carbon source to incubate Bacillus spp. Key words: amylases, Bacillus subtilis., chao, protease. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC MỤC LỤC . i DANH SÁCH BẢNG iii DANH SÁCH HÌNH . iv CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU . 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài . CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu vi khuẩn Bacillus spp. . 2.2. Giới thiệu enzyme amylase enzyme protease 2.2.1. Enzyme protease 2.2.2. Enzyme amylase 2.3. Giới thiệu sản phẩm lên men đậu nành vi khuẩn Bacillus subtilis. 2.4. Tình hình nghiên cứu Bacillus nước . 2.4.1. Trong nước . 2.4.2. Ngoài nước . CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP . 3.1. Phương tiện nghiên cứu . 3.1.1. Địa điểm thời gian thực . 3.1.2. Vật liệu . 3.1.3. Thiết bị dụng cụ . 3.1.4. Hóa chất môi trường 3.2. Phương pháp nghiên cứu 10 3.2.1. Thu thập mẫu 10 3.2.2. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ sản phẩm lên men đậu nành 10 3.2.3. Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus phân lập . 12 a. Xác định hoạt tính catalase . 12 b. Quan sát hình dạng khả chuyển động vi khuẩn 12 c. Nhuộm Gram . 13 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ d. Thử nghiệm Voges Proskauer (VP) 14 e. Nhuộm nội bào tử 14 i sinh enzyme protease amylase 15 3.2.4. Tuyển chọn Bacillus spp. có khả 3.2.5. Khảo sát nguồn carbon thích hợp để tăng sinh khối vi khuẩn 17 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1. Kết phân lập Bacillus spp. 19 4.2. Khả tổng hợp enzyme dòng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập . 27 4.3. Xác định nguồn carbon thích hợp để tăng sinh khối vi khuẩn 30 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1. Kết luận . 34 5.2. Đề nghị . 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 35 PHỤ LỤC 38 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Nghiệm thức nguồn carbon khác nhau……………………… . …17 Bảng 2. Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập từ loại chao khác . 20 Bảng 3. Đặc điểm khuẩn lạc 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập được. . 21 Bảng 4. Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập . 21 Bảng 5. Đặc điểm sinh hoá 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập . 26 Bảng 6. Đường kính vòng tròn thuỷ phân 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. môi trường nutrient agar có bổ sung hồ tinh bột. . 28 Bảng 7. Đường kính vòng tròn thuỷ phân 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. môi trường skim milk agar. 29 Bảng 8. Độ hấp thụ OD vi khuẩn Bacillus spp. 660 nm nguồn carbon 30 Bảng 9. Mật số vi khuẩn Bacillus spp. sau ngày nuôi rỉ đường . 33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis … Hình 2. Mẫu chao thu để phân lập Bacillus spp 10 Hình 3. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus spp. từ sản phẩm lên men đậu nành… .11 Hình 4. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus spp…………………………………….….19 Hình 5. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn Bacillus ssp. sau 24 nuôi cấy . 20 Hình 6. Khả chuyển động dòng Bacillus ssp. môi trường thạch bán lỏng……………………………………………………………… 22 Hình 7. Tế bào vi khuẩn Bacillus spp. ………………………… .………………….22 Hình 8. Vi khuẩn Bacillus spp. Gram dương với độ phóng đại 100 lần…………… 23 Hình 9. Khả tổng hợp Catalase vi khuẩn Bacillus spp……………….……24 Hình 10. Thử nghiệm VP vi khuẩn Bacillus spp………………………….…… 25 Hình 11. Nhuộm nội bào tử dòng B4………………………………… .……………25 Hình 12. Khả tổng hợp amylase dòng vi khuẩn Bacillus spp. môi trường Nutrient agar có bổ sung hồ tinh bột……………… ….27 Hình 13. Đường kính vòng tròn thuỷ phân trung bình 20 dòng Bacillus spp .…28 Hình 14. Khả tổng hợp protease dòng vi khuẩn Bacillus spp. môi trường Skim milk agar……………………………………………29 Hình 15. Đường kính vòng tròn thuỷ phân trung bình 20 dòng Bacillus spp.… 30 Hình 16. Mật số vi khuẩn Bacillus nguồn carbon………………….… ….31 Hình 17. Độ hấp thụ OD 660nm vi khuẩn nguồn carbon sau ngày…………………………………………………………… .… 32 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, đối tượng vi sinh vật tập trung nghiên cứu nhằm phân lập tuyển chọn để phục vụ cho sản xuất đời sống người ví dụ phân lập dòng vi khuẩn có khả phân giải lân, tổng hợp đạm, tổng hợp chất kích thích sinh trưởng. Sử dụng dòng vi khuẩn có khả tổng hợp enzyme cao để ứng dụng lên men thực phẩm. Đồng thời vi sinh vật sử dụng dược phẩm, xử lý môi trường đặc biệt công nghiệp. Ngoài ra, kinh tế ngày phát triển với tiến khoa học kỹ thuật làm cho sống người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống tinh thần vật chất cao, nhu cầu chất lượng sản phẩm tăng cao đòi hỏi nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm để đáp ứng nhu cầu phù hợp với người tiêu dùng. Với mục đích tăng suất chất lượng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm loại hoá chất độc hại đặc biệt nhằm hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh chăn nuôi, sử dụng vi sinh vật có lợi giải pháp tối ưu để thực mục đích này. Một dòng vi khuẩn nghiên cứu ứng dụng rộng rãi vi khuẩn Bacillus. Theo Perez et al. (2003), Bacillus vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, có khả sinh bào tử đặc biệt có khả tổng hợp enzyme có hoạt tính cao đặc biệt amylase protease. Nhiều chủng Bacillus có khả sản xuất protease nội bào ngoại bào. Priest (1977) chứng minh vi khuẩn Bacillus subtilis có khả tổng hợp sản xuất protease, esterase số loại enzyme ngoại bào. Ngoài có nghiên cứu khẳng định Bacillus có khả tổng hợp chất kháng khuẩn kháng nấm (Zuber et al., 1993; Shenin et al., 1995). Bên cạnh ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, dược phẩm, vi khuẩn Bacillus đóng vai trò lên men thực phẩm đặc biệt lên men đậu nành. Vi khuẩn Bacillus phân lập enzyme chúng ly trích tinh từ sản phẩm lên men truyền thống từ đậu nành Nhật Natto, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ tương tự tìm thấy sản phẩm lên men đậu nành từ nhiều quốc gia khác Thua nao Thái Lan, Douchi Trung Quốc, Kinema Nepal (Yasuriro et al., 2002; Cheng et al., 2006; Wonkeuk et al., 1996). Trong sản phẩm lên men đậu nành sản phẩm lên men biết nhiều Việt Nam chao. Chao sản phẩm truyền thống có tính chất cổ truyền rẻ tiền phổ biến. Đây sản phẩm lên men sản xuất từ sữa đậu nành đông đặc, qua trình lên men chao có hệ số dinh dưỡng hệ số tiêu hoá cao nhiều so với đậu nành. Chao có nguồn gốc từ Trung Quốc, có tên gọi sufu. Hiện có nhiều loại chao nguyên tắc chung lên men từ đậu nành. Đồng thời chao có nhiều vi khuẩn Bacillus có khả sinh enzyme có hoạt tính cao (Sharmin and Rahman, 2007) Do Bacillus có khả tổng hợp nhiều loại enzyme có hoạt tính cao phân lập từ nhiều sản phẩm lên men từ đậu nành. Đồng thời nước ta có nhiều điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật vào việc sản xuất chế phẩm sinh học. Vì vậy, đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. có khả tổng hợp enzyme protease amylase từ chao” thực cần thiết. Kết đề tài chọn dòng vi khuẩn tốt cho việc sản xuất amylase protease, tăng đa dạng giống vi sinh vật. 1.2. Mục tiêu đề tài Đề tài thực với mục tiêu phân lập dòng vi khuẩn Bacillus spp. từ chao qua tuyển chọn dòng Bacillus spp. có khả tổng hợp enzyme amylase protease cao. Để thực mục tiêu này, đề tài tiến hành với nội dung sau: - Phân lập dòng vi khuẩn Bacillus spp. từ chao. - Chọn lọc dòng vi khuẩn Bacillus spp. khả tổng hợp enzyme protease amylase. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 6. Đường kính vòng thuỷ phân tinh bột 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. Đường kính vòng thuỷ phân (mm) Số dòng Phần trăm (%) – 10 10 – 14 14 – 16 >16 12 60 30 Khả tổng hợp amylase hoạt tính amylase 20 dòng vi khuẩn có khác biệt mặt thống kê độ tin cậy 99% (Hình 13). Dòng B4 cho kết enzyme cao với đường kính vòng tròn thuỷ phân trung bình 16,7 mm khác biệt rõ rệt so với dòng vi khuẩn khác mặt thống kê độ tin cậy 99% dòng Bacillus có Đường kính vòng thuỷ phân (mm) hoạt tính thấp dòng B10 với đường kính vết loang mm. 18 16 a cdef 14 abcd cdefg cdef cdef efgh gh abc cdef bcde ab abcd defg efgh gh cdef fgh h 12 10 i B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 Bacillus spp. Hình 13. Đường kính vòng thuỷ phân trung bình 20 dòng Bacillus spp. *Ghi chú: Những có ký tự giống có khác biệt ý nghĩa thống kê mức 5%. CV= 45,39% 4.2.2. Xác định khả tổng hợp protease Khả tổng hợp protease vi khuẩn Bacillus spp. xác định qua đường kính vòng tròn thuỷ phân môi trường Skim milk agar protease vi khuẩn tổng hợp phân huỷ casein sữa tạo vết loang xung quanh giếng (Hình 14). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 14. Khả tổng hợp protease dòng vi khuẩn Bacillus spp. môi trường Skim milk agar Kết thí nghiệm xác định hoạt tính protease 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. xác định thông qua đường kính vòng tròn thuỷ phân môi trường Skim milk agar từ 14,7 mm đến 34,7 mm, đường kính vòng tròn thuỷ phân protease vi khuẩn Bacillus spp. sinh tập trung nhiều khoảng từ 25 mm đến 30 mm chiếm tỷ lệ 45% (Bảng 7). Bảng 7. Đường kính vòng tròn thuỷ phân 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. Trên môi trường skim milk agar Đường kính vòng tròn thuỷ phân (mm) Số dòng Phần trăm (%) 10 – 20 20,1 – 25 25 – 30 >30 20 45 30 Kết cho thấy tất 20 dòng Bacillus phân lập có khả tổng hợp protease khả tổng hợp protease dòng Bacillus có khác biệt mặt thống kê 99% (Hình 15). Trong dòng vi khuẩn có khả tổng hợp protease cao dòng B4, có đường kính vòng tròn thuỷ phân trung bình 34,7 mm khác biệt rõ rệt so với dòng khác mặt thống kê độ tin cậy 99%, dòng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính protease thấp dòng B7 với đường kính vòng tròn thuỷ phân trung bình 18,7 mm. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Đường kính vòng thuỷ phân (mm) 40.0 ab 35.0 a abc abcd 30.0 bcde abcd abcd bcde cde bcde de ef ef 25.0 fg g B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 20.0 bcde cde bcde cde fg 15.0 10.0 5.0 0.0 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 Bacillus spp. Hình 15. Đường kính vòng thuỷ phân trung bình 20 dòng Bacillus spp. *Ghi chú: Những có ký tự giống có khác biệt ý nghĩa thống kê mức 5%, CV= 49,50% .Do dòng B4 có khả tổng hợp protease cao (34,7 mm) khả tổng hợp amylase thí nghiệm trước cao (16,7mm). Vì vậy, dòng B4 chọn định danh kỹ thuật sinh học phân tử 4.3. Khảo sát nguồn carbon thích hợp để nuôi vi khuẩn Bacillus sp. Kết thí nghiệm cho thấy mật số vi khuẩn ban đầu (ngày 0) chủng vào có độ hấp thu OD 660 nm vi khuẩn Bacillus sp. vào khoảng 0,2 nên khác biệt nghiệm thức, qua ngày nuôi nghiệm thức có khác biệt mức 95% (Bảng 8) Bảng 8. Độ hấp thụ OD vi khuẩn Bacillus sp. 660nm nguồn carbon Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày NT1 0,242a 0,249b 0,337c 0,197ab 0,135ab 0,122d 0,112b NT2 0,243a 0,336c 0,380d 0,302c 0,255c 0,222c 0,197b NT3 0,227a 0,246d 0,500a 0,304a 0,306a 0,307e 0,284c NT4 0,286a 0,349a 0,408b 0,356c 0,317ab 0,277b 0,251a NT5 0,237a 0,382ab 0,413b 0,355b 0,366bc 0,344a 0,273d Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ * Ghi chú: Trên cột giá trị trung bình theo sau chữ số giống không khác biệt mức 95%. Qua ngày nuôi mật số vi khuẩn tăng có khác biệt nghiệm thức. Mật số vi khuẩn ban đầu gia tăng từ từ sử dụng nguồn carbon môi trường nuôi ban đầu để phát triển; độ hấp thụ OD đạt cao vào ngày thứ nghiệm thức (rỉ đường), (sucrose) (đường thùng). Giữa nghiệm thức có khác biệt rõ rệt (Hình 10 ) (Bảng 8). Điều chứng tỏ vi khuẩn giai đoạn phát triển log nên có mật số vi khuẩn cao. Ở nghiệm thức đối chứng (glucose có bổ sung yeast) (glucose) có độ hấp thụ OD có tăng so với ban đầu nhiên qua xác định độ hấp thụ OD ta so sánh thấy vi khuẩn chậm phát triển nguồn carbon dùng nghiệm thức 3, 4, 5. Qua 3, ngày ủ, độ hấp thụ OD tất nghiệm thức có khuynh hướng giảm điều chứng tỏ vi khuẩn đạt tới mức tăng trưởng log đồng thời nguồn carbon môi trường cạn kiệt theo thời gian. Ở ngày thứ độ hấp thụ OD giảm rõ rệt điều chứng tỏ nguồn carbon môi trường dần cạn kiệt không đủ cho vi khuẩn sử dụng để phát triển (Hình 17). 0.6 Mật số vi khuẩn (OD) 0.5 NT1 0.4 NT2 NT3 NT4 0.3 NT5 0.2 0.1 0.0 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Thời Gian (ngày) Hình 16. Mật số vi khuẩn Bacillus sp. nguồn carbon Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Dựa vào giai đoạn phát triển log qua ngày nuôi ta so sánh khác biệt nghiệm thức (Hình 18). Đối với nghiệm thức 1, 2, 4, nghiệm thức (rỉ đường) đạt mật số vi khuẩn phát triển tốt có khác biệt rõ rệt mức 95% điều chứng tỏ rỉ đường có chứa nhiều vitamin số khoáng chất thích hợp với phát triển vi khuẩn. Tiếp theo nghiệm thức (đường chảy) nguồn carbon giúp vi khuẩn phát triển tốt có hạn chế nghiệm thức 3. Điều cho thấy sử dụng rỉ đường môi trường ứng dụng để sản xuất sinh khối sử dụng phòng thí nghiệm. Kết thí nghiệm phù hợp với nghiên cứu vi khuẩn Bacillus trước Đỗ Kim Nhung (2010). 0.600 a Mật số vi khuẩn (OD) 0.500 0.400 bc bc b NT4 NT5 c 0.300 0.200 0.100 0.000 NT1 NT2 NT3 Ngiệm Thức Hình 17. Độ hấp thụ OD vi khuẩn nguồn carbon sau ngày nuôi Sau xác định thời gian nguồn carbon thích hợp cho việc nuôi cấy Bacillus, ta tiến hành xác định mật số vi khuẩn theo phương pháp đếm sống (Cao Ngọc Diệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) nghiệm thức (rỉ đường) sau ngày nuôi đạt trình bày bảng 9. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng .Mật số vi khuẩn Bacillus sau ngày ủ môi trường rỉ đường Lặp lại Mật số vi khuẩn (CFU/mL) Log (CFU/mL) 2.108 8,301 1,3.108 8,110 5.107 7,698 Trung bình 1,2.108 8,036 Sau hai ngày ủ 37oC môi trường rỉ đường, mật số vi khuẩn đạt cao đạt 8.036 (CFU/mL). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Qua trình thực thí nghiệm, đề tài đạt kết sau: - Đã phân lập 20 dòng vi khuẩn từ 10 mẫu chao. - Tất 20 dòng vi khuẩn có đặc tính sinh hoá đặc trưng Bacillus: Gram dương, catalase dương tính, Voges Proskauer dương tính sinh nội bào tử. - Cả 20 dòng vi khuẩn Bacillus có khả tổng hợp amylase môi trường có bổ sung hồ tinh bột protease môi trường skim milk agar. - Dòng B4 có khả tổng hợp amylase protease cao 16,7 mm 34,7 mm. - Rỉ đường môi trường nuôi cấy thích hợp để nhân mật số vi khuẩn 8.036 (CFU/mL) 5.2. ĐỀ NGHỊ - Tiến hành xác định nồng độ protease amylase dòng vi khuẩn sinh ra. - Nghiên cứu điều kiện để tăng sinh khối môi trường rỉ đường. - Tiến hành định danh dòng vi khuẩn Bacillus spp. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang. 2004. Di truyền phân tử, NXB Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. Đỗ Kim Nhung. 2010. Phân lập khảo sát đặc tính sinh học số dòng vi khuẩn Bacillus sp. từ nước thài lò giết mổ. Đại học Cần Thơ. Lương Đức Phẩm. 2002. Vi sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội. Lương Bích Dung. 2008. Phân lập số dòng vi khuẩn Bacillus subtilis ao nuôi tôm công nghiệp. Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Đức Lượng. 2006. Thí nghiệm Vi sinh vật học. Thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Nxb Đại học Quốc gia TP. HCM tập 2, trang 41-43. Nguyễn Ðức Lượng. 2006. Thực phẩm lên men truyền thống. Công nghệ Vi sinh vật, Nxb Ðại học quốc gia TP. HCM tập 3. Nguyễn Lân Dũng. 2006. Phương pháp dùng để định dang loài vi sinh vật. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu Phạm Văn Tỵ. 1978. Các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập III, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, trang 116 – 135 Trần Nhân Dũng, Trần Thị Xuân Mai Trần Ngọc Tuyền. 2007. Giáo trình thực hành sinh học phân tử. Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Trần Thị Xuân Ngân. 2009. Phân lập số dòng vi khuẩn Bacillus subtilis ao nuôi cá tra công nghiệp . Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Tiếng Anh Asgher M, Rahman SU, Sharmin, Legge RL. A thermostable α-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. J Food Eng. 2007;79:950–955. Ballongue, Jean. 2004. Bifidobacteria and Probiotic Action. Acid lactic bacteria microbiological and Functional Aspects. Third Edition, Revised and Expanded, University of Turku, Turku, Finland. pp.67-125 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Chantawannakul, P., Oncharoen, A., Klanbut, K., Chukeatirote, E., Lumyong, S., 2002. Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand. Science Asia 28, 241-245 Cooper K.E.1963. The theory of antibiotic inhibition zone. In: Analytical Microbiology (Edited by Kavanagh F), Academic Press, New York, NY.1, pp. 86 Helga Westers, Elise Darmon, Geeske Zanen. The Bacillus secretion stress response is an indicator for alpha-amylase production level. Appl. Microbiol. 2005.39: 65-73 Holt J.G., N.R. Krieg. Sneath PHA and Willian S.T 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed., William and Wilkins, Baltimore, Maryland, USA, 559. Muhammad Nadeem, Javed Iqbal Qazi et al., Effect of medium comosition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis. Food Technol, 2007. 46: 388-394 Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization. 2002. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London Ontario, Canada. Onda, Takumi, F. Yanagida, M. Tsufi, S. Ogino T. Shinohara 1999. Isolation and characterization of acid lactic bacteria strain GM005 producing antibacterial substance from Miso-paste product. Food Science Technology, the Yamnashi Industrial Technology Center. 5(3), pp. 247-250. Oyeleke S.B, Oliver and Oduwole A.A 2009. Production of amylase by bacteria isolated from a cassava waste dumpsite in Minna, Niger Stage, Nigeria. African Journal of Microbiology Research, 3(4), pp.143-146. Slepecky, R.A and H.E.Hemphill. 2006. The Genus Bacillus- Nonmedical. In: The Prokaryotes. Vol 4: Bacteria: Firmicutes, Cyanobaceria, pp.530-562. Sharmin and Rahman M 2007. Isolation and Characterization of Protease Producing Bacillus strain FS-1. Agricultural Engineering International: the CIGR Ejournal. Vol. 9, pp. 1-6 Torsten Stein. 2005. Bacillus subtilis antibiotic: Structures, syntheses and specific function. Molecular Microbiology.56, pp.845-857. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Vaseeharan and Ramasamy P., Perez et al. 2003. Control of pathogenic Vibri spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon. Applied Microbiology. 36, pp.83-87. PHỤ LỤC Phụ lục 1. Kết phân tích thống kê hoạt tính amylase dựa đường kính vòng tròn thuỷ phân môi trường Nutrient agar có bổ sung hồ tinh bột Vòng tròn đường kính thuỷ phân B1 1.4 B11 1.3 B1 1.4 B11 1.3 B1 1.5 B11 1.3 B2 1.3 B12 1.6 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học 37 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 B2 B2 B3 B3 B3 B4 B4 B4 B5 B5 B5 B6 B6 B6 B7 B7 B7 B8 B8 B8 B9 B9 B9 B10 B10 B10 Source Between groups Within groups Total (Corr.) 1.4 1.4 1.3 1.4 1.5 1.2 1.2 1.4 1.4 1.4 1.4 1.1 1.1 1.2 1.2 1.1 1.3 1.2 1.2 1.2 1.2 1.3 1.4 0.7 0.4 0.7 Trường Đại học Cần Thơ B12 B12 B13 B13 B13 B14 B14 B14 B15 B15 B15 B16 B16 B16 B17 B17 B17 B18 B18 B18 B19 B19 B19 B20 B20 B20 Sum of Squares 2.88267 0.506667 3.38933 1.4 1.5 1.6 1.4 1.3 1.6 1.5 1.5 1.7 1.7 1.5 1.5 1.4 1.5 1.4 1.7 1.4 1.3 1.4 1.3 1.5 1.5 1.4 1.4 1.4 Df 19 40 59 Mean Square 0.151719 0.0126667 F-Ratio P-Value 11.98 0.0000 ANOVA Table for Halo amylase by Dong Multiple Range Test for Halo amylase by Dong Method: 99,0 percent LSD Dong Count Coeff. Of variation B10 28.86% B6 5.09% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học B8 0.00% B7 7.69% B19 17.32% B9 7.69% Mean 0.6 1.13333 1.2 38 1.2 1.26667 1.3 Homogeneous Groups i h gh gh fgh efgh X X XX XX XXX XXXX Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Phụ lục 2. Kết phân tích thống kê hoạt tính protease dựa đường kính vòng tròn thuỷ phân môi trường Skim Milk Agar Đường kính vòng tròn thuỷ phân dòng Bacillus B1 2.7 B11 2.3 B1 2.8 B11 1.8 B1 B11 B2 2.2 B12 3.2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 39 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 B2 B2 B3 B3 B3 B4 B4 B4 B5 B5 B5 B6 B6 B6 B7 B7 B7 B8 B8 B8 B9 B9 B9 B10 B10 B10 2.1 1.8 3.2 3.2 3.7 3.4 3.3 3.7 2.8 3.3 3.3 2.7 2.8 2.7 1.7 2.2 1.7 3.1 3.2 2.2 3.1 3.5 3.2 2.6 2.4 2.3 B12 B12 B13 B13 B13 B14 B14 B14 B15 B15 B15 B16 B16 B16 B17 B17 B17 B18 B18 B18 B19 B19 B19 B20 B20 B20 Trường Đại học Cần Thơ 2.7 2.2 2.7 2.7 3.2 2.9 1.9 2.7 2.7 2.8 3.1 3.2 1.9 3.3 2.7 2.8 3.1 2.7 2.7 2.8 3.2 3.3 3.1 2.8 3.2 3.3 ANOVA Table for Halo amylase by Dong Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 10.9298 4.38 15.3098 Df 19 40 59 Mean Square 0.575254 0.1095 F-Ratio P-Value 5.25 0.0000 Multiple Range Test for Halo amylase by Dong Method: 99,0 percent LSD Multiple Range by Dong Dong CountTest for Halo Coeff.amylase Of Mean Homogeneous Groups Method: 99,0 percent LSD variation B7 15.46% 1.86667 g X B11 12.38% 2.03333 fg XX B2 10.24% 2.03333 fg XX B10 6.27% 2.43333 ef XX B14 21.16% 2.5 ef XX Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học 40 B12 18.51% 2.7 de XX B18 2.11% 2.73333 cde XXX B6 2.11% 2.73333 cde XXX B16 7.89% 2.8 cde XXX Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Phụ lục 3. Kết nguồn carbon thích hợp để tăng sinh khối vi khuẩn độ hấp thụ OD 660nm qua ngày 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C Ngày 0.243 0.234 0.25 0.219 0.315 0.195 0.229 0.228 0.225 0.293 0.32 0.246 0.262 0.26 0.19 Ngày 0.254 0.234 0.258 0.345 0.312 0.352 0.237 0.232 0.27 0.339 0.346 0.363 0.396 0.361 0.39 OD trung bình qua ngày Ngày Ngày NT1 0.242 0.249 NT2 0.243 0.336 NT3 0.227 0.246 NT4 0.286 0.349 NT5 0.237 0.382 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Ngày 0.378 0.324 0.31 0.37 0.38 0.39 0.483 0.439 0.578 0.365 0.417 0.443 0.407 0.432 0.4 Ngày 0.198 0.195 0.198 0.303 0.302 0.302 0.311 0.307 0.295 0.49 0.309 0.269 0.421 0.234 0.41 Ngày 0.102 0.179 0.125 0.219 0.273 0.272 0.301 0.306 0.31 0.318 0.337 0.296 0.383 0.339 0.376 Ngày 0.11 0.122 0.133 0.2 0.245 0.222 0.3 0.32 0.302 0.31 0.3 0.22 0.234 0.345 0.453 Ngày 0.13 0.102 0.104 0.123 0.234 0.234 0.21 0.34 0.301 0.23 0.31 0.212 0.232 0.242 0.345 Ngày 0.337 0.380 0.500 0.408 0.413 Ngày 0.197 0.302 0.304 0.356 0.355 Ngày 0.135 0.255 0.306 0.317 0.366 Ngày 0.122 0.222 0.307 0.277 0.344 Ngày 0.112 0.197 0.284 0.251 0.273 41 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Analysis of Variance for OD Source Sum of Suares Main effects Nguon Carbon 0.255303 Thoi Gian 0.334264 Residual 0.284398 Total 0.873966 Trường Đại học Cần Thơ Df Mean Square F-Ratio P-Value 94 104 0.0658258 0.0557107 0.00302552 21.10 18.41 0.0000 0.0000 Multiple Range Test for OD by Nguon Carbon Method: 95.0 percent LSD Nguon Carbon Count LS Mean Contrast 1–2 1–3 1–4 1–5 2–3 2–4 2–5 3–4 3–5 4–5 21 21 21 21 21 Sig. * * * * * * * 0.19919 0.276524 0.310667 0.320619 0.338667 Homogeneous Groups X X X X X Difference -0.0773333 -0.111476 -0.121429 -0.139476 -0.0341439 -0.0440952 -0.0621429 -0.000995238 -0.028 -0.0180476 ANOVA Table for OD by Carbon_Thoigian Source Sum of Df Mean Squares Square Between groups 0.721727 34 0.0212273 Within group 0.152239 70 0.00217484 Total 0.873966 104 +/- Limits 0.033704 0.033704 0.033704 0.033704 0.033704 0.033704 0.033704 0.033704 0.033704 0.033704 F-Ratio P-Value 9.76 0.0000 Multiple Range Test for OD by Carbon_thoigian Methof: 95.0 percen LSD Carbon_Thoigian 14 Count 3 3 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Mean 0.112 0.121667 0.135333 0.197 Homogenous Group X XX XX XX Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học 42 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 13 15 29 16 28 12 35 27 21 22 11 18 19 20 26 34 23 32 25 33 10 30 24 31 17 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Trường Đại học Cần Thơ 0.197 0.222333 0.227333 0.237333 0.242333 0.243 0.246333 0.248667 0.230667 0.254667 0.327 0.276667 0.283667 0.286333 0.302333 0.304333 0.305667 0.307333 0.317 0.336333 0.337333 0.344 0.349333 0.355 0.356 0.366 0.38 0.382333 0.408333 0.413 0.5 XX XX XXX XXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXXX XXXXXXX XXXXXXX XXXXXXX XXXXXXX XXXXXXX XXXXXXXX XXXXXXX XXXXXXX XXXXXXXX XXXXXXXX XXXXXXX XXXXXX XXXXXX XXXXX XXXX XXX XX X X 43 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học [...]... dòng vi khuẩn Bacillus spp phân lập được đều có khả năng tổng hợp enzyme amylase phân huỷ hồ tinh bột và tạo thành vòng tròn không bị biến đổi thành màu xanh khi cho dung dịch iod vào đĩa, các giếng đối chứng đều không có hiện tượng phân huỷ hồ tinh bột do không có chủng vi khuẩn nên enzyme không được tạo ra (Hình 12) Oyeleke và Oduwole (2009) đã phân lập được Bacillus từ đất tại Nigeria và khi khảo... 2002) Khảo sát đặc điểm của khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus  Hình dạng khuẩn lạc, kích thước  Màu sắc, dạng bìa khuẩn lạc  Độ nổi khuẩn lạc Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Vi n Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.3 Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus phân lập Các dòng vi khuẩn phân lập sẽ được kiểm tra các đặc tính sinh. .. ngành Công nghệ Sinh học 26 Vi n Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 4.2 Khả năng tổng hợp enzyme của các dòng vi khuẩn Bacillus spp phân lập được 4.2.1 Khả năng tổng hợp amylase Khả năng tổng hợp amylase của vi khuẩn Bacillus ssp được xác định dựa trên đường kính vòng thuỷ phân trên môi trường Nutrient agar có bổ sung hồ tinh... hoạt tính catalase, quan sát hình dạng, khả năng chuyển động, nhuộm Gram, thử nghiệm Voger Proskauer (VP) và nhuộm nội bào tử Hình 4 Khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus spp Kết quả đã phân lập được 20 dòng vi khuẩn từ 10 mẫu chao Các dòng vi khuẩn phân lập ròng được mã hoá từ B1 đến B20 (Bảng 2) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Vi n Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học... (0,3 – 0,6 % thạch) Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ 37oC sau 24 giờ và quan sát mẫu Vi khuẩn có khả năng phát triển lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động Vi khuẩn chỉ phát triển theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động c Nhuộm Gram Các dòng vi khuẩn sau khi được tách ròng sau... những dòng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dưới kính hiển vi quang học Mẫu vi khuẩn được hòa vào nước cất vô trùng, đặt trên miếng lame đã khử trùng bằng cồn 96% thực hiện quan sát mẫu dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100 Những dòng vi khuẩn được chọn là các dòng hình que và di động được Các dòng vi khuẩn phân lập được trữ trên môi trường NA ở 40oC Quy trình phân lập được... khuẩn Dựa theo tính chất và phương pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biết α -amylase, glucose -amylase, oligo-1,6glucoxydase Vi khuẩn tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn Trong đó vi khuẩn Bacillus subtilis được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Vi n Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt... peroxise thành nước và oxy trong phản ứng catalase (Bandow et al., 2002) Tuỳ theo đặc tính của vi khuẩn mà có hiện tượng sủi bọt khí mạnh hay yếu, nếu không có hiện tượng sủi bọt khí thì kết quả catalase âm tính Vi khuẩn Bacillus sp sẽ cho kết quả catalase (+) b Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn Quan sát hình dạng của vi khuẫn Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan... vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu không có bọt khí - Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 lần, để thấy được hình dạng của vi khuẩn Vi khuẩn Bacillus có dạng hình que Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Vi n Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn Chuẩn... tính amylase bằng phương pháp tương tự đã xác định được hoạt tính amylase của dòng Bacillus subtilis có đường kính vòng tròn thuỷ phân trên môi trường Nutrient agar có bổ sung hồ tinh bột là 3,1 mm Hình 12 Khả năng tổng hợp amylase của các dòng vi khuẩn Bacillus spp trên môi trường Nutrient agar có bổ sung hồ tinh bột Đường kính vòng tròn thuỷ phân do enzyme amylase của các dòng vi khuẩn Bacillus spp phân . dụng để nhằm thu hồi bạc (fujiwara et al., 199 1; Ishikawa et al., 199 3), làm nước mắm từ cá (Rebeca et al., 199 1), làm thức ăn gia súc (Cheng et al., 199 5),… Ngoài ra, một trong những thuận lợi. TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 9 3.1. Phương tiện nghiên cứu 9 3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện 9 3.1.2. Vật liệu 9 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ 9 3.1.4. Hóa chất và môi trường 9 3.2. Phương pháp. Bacillus trở thành hệ thống di truyền tiêu biểu cho các vi khuẩn Gram dương (Lê Thị Lan, 199 7; Priest, 199 3). Do protease kiềm từ Bacillus được tạo thành với số lượng lớn, có tính bền vững, hoạt