phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp. có khả năng sinh protease và amylase từ chao

Đặt vấn đề Ngày nay, đối tượng vi sinh vật đang được tập trung nghiên cứu nhằm phân lập và tuyển chọn để phục vụ cho sản xuất và đời sống con người ví dụ như phân lập các dòng vi khuẩn

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN Bacillus spp CÓ KHẢ

NĂNG SINH PROTEASE VÀ AMYLASE TỪ CHAO

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG LÂM TRÍ ĐỨC

MSSV: 3096816 LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, Tháng 12/2013

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 35 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

PHẨN KÝ DUYỆT

(Ký tên) (Ký tên)

PGS.Ts Ngô Thị Phương Dung Lâm Trí Đức

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Cảm ơn thầy Huỳnh Xuân Phong – cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khoá 35 đã luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt cho tôi trong quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

Cảm ơn các anh chị tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học thực phẩm, Viện Ngiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm

Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khoá 35 cùng các em sinh viên K36, K37 đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Xin kính chúc ba mẹ, quý thầy cô, các anh chị dồi dào sức khoẻ! Chúc tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến K35 báo cáo luận văn thành công tốt đẹp

Người thực hiện

Lâm Trí Đức

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

TÓM LƯỢC

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp có khả năng sinh protease và

amylase từ chao nhằm sưu tầm và chọn lọc các chủng vi sinh vật có triển vọng hướng tới sản xuất chế phẩm sinh học Kết quả có 20 dòng vi khuẩn được phân lập từ 10 loại chao được thu mua tại các chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ Cả 20 dòng vi khuẩn này được kiểm tra và đều biểu hiện những đặc tính sinh hoá thuộc giống vi khuẩn Bacillus spp Tất cả 20 dòng đều có khả năng tổng hợp amylase (6,0 - 16,7 mm) và protease (14,7 - 34,7 mm), trong đó dòng vi khuẩn B4 có khả năng tổng hợp amylase và protease cao lần lượt là 16,7 mm và 34,7 mm Rỉ đường là nguồn carbon thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp

Từ khoá: amylases, Bacillus subtilis, chao, proteases

ABSTRACT

Isolation and selection of Bacillus spp owning the ability to produce of protease and amylase from Chao samples were carried out to select promising microorganisms for the production of probiotics The first objective of this research was isolation of Bacillus spp from chao samples Secondly, determining the ability of Bacillus spp could synthesize amylases and proteases by agar spot test with starch and skim milk agar methods The last was study on the carbon sources for increase biomass of Bacillus isolate As the result, twenty strains were isolated from 10 collected samples from many markets in CanTho city and classically identified by biochemical testing Twenty of total isolates had capable to synthesize amylases and proteases Significantly, B4 isolate obtained the highest amount of amylases and proteases with 16.7 mm and 34.7 mm of diameter of zone, respectively Molasses was a suitable carbon source to incubate Bacillus spp

Key words: amylases, Bacillus subtilis., chao, protease.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG iii

DANH SÁCH HÌNH iv

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus spp 3

2.2 Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease 4

2.2.1 Enzyme protease 4

2.2.2 Enzyme amylase 5

2.3 Giới thiệu về các sản phẩm lên men đậu nành bởi vi khuẩn Bacillus subtilis 6

2.4 Tình hình nghiên cứu về Bacillus trong và ngoài nước 6

2.4.1 Trong nước 6

2.4.2 Ngoài nước 7

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 9

3.1 Phương tiện nghiên cứu 9

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 9

3.1.2 Vật liệu 9

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 9

3.1.4 Hóa chất và môi trường 9

3.2 Phương pháp nghiên cứu 10

3.2.1 Thu thập mẫu 10

3.2.2 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ sản phẩm lên men đậu nành 10

3.2.3 Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus phân lập 12

a Xác định hoạt tính catalase 12

b Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 12

c Nhuộm Gram 13

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

d Thử nghiệm Voges Proskauer (VP) 14

e Nhuộm nội bào tử 14

3.2.4 Tuyển chọn Bacillus spp có khả năng sinh enzyme protease và amylase 15

3.2.5 Khảo sát nguồn carbon thích hợp để tăng sinh khối vi khuẩn 17

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Kết quả phân lập Bacillus spp 19

4.2 Khả năng tổng hợp enzyme của các dòng vi khuẩn Bacillus spp phân lập được 27

4.3 Xác định nguồn carbon thích hợp để tăng sinh khối vi khuẩn 30

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

PHỤ LỤC 38

i

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Nghiệm thức các nguồn carbon khác nhau……… …17

Bảng 2 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được từ các loại chao khác nhau 20

Bảng 3 Đặc điểm khuẩn lạc của 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp phân lập được 21

Bảng 4 Đặc điểm tế bào của các vi khuẩn đã phân lập 21

Bảng 5 Đặc điểm sinh hoá của 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp phân lập 26

Bảng 6 Đường kính vòng tròn thuỷ phân của 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp trên môi trường nutrient agar có bổ sung hồ tinh bột 28

Bảng 7 Đường kính vòng tròn thuỷ phân của 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp trên môi trường skim milk agar 29

Bảng 8 Độ hấp thụ OD của vi khuẩn Bacillus spp ở 660 nm trong các nguồn carbon 30

Bảng 9 Mật số vi khuẩn Bacillus spp sau 2 ngày nuôi ở rỉ đường 33

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH Trang

Hình 1 Một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis … 3

Hình 2 Mẫu chao được thu về để phân lập Bacillus spp 10

Hình 3 Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus spp từ sản phẩm lên men đậu nành… .11

Hình 4 Khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus spp……….….19

Hình 5 Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn Bacillus ssp sau 24 giờ nuôi cấy 20

Hình 6 Khả năng chuyển động của các dòng Bacillus ssp trong môi trường thạch bán lỏng……… 22

Hình 7 Tế bào vi khuẩn Bacillus spp ……… ……….22

Hình 8 Vi khuẩn Bacillus spp Gram dương với độ phóng đại 100 lần……… 23

Hình 9 Khả năng tổng hợp Catalase của vi khuẩn Bacillus spp……….……24

Hình 10 Thử nghiệm VP của vi khuẩn Bacillus spp……….…… 25

Hình 11 Nhuộm nội bào tử dòng B4……… ………25

Hình 12 Khả năng tổng hợp amylase của các dòng vi khuẩn Bacillus spp trên môi trường Nutrient agar có bổ sung hồ tinh bột……… ….27

Hình 13 Đường kính vòng tròn thuỷ phân trung bình của 20 dòng Bacillus spp …28

Hình 14 Khả năng tổng hợp protease của các dòng vi khuẩn Bacillus spp trên môi trường Skim milk agar………29

Hình 15 Đường kính vòng tròn thuỷ phân trung bình của 20 dòng Bacillus spp.… 30

Hình 16 Mật số vi khuẩn Bacillus trong các nguồn carbon……….… ….31

Hình 17 Độ hấp thụ OD 660nm của vi khuẩn trong các nguồn carbon sau 2 ngày……… … 32

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, đối tượng vi sinh vật đang được tập trung nghiên cứu nhằm phân lập

và tuyển chọn để phục vụ cho sản xuất và đời sống con người ví dụ như phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lân, tổng hợp đạm, tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng Sử dụng các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme cao để ứng dụng trong lên men thực phẩm Đồng thời vi sinh vật còn được sử dụng trong dược phẩm, xử lý môi trường và đặc biệt là trong công nghiệp

Ngoài ra, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học kỹ thuật đã làm cho cuộc sống của con người có nhiều thay đổi lớn Càng ngày đời sống tinh thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu cầu phù hợp với người tiêu dùng Với mục đích tăng năng suất chất lượng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các loại hoá chất độc hại và đặc biệt là nhằm hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, sử dụng vi sinh vật có lợi là một giải pháp tối ưu để thực hiện mục đích này

Một trong những dòng vi khuẩn đã được nghiên cứu và được ứng dụng rộng rãi

đó là vi khuẩn Bacillus Theo Perez et al (2003), Bacillus là vi khuẩn Gram dương, có

dạng hình que, có khả năng sinh bào tử và đặc biệt là có khả năng tổng hợp được

enzyme có hoạt tính rất cao đặc biệt là amylase và protease Nhiều chủng Bacillus có

khả năng sản xuất protease nội bào và ngoại bào Priest (1977) đã chứng minh vi

khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp và sản xuất protease, esterase và một số loại enzyme ngoại bào Ngoài ra còn có những nghiên cứu đã khẳng định Bacillus có

khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm (Zuber et al., 1993; Shenin et al., 1995)

Bên cạnh những ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp,

dược phẩm, vi khuẩn Bacillus còn đóng vai trò trong lên men thực phẩm đặc biệt là lên men đậu nành Vi khuẩn Bacillus đã được phân lập và enzyme của chúng đã được ly trích và tinh sạch từ sản phẩm lên men truyền thống từ đậu nành của Nhật là Natto,

tương tự còn tìm thấy ở các sản phẩm lên men đậu nành từ nhiều quốc gia khác nhau

như Thua nao của Thái Lan, Douchi của Trung Quốc, Kinema của Nepal (Yasuriro et

al., 2002; Cheng et al., 2006; Wonkeuk et al., 1996)

Trong các sản phẩm lên men đậu nành thì sản phẩm lên men được biết nhiều nhất tại Việt Nam là chao Chao là sản phẩm truyền thống có tính chất cổ truyền rẻ tiền và phổ biến Đây là sản phẩm lên men được sản xuất từ sữa đậu nành đông đặc, qua quá trình lên men chao có hệ số dinh dưỡng và hệ số tiêu hoá cao hơn rất nhiều so với đậu nành Chao có nguồn gốc từ Trung Quốc, có tên gọi là sufu Hiện nay có rất nhiều loại chao nhưng nguyên tắc chung là lên men từ đậu nành Đồng thời trong chao có nhiều

vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme có hoạt tính cao (Sharmin and Rahman,

2007)

Do Bacillus có khả năng tổng hợp được nhiều loại enzyme có hoạt tính cao và

được phân lập từ nhiều sản phẩm lên men từ đậu nành Đồng thời ở nước ta có nhiều điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật vào việc sản xuất chế

phẩm sinh học Vì vậy, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp có khả

năng tổng hợp enzyme protease và amylase từ chao” được thực hiện là rất cần thiết Kết quả đề tài sẽ chọn được những dòng vi khuẩn tốt cho việc sản xuất amylase và protease, tăng sự đa dạng giống vi sinh vật

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện với mục tiêu là phân lập những dòng vi khuẩn Bacillus spp

từ chao qua đó tuyển chọn những dòng Bacillus spp có khả năng tổng hợp enzyme

amylase và protease cao

Để thực hiện mục tiêu này, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

- Phân lập những dòng vi khuẩn Bacillus spp từ chao

- Chọn lọc những dòng vi khuẩn Bacillus spp khả năng tổng hợp enzyme

protease và amylase

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus spp

Theo Perez et al., (2003), Bacillus là trực khuẩn Gram dương, catalase dương

tính, hiếu khí, có khả năng di động nhờ lông roi, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên trong đất, nước, không khí và các chất hữu cơ thối rữa Là vi khuẩn có nội bào tử có khả năng chịu nhiệt cao, sinh trưởng hiếu khí hoàn toàn hoặc hiếu khí không bắt buộc

Chính vì Bacillus thường xuyên có mặt trong đất mà Winogradsky đã gọi chúng là vi khuẩn của đất Trừ Bacillus anthracis gây bệnh than cho người tất cả các Bacillus được coi là không độc hại cho người (Oliver, 2009) Đặc biệt Bacillus subtilis từ lâu

được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme và sử dụng cả tế bào sống trong nhiều quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm như một vi sinh vật an toàn

Vị trí phân loại: Theo Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (2nd edition,

2004) thì chi Bacillus thuộc họ Bacillaceae là một trong bốn họ thuộc bộ Bacillales,

ngành Firmicutes, lớp Bacilli

Hình 1 Một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

(Nguồn: http://www.en.wikipedia.org, ngày 19/07/2013)

Một số loài Bacillus gây bệnh cho côn trùng đã được ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu hại như B thuringiensis, B larvae, B lentimorbus Riêng loài

B cereus thì gây độc và làm hư hỏng thực phẩm Phần lớn Bacillus tăng trưởng trong

khoảng nhiệt độ từ 5-50oC, tối ưu ở 35-40oC Một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và hình thành nội bào tử ở 0oC, pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2-11 (Torsten Stein et al.,

2005)

Về dinh dưỡng và sinh trưởng, nhìn chung Bacillus là những vi khuẩn hoá tự

dưỡng hữu cơ tuỳ ý có khả năng sử dụng nhiều các hợp chất hữu cơ đơn giản như là các đường, acid amin, các acid hữu cơ Trong một số trường hợp, chúng lên men

carbonhydrate thông qua chuỗi các phản ứng phức tạp tạo ra glycerol và butanediol

Bacillus mọc tốt trên môi trường có nguồn carbon duy nhất là đường, acid hữu cơ,

rượu,… với nguồn nitơ duy nhất là ammonium Ngoài ra, có một số dạng phân lập cần vitamin để tăng trưởng Chúng có thể sử dụng các sản phẩm enzyme thuỷ giải ngoại bào do quá trình phân giải polysaccharide, acid nucleic và lipid làm nguồn carbon và chất cho điện tử (Nguyễn Lân Dũng et al., 1978)

Việc phân loại theo hình thái và sinh lý được hoàn thiện bằng việc giải trình tự

gen 16S rDNA Theo phương pháp này người ta đã tìm ra các Bacillus có mối quan hệ

họ hàng với một số loài vi khuẩn không hình thành nội bào tử như Enterococcus,

Latobacillus và Streptococus ở cấp độ phân loại bộ và Listeria và Staphylococus ở cấp

độ phân loại họ (Torsten Stein et al., 2005)

Hầu hết các vi khuẩn thuộc giống Bacillus đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu

khí Khi xử lý mẫu bằng nhiệt độ, các tế bào sinh dưỡng thường bị nhiệt độ phá huỷ, trong khi nhiều bào tử trong mẫu vẫn còn sống (Nguyễn Đình Bảng et al., 1992)

Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau làm

cho nó có khả năng phân giải các chất hữu cơ tự nhiên khác nhau có nguồn gốc từ thực vật, động vật bao gồm: cellulose, tinh bột, pectin, protein, agar, hydrocacbon và nhiều loại khác, sản xuất chất kháng sinh, nitrat hoá, khử nito, cố định nito, là sinh vật tự

dưỡng, chịu acid, chịu kiềm, chịu nhiệt,… (Oncharoen et al., 2002)

Bacillus subtilis là vi khuẩn có tiềm năng cao để sản xuất protease, bởi vì nó không

chứa độc tố Các protease được úng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau Các chủng khác sản xuất các độc tố côn trùng, sâu bọ để bảo vệ mùa màng, sản xuất kháng sinh và kháng nấm (Slepecky, R.A và H.E.Hemphill., 2006)

2.2 Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease

2.2.1 Enzyme protease

Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào) Hiện nay, protease ngoại bào đươc chú trong nghiên cứu nhiều hơn so với protease nội bào Một số loại protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công, nông nghiệp

Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus

cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,… (Nguyễn Đức

Lượng, 2004)

Các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tinh chất Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hơp,… protease được chia ra làm 3 nhóm bao gồm:

- Protease acid: có pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo

- Protease trung tính: pH khoảng 6-7, đại diện là metalloenzyme, thường được

sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus

Protease kiềm: có pH khoảng 9-11, trong trung tâm hoạt động có serin

Protease ngoại bào có tác dụng phân giải protein và các chất cao phân tử thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ Protease nội bào giúp phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid amin để tổng hợp protein trong tế bào, hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp (Waller et al.,1995) Protease có nhiều ứng dụng khác nhau như trong công nghiệp thực phẩm và một

số ngành công nghiệp nhẹ như: ngành chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì,… Ngoài ra protease còn được bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem dưỡng da,… có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da hoặc làm sạch cao răng Ngoài, ra, trong công nghiệp dược phẩm và y học, protease được ứng dụng để sản xuất các loại thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người có bệnh tiêu hoá kém do dạ dày Thêm vào đó trong chăn nuôi protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật

2.2.2 Enzyme amylase

Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hoá của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Dựa theo tính chất và phương pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biết α-amylase, glucose-amylase, oligo-1,6-glucoxydase Vi khuẩn tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm mốc, nấm men và

vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn Trong đó vi khuẩn Bacillus subtilis được nghiên cứu

và sử dụng rộng rãi nhất

Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi

trường Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở giai đoạn vi khuẩn đã hoặc

đang kết thúc quá trình sinh trưởng

Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp rượu bia, công nghiệp nước chấm, sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hoá tinh bột, bổ sung vào khẩu phần chăn nuôi

2.3 Giới thiệu về các sản phẩm lên men đậu nành bởi vi khuẩn Bacillus subtilis

Natto là sản phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản được ra đời cách nay ít

nhất 1.000 năm và hơn 3.000 tấn Natto sản xuất hàng năm, vi khuẩn được sử dụng để

len men Natto là Bacillus subtilis natto (Sumi, 1997)

Thua nao là sản phẩm len men đậu nành rất nổi tiếng ở Thái Lan, đậu nành được

rửa, ngâm qua đêm sau đó được nấu từ 3 đến 4 giờ rồi dùng lá chuối gói lại, sau đó cho lên men tự nhiên từ 2 đến 3 ngày ở nhiệt độ môi trường, ngoài ra có thể cho lên men trong tự nhiên dưới ánh nắng trực tiếp của mặt trời giúp sản phẩm khô và trữ

được lâu hơn (Sundhagul et al., 1999) Từ sản phẩm lên men Thua nao đã có rất nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có hoạt tính enzyme cao được phân lập (Panuwan

Chantawannakul et al., 2002) Yasuhiro et al (2003) đã phân lập được 90 dòng vi

khuẩn Bacillus từ 36 sản phẩm lên men đậu nành thu từ các nước Châu Á

2.4 Tình hình nghiên cứu về Bacillus trong và ngoài nước

Vũ Văn Ngữ và các cộng sự (1982) đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm Coli_subtyl

(Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu chảy gây ra ở lợn

so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt

Trần Minh Hùng et al (1971) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis

dạng viên nuôi cấy trên môi trường đậu tương hấp thu bằng tinh bột tan Chế phẩm này dùng cho heo uống từ 0,5 - 1 g/kg thể trọng Kết quả heo sau khi sử dụng chế

phẩm Bacillus subtilis tăng trọng nhanh

Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae, ngoài ra còn ứng dụng nhiều

trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch

Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do Trung tâm

Sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất, Bộ Nông Nghiệp tại TP.HCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải

Hồ Thị Mỹ Hồng và Nguyễn Thanh Bình (2000) ở Trung tâm Ứng dụng Sinh học

Hà Nội đã sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia

furnacalis trên bắp

Khoa Vệ sinh y, học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế

phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở người

Viện bào chế Pharimex TP.HCM, Viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu sản

xuất chế phẩm Bacillus subtilis

Nhóm vi sinh vật dị dưỡng hoại sinh như Bacillus subtilis làm sạch môi trường

nhờ khả năng tổng hợp ra các enzyme (protease, amylase, cellulase, chitinase, lipase) phân huỷ các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của các vi sinh vật gây bệnh, do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính và Đặng Đình Kim, 2007)

Nhiều chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus đã được sử dụng rộng rãi trong sản xuất

kháng sinh, enzyme, trong bảo quản thực phẩm,… do chúng có khả năng sản xuất ra các chất có hoạt tính kháng sinh như bacitracin, Bacillo peptin, Iturin A, Surfactin,

Plipastatin A và B,… (Lê Thị Loan et al., 2005)

khuẩn Bacillus còn là nguồn cung cấp nhiều loại kháng sinh, các chất làm tăng hương

vị như purin nucleoside, surfactan,… với các đặc tính này cùng với khả năng tạo bào

tử và nẩy mầm đã làm Bacillus trở thành hệ thống di truyền tiêu biểu cho các vi khuẩn

Gram dương (Lê Thị Lan, 1997; Priest, 1993)

Do protease kiềm từ Bacillus được tạo thành với số lượng lớn, có tính bền vững,

hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc (fujiwara et al., 1991; Ishikawa et al., 1993), làm nước mắm từ cá (Rebeca et al., 1991), làm thức ăn gia súc (Cheng et al., 1995),…

Ngoài ra, một trong những thuận lợi quan trọng nhất trong việc sử dụng vi khuẩn

Bacillus subtilis đó là chúng gần như không dùng gen để kháng lại kháng sinh hay độc

tố từ Vibrio hoặc vi khuẩn Gram âm có liên quan (Moriarty, 1999)

Bacillus licheniformic là một vi khuẩn Gram dương, hình thành bào tử, được

phân lập từ đất và nguyên liệu thực vật Các loài này sử dụng trong sản xuất công

nghiệp exoenzyme trên quy mô lớn B licheniformis được phát triển như một hệ thống

biểu hiện các gen đánh dấu vì kết quả các chủng tái tổ hợp có thể hữu ích cho nhiều mục đích khác nhau (Isabella et al., 2007)

Bacillus pumilus là vi khuẩn Gram dương hiếu khí, hình que B pumilus sinh bào

tử khi gặp môi trường khắc nghiệt B pumilus được tìm thấy ở vùng sa mạc Sonoran Theo Hafer (2001), Bacillus pumilus-LRW1 có thể được sử dụng thành công để loại bỏ

các ion chất phóng xạ tới mức thấp nhất trong điều kiện chất thải chứa nồng độ muối ở mức thấp

Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn Bacillus

subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và viên nang

Năm 1962, Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu

chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên men acid lactic khác chữa rối loạn đường ruột rất hiệu quả

Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm kumura từ

Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm thực hiện: Phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: Từ tháng 7 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

3.1.2 Vật liệu

Nguồn mẫu dùng để phân lập: sản phẩm lên men từ đậu nành là chao thuộc nhiều chợ khác nhau trên địa bàn Thành Phố Cần Thơ

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ

- Đĩa Petri, eppendorf 1,5ml, thanh kim loại (d=6mm)

- Tủ lắc ủ (incubator shaker) Innova 4200, New Brunskick Scientific, USA

- Tủ ủ (incubator) Sanyo, MTR - 162

- Tủ cấy Telstar, model AV - 100

- Kính hiển vi quang học Olympus DP12 BX41

- Nồi khử trùng pbi international 22793

- Tủ lạnh Sanaky Tokyo, Japan

- Eppendorf centrifuge 5417R

3.1.4 Hóa chất và môi trường

- NA (nutrian agar), NA broth, yeast extract, beef extract, peptone, glucose, natri acetate, CaCO3

- Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, dung dịch iod, dung dịch khử màu (ethanol và aceton theo tỷ lệ 1:1), fushin Hóa chất nhuộm bào tử: dung dịch xanh methylen 1% và đỏ trung tính 0,5% Thuốc thử catalase H2O2 3%, thuốc thử oxidase (sản phẩm của công ty Nam Khoa Biotek) và thuốc thử indole

Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme amylase: Tinh bột 0,1%; NaCl 0,1%; dung dịch iod 0,02N

Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme protease: Gelatin

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thu thập mẫu

Tiến hành thu 10 mẫu chao thuộc nhiều chợ và siêu thị khác nhau trên Thành phố Cần Thơ (Cái Răng, Xuân Khánh, Cái Khế, An Hoà, Tân An), Mỗi mẫu khoảng 100g hoặc 1 lọ (Hình 2)

Các mẫu sau khi thu về sẽ được mã hoá và trữ ở điều kiện nhiệt độ phòng

(30-34oC)

Hình 2 Mẫu chao được thu về để phân lập Bacillus spp

3.2.2 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ chao

Quy trình phân lập được thực hiện theo phương pháp của Chantawannakul et al (2002)

Tiến hành đồng nhất mẫu, cân 1 g mẫu và cho vào ống nghiệm có chứa 10 mL nước cất khử trùng, ủ ở 80oC trong 30 phút dưới tốc độ lắc 120 vòng/ phút nhằm loại

bỏ các vi sinh vật không mong muốn

Pha loãng: hút 1 mL dung dịch trên cho vào 9 mL nước cất khử trùng Tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp, sau đó hút 0,1 mL dung dịch huyền phù ở độ pha loãng cuối cùng (105) và cấy lên đĩa petri có chứa môi trường Nutrient agar (NA) (1% peptone, 0,5% beef extract, 0,5% NaCl và 1,5% agar) Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ

Những dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng sữa, độ nổi mô, phẳng hoặc lài, bìa chia thùy hoặc răng cưa Khuẩn lạc phân lập nằm trên đường cấy chuyển và không lẫn với những khuẩn lạc có hình thái và màu sắc lạ

Sau khi được tách ròng, những dòng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dưới kính hiển vi quang học Mẫu vi khuẩn được hòa vào nước cất vô trùng, đặt trên miếng lame đã khử trùng bằng cồn 96% thực hiện quan sát mẫu dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100 Những dòng vi khuẩn được chọn là các dòng hình que và di động được

Các dòng vi khuẩn phân lập được trữ trên môi trường NA ở 40oC Quy trình phân

Mẫu sản phẩm lên men từ đậu nành

Đồng nhất và pha loãng mẫu: 1 mL mẫu + 9mL dung dịch nước cất khử trùng

Dung dịch pha loãng mẫu 10-1

Ủ ở 37oC/24 giờ Lần lượt pha loãng được các nồng độ tiếp theo

Chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa

Hút từ nồng độ pha loãng 10-5 cho lên đĩa môi trường Nutrient

ager

Giữ giống trên môi trường

3.2.3 Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus phân lập

Các dòng vi khuẩn phân lập sẽ được kiểm tra các đặc tính sinh hoá của Bacillus theo

khoá luận của Bergey (Sneath, 1986; Holt et al., 1994; Yasuhiro Inatsu et al., 2002;

Sharmin và Rahman, 2007)

a Xác định hoạt tính catalase

Sử dụng que cấy lấy một ít sinh khối từ các khuẩn lạc rời rạc rồi chấm vào giọt dung dịch H2O2 30%, nếu có hiện tượng sủi bọt khí thì có hiện tượng catalase dương

Do vi khuẩn Bacillus sp có enzyme KatA và MrgA có khả năng phân huỷ hydrogen

peroxise thành nước và oxy trong phản ứng catalase (Bandow et al., 2002) Tuỳ theo đặc tính của vi khuẩn mà có hiện tượng sủi bọt khí mạnh hay yếu, nếu không có hiện tượng sủi bọt khí thì kết quả catalase âm tính

Vi khuẩn Bacillus sp sẽ cho kết quả catalase (+).

b Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

Quan sát hình dạng của vi khuẫn

Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng Các mẫu vi khuẩn sống được làm bằng phương pháp giọt ép, rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 lần

Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:

- Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật

- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

- Dùng kim cấy, lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật

- Dùng kính đậy vật, đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45o, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu không có bọt khí

- Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 lần, để thấy được hình dạng của vi khuẩn

Vi khuẩn Bacillus có dạng hình que

Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn

Chuẩn bị môi trường chứa thạch bán lỏng (0,3 – 0,6 % thạch)

Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng

Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ 37oC sau 24 giờ và quan sát mẫu

Vi khuẩn có khả năng phát triển lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng

 Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên giữa kính mang vật

 Dùng que cấy đã khữ trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít sinh khối vi khuẩn rồi trải mỏng vi sinh vật lên kính mang vât

 Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật

 Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều Crystal Violet bằng que cấy và để hai phút

 Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước

 Nhỏ từ một đến hai giọt dung dich Iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong một phút

 Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước

 Rửa lại bằng cồn 700 thật nhanh để tẩy màu từ đầu tới cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím

 Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô nước

 Nhỏ từ một đến hai giọt Fuchsin rồi trải đều bằng que cấy và để trong một phút

 Rửa lại bằng nước cât vô trùng cho đến khi giọt nước cuối cùng không còn màu của Fuchsin

 Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước

Quan sát mẫu vật trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal Violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fuchsin là mẫu Gram âm

Vi khuẩn Bacillus sp là vi khuẩn Gram dương

d Thử nghiệm Voges Proskauer (VP)

Thử nghiệm VP có thể giúp nhận biết các loài trong Enterobacteriacae dựa trên sự oxy hoá aceton (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl Sự oxy hoá aceton thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-napththol Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton của môi trường MR-VP kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ, trong thuốc thử có creatine có tác dụng bổ sung nhân

Lắc đều sau đó để yên và đọc kết quả sau 30 phút

Nếu màu môi trường chuyển từ vàng sang đỏ thì kết quả VP dương, còn môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng nhạt thì kết quả VP âm

Vi khuẩn Bacillus sp sẽ cho kết quả Voges Proskauer (+)

e Nhuộm nội bào tử

 Làm vết bôi trên một phiến kính sạch

 Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn

 Nhuộm dung dịch Xanh Methylen 1%, trong 1 phút có hơ nóng từ bên dưới

 Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu

 Nhuộm mẫu bằng dung dịch đỏ trung tính 0,5%, trong 1 phút

 Rửa lại bằng nước cất, để khô

Kết quả: Quan sát mẫu dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100)

Bào tử : bắt màu xanh

Không có bào tử: bắt màu đỏ

Vi khuẩn Bacillus sp có nội bào tử bắt màu xanh.

3.2.4 Tuyển chọn Bacillus spp có khả năng sinh enzyme protease và amylase cao

Ly trích enzyme thô

Các dòng vi khuẩn Bacillus spp phân lập được, sẽ được nuôi trong môi trường

Nutrient broth, lắc 150 vòng/phút ở 37oC trong 24 giờ Ly tâm dưới tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC Thu lấy 50 µL dung dịch ở lớp trên để được dung dịch enzyme thô

Xác định hoạt tính amylase của các dòng Bacillus spp phân lập được

Hoạt tính amylase được xác định theo phương pháp của Sharmin và Rahman (2007) và Helga et al (2005)

Hoạt tính amylase thuỷ phân tinh bột được xác định trên môi trường Nutrient agar có bổ sung dung dịch hồ tinh bột Cân 10 mg tinh bột trong 100 mL nước cất đun cách thuỷ cho đến khi tan hoàn toàn Hút 20 mL hồ tinh bột sẽ được trộn với 100 mL môi trường Nutrient agar sau đó trộn đều và đem khử trùng sau đó phân phối vào các đĩa petri

Dùng thanh kim loại vô trùng tạo thành các giếng có đường kính bằng nhau trên

bề mặt thạch (0,6 cm), mỗi đĩa 4 giếng

Hút 30 µL dung dịch enzyme thô cho vào từng giếng, mỗi đĩa 3 giếng được cho dịch trích enzyme thô vào và một giếng đối chứng thay dịch trích enzyme thô bằng môi trường Nutrient broth không chủng vi khuẩn, sau đó tiến hành ủ mẫu ở 0oC trong

15 phút cho dung dịch trong giếng khuếch tán Sau đó ủ 37oC trong 24 giờ, cho dung dịch iodine lên bề mặt đĩa thạch Tinh bột được phân cắt bởi enzyme amylase do vi khuẩn sinh ra sẽ được xác định một vùng trắng trong xung quanh giếng và phần tinh bột không bị biến đổi sẽ có màu xanh

Đo đường kính vòng tròn thủy phân không bị nhuộm xanh sau đó trừ đi đường

kính giếng để xác định hoạt tính amylase do vi khuẩn Bacillus spp sinh ra

Số liệu sẽ được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics 7.0 để so sánh sự

khác biệt về hoạt tính amylase của các dòng Bacillus spp sinh ra

Xác định hoạt tính protease của các dòng Bacillus spp phân lập được

Hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn Bacillus spp sẽ được xác định theo

phướng pháp của Chantawannakula et al (2002) trên môi trường Skim Milk Agar (1% skim milk, pepton 0,1%, sodium chloride 0,5% và 2,0% agar)

Dùng thanh kim loại vô trùng tạo thành các giếng có đường kính bằng nhau trên

bề mặt thạch (0,6 cm), mỗi đĩa 4 giếng

Hút 30µl dung dịch enzyme thô cho vào từng giếng, mỗi đĩa 3 giếng được cho dịch trích enzyme thô vào và một giếng đối chứng thay dịch trích enzyme thô bằng môi trường Nutrient broth không chủng vi khuẩn được trữ lạnh ở 0oC Sau đó ủ 37oC trong 24 giờ

Hoạt tính thuỷ phân protein được khảo sát qua diện tích vết loang trên môi trường Skim Milk Agar (Cooper, 1963; Chantawannakula et al., 2002; Muhammad

Nadeem et al., 2007) Do protease của vi khuẩn Bacillus spp tổng hợp được sẽ phân

huỷ casein trong sữa và tạo thành vết loang trong xung quanh giếng

Đo đường kính vòng tròn thủy phân được sinh ra xung quanh giếng sau đó trừ đi

đường kính giếng để xác định hoạt tính protease do vi khuẩn Bacillus spp sinh ra

Các số liệu sau đó sẽ được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics 7.0 để so

sánh sự khác biệt về hoạt tính protease của các dòng Bacillus spp sinh ra

Chọn lọc những dòng có khả năng sinh enzyme có hoạt tính cao

- Hoạt tính enzyme của những dòng phân lập được tính bằng kích thước vòng tròn thủy phân quanh miệng giếng trên đĩa

- Hoạt tính enzyme được biểu hiện khi vòng tròn thủy phân rộng hơn 2mm

- Dựa vào kích thước vòng tròn thủy phân:

+ Đường kính vòng tròn thủy phân < 5 mm: hoạt tính enzyme yếu

+ Đường kính vòng tròn thủy phân từ 5 đến 10 mm: hoạt tính enzyme trung bình

+ Đường kính vòng tròn thủy phân > 10 mm: hoạt tính enzyme mạnh

- So sánh hoạt tính enzyme của các dòng và chọn lọc ra 1-3 dòng vi khuẩn

Bacillus spp có hoạt tính enzyme cao

3.2.5 Khảo sát nguồn carbon thích hợp để tăng sinh khối vi khuẩn

Thí ngiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại Mỗi bình tam giác chứa 100 mL môi

trường nuôi cấy Bacillus lỏng theo các nghiệm thức ở Bảng 1 Môi trường được khử

trùng nhiệt ướt (121oC, 1 atm) trong 20 phút, để nguội

Bảng 1 Nghiệm thức các nguồn carbon khác nhau

Chủng vi khuẩn Bacillus (1 mL/bình) vào các bình tam giác đã chuẩn bị ở trên rồi

đặt lên máy lắc với vận tốc 100 vòng/phút

Theo dõi độ hấp thụ OD 660 nm ở các thời điểm: 0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày

Lựa chọn thời gian và nguồn carbon thích hợp để đếm mật số vi khuẩn

Mỗi lần lấy 1 mL mẫu để xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống

Phương pháp đếm sống (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)

Pha loãng dung dịch bằng cách: dùng pipette hút 1 mL dung dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm (1) chứa 9 mL nước cất đã khử trùng, ta được dung dịch có độ pha loãng là

101, lắc đều bằng máy vortex Tiếp tục chuyển 1 mL dung dịch của ống (1) sang ống (2) chứa 9 mL nước cất đã khử trùng, ta được dung dịch có độ pha loãng là 102, tiếp tục pha loãng cho đến độ pha loãng cuối cùng 109 Sau khi pha loãng dùng micropipette hút 5μL dung dịch nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường chứa glucose, mỗi độ pha loãng 3 lần