phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy toluene

Cũng chính vì lẽ đó mà các nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu để có thể tìm ra những loài vi khuẩn có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ với hiệu suất cao nhằm nâng cao hi

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CHỊU NHIỆT

CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TOLUENE

PGS TS.NGUYỄN HỮU HIỆP VÕ NGỌC THẢO NGUYÊN

MSSV:3082615 LỚP:CNSHTT K34

Cần Thơ, Tháng 05/2013

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp Võ Ngọc Thảo Nguyên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Qua quá trình thực hiện luận văn, em đã học hỏi được rất nhiều Lần đầu tiên, em được trải nghiệm quá trình nghiên cứu khoa học thật sự và đầy thú vị Cũng nhờ quá trình này, em càng hiểu và quý trọng những tình cảm, sự giúp đỡ của mọi người Em xin gởi lời cám ơn chân thành đến mọi người

Đầu tiên, em xin chân thành cám ơn toàn thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công Nghệ Sinh Học đã mang đến cho em chân trời tri thức, giúp đỡ em hết mình trong quá trình học tập cũng như nghiên cứu của mình

Em xin gởi lời tri ân sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Hiệp, người vừa là cố vấn học tập, đã quan tâm, giúp đỡ em trong suốt 05 năm đại học, vừa là thầy hướng dẫn tận tụy Nhờ sự giúp đỡ tận tình của thầy mà em có thể hoàn thành luận văn này

Ngoài ra, em cũng xin chân thành cám ơn anh, chị và các bạn thuộc phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, phòng Sinh học Phân tử thực vật đã hỗ trợ em hết mình trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, em xin gởi lời tri ân đến gia đình Nơi về hạnh phúc và an lành cho

em

Võ Ngọc Thảo Nguyên

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

TÓM LƢỢC

Nền công nghiệp ngày càng phát triển giúp cuộc sống con người ngày càng tốt hơn Tuy nhiên, công nghiệp hóa không đi liền với bảo vệ mội trường dẫn tới những ảnh hưởng tiêu cực lên Trái Đất cũng như sức khỏe con người Nhiễm độc Toluene, một loại dung môi hữu cơ được sử dụng phổ biến ở ngành công nghiệp sơn và thuộc

da, là vấn đề đang được các nhà nghiên cứu khoa học quan tâm Mục tiêu của đề tài

là phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy Toluene Mẫu đất thu được tại 04 nguồn: mẫu dất gần Nhà máy thuộc da Tây Đô, Xí nghiệp nhựa Cần Thơ, hồ Xáng Thổi, ruộng lúa có nguy cơ nhiễm độc Toluene cao ở địa bàn thành phố Cần Thơ được tăng sinh khối vi khuẩn bằng cách ủ với Toluene ở nồng độ 1% và 10% ở 45 o C ở cả hai pha khí và pha lỏng và sử dụng môi trường MSB (mineral salt basal) để phân lập Các dòng vi khuẩn có khả năng phát triển với Toluene là nguồn carbon duy nhất và khả năng tạo enzyme protease, cellulase, amylase và lipase được giải trình tự và chứng minh khả năng phân hủy bằng phương pháp đếm mật số phát triển với Toluene là nguồn carbon duy nhất ở các nồng độ 0%, 1%, 1,5%, 2% Từ 04 nguồn đất đã phân lập được 09 dòng vi khuẩn Hầu hết các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp các enzyme Ba dòng được tuyển chọn chính

là T14, T38 và T50 Kết quả giải trình tự và so sánh bằng BLAST cho biết các dòng vi khuẩn này có độ tương đồng cao với dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis (T14), Bacillus subtilis (T38) và Acinetobacter sp (T50) Dòng T38 (Bacillus subtlis) được chọn để kiểm tra khả năng sử dụng Toluene như nguồn carbon duy nhất và đã chứng minh có thể phát triển ở nổng độ Toluene 1% và 1,5%

Từ khóa: Dung môi hữu cơ, nhiễm độc Toluene, phân lập, sự phân hủy, vi khuẩn

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH HÌNH vii

CHỮ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

2.1 Sơ lược về dung môi hữu cơ 3

2.1.1 Định nghĩa 3

2.1.2 Phân loại 3

2.2 Độc tính của dung môi hữu cơ 5

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng sự phân hủy dung môi hữu cơ 7

2.3.1 Biện pháp xử lý sinh học là gì? 7

2.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng sự phân hủy sinh học của dung môi hữu cơ 8

2.4 Cơ chế phân hủy dung môi hữu cơ 10

2.4.1 Phân hủy hiếu khí 10

2.4.2 Phân hủy kỵ khí 11

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

2.5 Tình hình nghiên cứu 12

2.5.1 Ngoài nước 12

2.5.2 Trong nước 13

CHƯƠNG 3 14

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Phương tiện nghiên cứu 14

3.1.1 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 14

3.1.2 Hóa chất 15

3.1.3 Vật liệu 16

3.1.4 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm 16

3.2.2 Phân lập vi khuẩn 17

3.2.3 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn 17

3.2.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene 19

3.2.5 Khảo sát khả năng tạo một số enzyme 19

3.2.6 Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử 20

3.2.7 Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy dung môi hữu cơ 20

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 23

4.2 Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập được 23

4.3 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy Toluene 26

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

4.4 Kết quả khảo sát khả năng tạo một số enzyme của các dòng vi khuẩn đã được

phân lập 27

4.4.1.Khảo sát khả năng tạo enzyme protease ……… 27

4.4.2 Khảo sát khả năng tạo enzyme lipase ……… 28

4.4.3 Khảo sát khả năng tạo enzyme amylase……… 29

4.4.4 Khảo sát khả năng tạo enzyme cellulase……… 30

4.5 Kết quả giải trình tự 32

4.6 Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy Toluene 35

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả 1 Kết quả trả cứu BLAST của dòng T14

2 Kết quả tra cứu BLAST của dòng T38

3 Kết quả tra cứu BLAST của dòng T50

Phụ lục 2: Kết quả

1 Bảng 13: Kết quả thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene (OD 600nm)

2 Bảng 14: Kết quả thí nghiệm khả nẳng tạo enzyme của các dòng vi khuẩn

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Phụ lục 3: Kết quả thống kê

1 Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme protease

2 Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme lipase

3 Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme cellulase

4 Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme amylase

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Một số nhóm dung môi hữu cơ thường gặp……… …3

Bảng 2: Những chất ô nhiễm có tiềm năng áp dụng biện pháp xử lý sinh học 8

Bảng 3: Điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sự phân hủy 9

Bảng 4: Các nghiệm thức sử dụng trong thí nhiệm 21

Bảng 5: Nguồn gốc các dòng vi khẩn đã phân lập 23

Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 24

Bảng 7: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn đã phân lập 24

Bảng 8: Khả năng tạo enzyme protease của các dòng vi khuẩn phân lập được 28

Bảng 9: Khả năng tạo enzyme lipase của các dòng vi khuẩn phân lập được 29

Bảng 10: Khả năng tạo enzyme amylase của các dòng vi khuẩn phân lập được 29

Bảng 11: Khả năng tạo enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn phân lập được 30

Bảng 13: Mật số vi khuẩn của dòng T38 35

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Nguyên tắc chính của quá trình phân hủy hiếu khí hydrocarbon gắn với

quá trình tăng trưởng 10

Hình 2: Nguyên tắc pha loãng.……… … 22

Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn sau 2 ngày……… ……25

Hình 4: Kết quả nhuộm gram của một số dòng vi khuẩn 26

Hình 5: Chỉ số đo OD của các dòng vi khuẩn ở ngày 0, ngày 02 và ngày 04 27

Hình 6: Vòng sáng được tạo ra trong môi trường CMC và tinh bột của một số dòng vi khuẩn 31

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHỮ VIẾT TẮT

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

CDC: Centers for Disease Control and Prevention

CMC: Carbonxy methyl cellulose

LB: Luria Bertani

MSB: Mineral Salt Basal

NIOSH: The National Institue for Occupational Saftey and Health

OD: Optical density

TOL: Toluene

VOCs: Volatile Organic Coumpounds

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Nền công nghiệp ngày càng phát triển giúp tăng năng suất và hiệu quả lao động Nhờ đó, đời sống con người cũng được cải thiện về mặt vật chất Tuy nhiên, mặt trái của nền sản xuất công nghiệp là không thể phủ nhận khi mức độ ô nhiễm ngày càng tăng Ô nhiễm do chất thải công nghiệp, cụ thể là dung môi hữu cơ, không những ảnh hưởng đến hệ sinh thái mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người (Lau, 2001) Mặc dù dung môi hữu cơ đóng vai trò quan trọng trong các ngành sản xuất từ chất nhuộm, plastic, mực in, vải cho tới sản phẩm nông nghiệp và dược phẩm nhưng nếu không được xử lý đúng cách thì lượng lớn dung môi hữu cơ tích tụ lâu ngày sẽ gây độc nghiêm trọng cho môi trường và con người

Các phương pháp xử lý truyền thống đối với những vùng bị nhiễm độc dung môi hữu cơ hay hydrocarbon bao gồm tách lớp đất đã bị ô nhiễm, cách ly vùng bị ô nhiễm (Vidali, 2001) Tuy nhiên, những phương pháp này không hiệu quả vì không giải quyết được triệt để nguồn ô nhiễm Ngoài ra, phương pháp đốt hoặc dùng hóa chất cũng được sử dụng nhưng lại có nhiều nhược điểm và đòi hỏi kinh phí cao Trong tình hình đó, phương pháp xử lý sinh học xuất hiện như một giải pháp tích cực giúp xử lý ô nhiễm hydrocarbon với những ưu điểm như giá thành thấp, không đòi hỏi kỹ thuật cao

và tận dụng được quá trình phân hủy tự nhiên của vi sinh vật Cũng chính vì lẽ đó mà các nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu để có thể tìm ra những loài vi khuẩn có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ với hiệu suất cao nhằm nâng cao hiệu quả của biện pháp xử lý sinh học

Việt Nam với những quần thể vi sinh vật phong phú sẽ là địa điểm đầy tiềm năng

để có thể phân lập được những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene với hiệu

quả cao Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene” được đề xuất

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy Toluene

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về dung môi hữu cơ

2.1.1 Định nghĩa

Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention-CDC) của Mỹ định nghĩa dung môi là những chất có khả năng hòa tan hoặc phân tán một hoặc nhiều chất khác Dung môi hữu cơ là những dung môi có nguồn gốc carbon (chúng có chứa nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử) Trong sách “Hướng dẫn về an toàn sử dụng dung môi hữu cơ” của bộ lao động Newzeland, dung môi được định nghĩa là bất kỳ dung dịch nào có khả năng hòa tan một chất (Tyson et al., 1992) Cụm từ “Dung môi hữu cơ” được dùng để chỉ một nhóm lớn những hóa chất có nguồn gốc từ những sản phẩm dầu mỏ (petroleum) Như vậy, ta có thể định nghĩa dung môi hữu cơ là những dung dịch có khả năng hòa tan các chất khác và có chứa carbon có nguồn gốc từ petroleum

2.1.2 Phân loại

Dung môi hữu cơ được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học của chúng gồm có các nhóm chính: nhóm có chứa clo, hợp chất aliphatic, hợp chất thơm, rượu, glycol, ether, este, keton, aldehyde và những loại khác Bảng 1 cho thấy một số nhóm chính của dung môi hữu cơ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Bảng 1: Một số nhóm dung môi hữu cơ thường gặp

Hợp chất có chứa clo Trichloroethane

Trichloroethylene Methylene chloride Chloroform

Carbon tetrachloride Tetrachlorethylene Hợp chất aliphatic n-hexane

n-heptane Pentane Cyclohexene Cyclohexane Petroleum ether Hợp chất vòng thơm Benzene

Toluene Xylene Naphthalenes Rượu/Glycol/ Ether Methanol

Ethanol Propanol Butanol Ethylene glycol Diethyl ether Ester/ketones/Aldehyd

es

Ethyl acetate Acetone Methyl ethyl ketone Methyl isobutyl ketone Methyl n-butyl ketone Các loại khác Formaldehyde

Glutaraldehyde Carbon disulphide Pyridine

amide amine

(*Nguồn: http://www.uq.edu.au/ohs/pdfs/organicsolvents.pdf., ngày 10/01/2013)

Dung môi sử dụng trong công nghiệp thường là hỗn hợp của nhiều chất khác nhau Ví dụ như dung môi “methylated spirit” là sự pha trộn giữa methanol và ethanol

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Có thể có tới 20 hợp chất trong một số dung môi hữu cơ Ví dụ: White Spirit, Turpentine and Kerosene (Tyson et al., 1992)

2.2 Độc tính của dung môi hữu cơ

Theo thống kê của trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC), ở

Mỹ, 9,8 triệu công nhân phơi nhiễm với dung môi hữu cơ có trong các sản phẩm như sơn, véc-ni, chất kết dính, keo dán, chất tẩy nhờn và trong ngành sản xuất thuốc nhuộm, polymer, plastic, vải, mực in, sản phẩm nông nghiệp và dược phẩm Điều đáng

lo ngại là rất nhiều những dung môi hữu cơ được cảnh báo bởi NIOSH (Viện quốc gia

về an toàn lao động và sức khỏe) như chất gây ung thư (benzene, carbon tetrachloride, trichloethylene), chất độc sinh sản (2-ethoxyethanol, 2-methoxyethanol, methyl chloride) và chất độc thần kinh (n-hexane, tetrachloroethylene, toluene) Những nghiên cứu gần đây cho thấy có sự liên quan giữa sự phơi nhiễm dung môi hữu cơ (trichloroethylene, perchloroethylene, carbon tettrachlorine) và bệnh Parkinson (Goldman et al., 2012)

Những dung môi hữu cơ thường gặp ở nước ta bao gồm VOCs (Volatile Organic Compounds), Benzene và Toluene

Nhiễm độc các chất VOCs: VOCs là tên gọi chung các chất lỏng hay chất rắn có chứa carbon hữu cơ rất dễ bay hơi Một số chất thông dụng như acetone, ethylacetate, buthylacetate v.v Nguồn ô nhiễm VOCs phát sinh do đốt không triệt để xăng dầu, các dung môi hữu cơ tự bay hơi, bay hơi của xăng dầu, bay hơi của các hoá chất rơi vãi Cây xanh khi trao đổi khí ban đêm cũng thải VOCs Nhìn chung, xăng và sơn là hai thứ thải ra VOCs nhiều nhất Chúng ít gây độc mãn tính mà chủ yếu gây độc cấp tính như chóng mặt, say nôn, sưng mắt, co giật, ngạt viêm phổi Chỉ một số ít chất có khả năng gây độc mãn tính thì lại tạo ra ung thư máu, bệnh thần kinh (Bạch Thái Toàn, 2008)

Nhiễm độc Benzen: Benzen là một chất lỏng dễ bay hơi khi hỗn hợp với không khí có thể gây nổ Benzen xâm nhập vào cơ thể qua da (tiếp xúc trực tiếp) và qua phổi Khi xâm nhập, khoảng 75% - 90% được cơ thể thải ra trong vòng nửa giờ Phần còn lại tích lũy trong mỡ và tuỷ xương, não sau đó được bài tiết chậm ra ngoài Phần

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

benzen tích lũy này có thể gây các biểu hiện bệnh lý: Gây ra sự tăng tạm thời của bạch cầu; gây ra sự rối loạn oxy hoá - khử của tế bào dẫn đến tình trạng xuất huyết bên trong cơ thể; nếu hấp thu nhiều benzen cơ thể sẽ bị nhiễm độc với các hội chứng khó chịu, đau đầu, chóng mặt, nôn, có thể dẫn đến tử vong vì suy hô hấp Nếu thường xuyên tiếp xúc với benzen có thể gây nhiễm độc mãn tính Lúc đầu là rối loạn tiêu hoá, ăn kém ngon, xung huyết niêm mạc miệng, rối loạn thần kinh, đau đầu, bị chuột rút, cảm giác kiến bò, thiếu máu nhẹ, xuất huyết trong, phụ nữ hay bị rong kinh, khó thở do thiếu máu Tiếp theo là xuất huyết trong nặng, thiếu máu nặng, giảm bạch cầu Phụ nữ bị nhiễm độc nặng có thể bị đẻ non hoặc sẩy thai đây là bệnh nguy hiểm vì benzen có thể tích luỹ lâu dài trong tuỷ xương Bệnh có thể xuất hiện sau 2 năm kể từ khi bị nhiễm benzene (Bạch Thái Toàn, 2008)

Benzen được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất các chất hữu cơ, dùng làm dung môi hoà tan mỡ, cao su, vecni, tẩy da, vải sợi, lau khô, tẩy dầu mỡ bám trên các dụng cụ, vật liệu, phương tiện Năm 1997, Chính phủ nước ta đã có quyết định cấm dùng benzen làm dung môi pha chế sơn Những ngành khác cần sử dụng benzen thì phải được sự cho phép của cơ quan có thẩm quyền Điều này cho thấy benzen cực

kỳ độc hại Người sử dụng hãy cảnh giác với các sản phẩm sơn, nhất là sơn được sản xuất bằng công nghệ lạc hậu Chất thải từ các nhà máy thuộc da, dệt nhuộm cơ khí, các xưởng sửa chữa tân trang xe, máy, đóng tàu cũng là những nguồn phát thải benzene (Bạch Thái Toàn, 2008)

Nhiễm độc Toluen: Toluen là chất dễ bay hơi, cháy nổ Chỉ cần một nồng độ nhỏ 1/1000, Toluen đã gây cảm giác mất thăng bằng, đau đầu, nếu nồng độ cao hơn có thể gây ảo giác, choáng ngất Toluen có trong sơn, nhựa, keo dán công nghiệp và là chất xúc tác trong công nghệ in ảnh (Bạch Thái Toàn,2008)

Sự hấp thu dung môi hữu cơ thường qua tiếp xúc ngoài da hoặc qua đường hô hấp Nhân tố ảnh hưởng tới tốc độ và mức độ hấp thụ qua da bao gồm thời gian tiếp xúc, nồng độ dung môi và tình trạng của da (độ ẩm của da, vết thương…) và tính tan của các dung môi Tốc độ thâm nhập qua da đã được chứng minh liên quan trực tiếp đến tính tan của dung môi Nói chung, hợp chất clo được hấp thu qua da nhiều hơn các hợp chất không chứa clo Hợp chất vòng thơm để xâm nhập qua da hơn hợp chất

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

aliphatic (Baker, 1988) Sự phơi nhiễm dung môi hữu cơ có thể được miêu tả như phơi nhiễm cấp tính (tiếp xúc trong thời gian ngắn nhưng nồng độ cao) hoặc phơi nhiễm mãn tính (tiếp xúc liên tục trong thời gian dài) Sự phơi nhiễm này có thể gây độc tại

bộ phận cơ thể tiếp xúc với dung môi hữu cơ (tác động cục bộ) hoặc gây thay đổi chức năng của những cơ quan khác (tác động hệ thống) Phản ứng có thể xảy ra ngay lập tức (cấp tính) hoặc mãn tính

Sự hấp thu qua phổi phụ thuộc vào nồng độ dung môi được hít vào, tính tan của các dung môi và tốc độ trao đổi khí của phổi Một ví dụ cụ thể là nếu một người công nhân phải làm việc với tần suất cao dẫn đến tăng tốc độ trao đổi khí của phổi sẽ hít vào lượng dung môi hữu cơ dễ bay hơi nhiều hơn (Baker, 1988)

Trong môi trường, hợp chất thơm là một trong những chất ô nhiễm khó xử lý nhất (Seo et al., 2009) Dung môi hữu cơ có tác động tiêu cực đến môi trường xung quanh, ảnh hưởng đến hệ sinh thái, ức chế sự phát triển của thực vật và động vật Thí

nghiệm cho thấy, động vật phơi nhiễm với dung môi hữu cơ như n-hexane bị ảnh

hưởng đến màng tế bào, sự cân bằng của trao đổi tín hiệu thần kinh và ảnh hưởng tới

hô hấp tế bào cũng như sinh tổng hợp protein (Baker, 1988)

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng sự phân hủy dung môi hữu cơ

2.3.1 Biện pháp xử lý sinh học là gì?

Biện pháp xử lý sinh học (bioremediation) được định nghĩa là quá trình mà những chất thải hữu cơ được phân hủy bằng con đường sinh học dưới điều kiện được kiểm soát cho đến khi đạt được trạng thái vô hại hoặc đến mức độ được chấp nhận bởi

cơ quan quản lý (Vidali, 2001) Quần thể vi khuẩn sử dụng trong xử lý sinh học có thể

là quần thể có sẵn tại điểm ô nhiễm hoặc những quần thể được đưa vào từ nơi nguồn khác

Bởi vì biện pháp xử lý sinh học có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống khác như giá thành rẻ hơn, thân thiện với môi trường nên được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học Năm 1975, Dick Raymond đã nhận bằng sáng chế cho biện pháp xử lý sinh học tại chỗ đối với mạch nước ngầm nhiễm gas Phương pháp này bao gồm sự kích thích sự phát triển vi khuẩn tại chỗ bằng cách bổ sung chất

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

dinh dưỡng Rõ ràng qua hơn 50 năm, xử lý sinh học tại chỗ đối với mạch nước ngầm

đã cho thấy những thành công và hiểu biết hơn về xử lý ô nhiễm, đặc biệt đối với ô nhiễm dầu mỏ (petroleum) Trong những năm gần đây, ứng dụng của biện pháp xử lý sinh học được phát triển ở lĩnh vực xử lý dung môi, hydrocarbon thơm đa vòng, dioxin

và kim loại (Hazen, 2010) Thật vậy, biện pháp sinh học đã được áp dụng trên nhiều địa điểm trên khắp thế giới bao gồm Châu Âu với mức độ thành công khác nhau (Zeyaullah et al., 2009) nhưng cũng đã cho thấy tiềm lực của biện pháp xử lý này

2.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng sự phân hủy sinh học của dung môi hữu cơ

Theo nghiên cứu của Atlas (1981), sự phân hủy của vi sinh vật đóng vai trò chính trong quá trình phong hóa của hỗn hợp petroleum hydrocarbon Sự phân hủy petroleum trong hệ sinh thái tự nhiên rất phức tạp Sự thay đổi của hợp chất hydrocarbon dựa vào bản chất của các hydrocarbon, quần thể vi khuẩn và các nhân tố môi trường ảnh hưởng đến hoạt động của vi sinh vật

Những n-alkanes nhìn chung được đánh giá là hợp chất dễ phân hủy nhất trong

hỗn hợp dầu mỏ (Atlas, 1981) Qua bảng 2 ta có thể biết được những chất ô nhiễm phù hợp với biện pháp xử lý sinh học Trong đó, các dung môi hữu cơ trichloroethylene, perchloroethylene, benzene, toluene, etthylbenzene cũng nằm trong số đó

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Bảng 2: Những chất ô nhiễm có tiềm năng áp dụng biện pháp xử lý sinh học

Dichlorobiphenyl

4,4-+ Sản xuất điện

Trạm xăng dầu Đường ray tàu lửa

Đất

Toluene Ethylbenzene Xylene

+ + Sản xuất và tồn trữ dầu

Sân bay Sản xuất sơn Sản xuất hóa chất…

Hợp chất thơm đa vòng Naphthalene

Antracene Fluorene Pyrene Benzo(a)pyrene

Nhà máy nước ngọt Đất

Trạm xăng dầu Thuốc trừ sâu Atrazine

Carbaryl Carbofuran Coumphos Diazinon Glycophosphate Parathion Propham 2,4-D

Nhà máy xử lý gỗ Sản xuất thuốc trừ sâu Đất

(*Nguồn: Vidali, 2001)

(Ghi chú: *: (+) nằm trong nhóm vi khuẩn)

Đối với quần thể vi sinh vật cho quá trình xử lý sinh học, ta có thể chia thành 4 nhóm bao gồm quần thể hiếu khí, kỵ khí, nấm ligninolytic và methylotrohps (Vidali, 2001)

Yếu tố môi trường cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân hủy của hydrocarbon Để đạt được điều kiện phân hủy tốt nhất, môi trường cần đảm bảo ở trạng thái đầy đủ dinh dưỡng với độ ẩm, pH, nhiệt độ thích hợp Bảng 3 cho ta thấy những điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sự phân hủy của hydrocarbon

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Bảng 3: Điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sự phân hủy

Chỉ số Điều kiện cần cho hoạt động của vi sinh vật Giá trị tối ưu cho sự phân hủy dầu

trọng lượng khô của đất

(*Nguồn: Vidali, 2001)

2.4 Cơ chế phân hủy dung môi hữu cơ

Bởi vì bản chất của các dung môi hữu cơ chính là những hợp chất hữu cơ nên ta

có thể dựa vào cơ chế chung của phân hủy hợp chất hữu cơ (hydrocarbon) để biết được quá trình phân hủy của dung môi hữu cơ Các hợp chất hữu cơ có thể được phân hủy bằng con đường hiếu khí hoặc kỵ khí

2.4.1 Phân hủy hiếu khí

Sự phân hủy hydrocarbon chủ yếu xảy ra bằng con đường hiếu khí (Fristcher, 2000) Dưới sự có mặt của oxy, liên kết C-H được hoạt hóa bởi oxygenase bao gồm sự

có mặt của vi sinh vật sử dụng oxy trong phản ứng tỏa nhiệt (Boll, 2010) Vi khuẩn và nấm là những sinh vật có khả năng tham gia biến đổi các chất hydrocarbon Để bắt đầu chuỗi phản ứng, vi sinh vật cần oxy như một đồng cơ chất Đối với alkane, enzyme đầu tiên là monooxygenase trong khi hydrocarbon thơm có thể bị tấn công bởi cả monooxygenase hoặc dioxygenase Những enzyme này giúp gắn nhóm hydroxyl có nguốn gốc từ phân tử oxy vào chuỗi aliphatic hoặc vòng thơm Sau đó, rượu tạo thành

từ hợp chất aliphatic sẽ được oxy hóa thành acid tương ứng; hợp chất phenolic tạo ra

từ hydrocarbon vòng thơm sẽ là tiền chất cho phản ứng cắt vòng nối tiếp (Heider, 1999) Rất nhiều enzyme oxygenase của hợp chất vòng thơm có thể xúc tác ở phổ rộng

từ aliphatic cho tới hợp chất chloroaliphatic (Leahy, 2003) Cơ chế chính của quá trình phân hủy hiếu khí được mô tả khá chi tiết bởi Fristcher (2000) (Hình 1)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 1: Nguyên tắc chính của quá trình phân hủy hiếu khí hydrocarbon gắn với quá trình tăng trưởng (Nguồn: Fristcher, 2000)

2.4.2 Phân hủy kỵ khí

Mặc dù, phân hủy hiếu khí được xem như là con đường chủ yếu trong phân hủy hydrocarbon Khả năng phân hủy hydrocarbon theo con đường kỵ khí của vi khuẩn cũng là một mảng nghiên cứu đầy hứa hẹn vì ngày càng nhiều hợp chất hydrocarbon được chứng minh là có thể được phân hủy bởi những vi sinh vật hiếu khí (Heider, 1999) Thay vì, sử dụng enzyme oxygenases như trong quá trình phân hủy hiếu khí, các vi khuẩn phân hủy hiếu khí sử dụng một số phản ứng enzyme khác để thay thế Quy trình hoạt hóa liên kết C-H bao gồm: thủy phân với nước bằng enzyme có chứa cofactor là molybdenum, thêm fumarate bằng enzyme có tâm là glycyl, sử dụng methyl-coenzyme M reductase để đảo ngược quá trình methanogenesis, methyl hóa, carboxyl hóa (Boll, 2010) Con đường sinh hóa của quá trình phân hủy alkylbenzenes, toluenes và ethylbenzene đã được làm rõ (Heider, 1999)

Quá trình phân hủy của Toluene bắt đầu bởi phản ứng cộng của toluene methyl vào nối đôi của fumarate để tạo thành benzylsuccinate nhờ vào enzyme có tâm là

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

glycyl Sau đó, quá trình tổng hợp của benzylsuccinate thành benzoyl-CoA và succinyl-CoA được thực hiện nhờ vào sự oxy hóa

2.5 Tình hình nghiên cứu

2.5.1 Ngoài nước

Vào năm 1989, nhiều dòng của chủng vi khuẩn Pseudomonas putida đã được

phát hiện có khả năng phát triển ở trong môi trường nuôi cấy chứa hơn 50% (v/v) toluene hoặc nồng độ cao của cyclohexane, xylene, styrene và heptanol (Inoue, 1989)

Với tiền đề đó, nghiên cứu sâu hơn mặt di truyền của Pseudomonas putida trong quá

trình phân hủy toluene cũng đã được nghiên cứu Kết quả cho thấy TOL plasmid đã

được chứng minh là có vai trò trong việc điều khiển sự phân hủy của m- and p-toluate, m-and p-xylene (Burlage, 1989) Tiếp theo đó vào năm 1992, Aono et al cũng đã công

bố về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa cũng có khả năng kháng toluene Ogino et al (1994) đã nêu lên khả năng tạo ra lipolytic enzyme của Pseudomonas aeruginosa Ngoài P putida, P aeruginosa, Bacillus pumilus cũng có khả năng phân hủy dung

môi hữu cơ (In-Young et al., 1998) Sarren and Mishant (2008) đã tinh sạch được enzyme protease có khả năng kháng dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa từ dòng vi khuẩn

Bacillus licheniformis Các nghiên cứu tiếp theo cũng chứng tỏ Pseudomonas chiếm

ưu thế trong quần thể vi sinh vật có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ (Isken et al., 1999) Gần đây, Marchant và Banat (2010) đã chứng minh khả năng phân hủy

hydrocarbon, cụ thể là alkane bởi nhóm Geobacillus Kết quả cho thấy, tất cả các loài Geobacillus đều có khả năng phân hủy alkane chỉ trừ G thermoglucosidasius, G tepidamans, G pallidus và G lituanicus

Trong những năm gần đây, hướng nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới tập trung vào cơ chế phân hủy những hợp chất hydrocarbon độc hại Cơ chế phân hủy alkane đã được làm rõ qua các nghiên cứu của van Beilen et al (2001)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

- Chai lọ thủy tinh

- Đầu col xanh, vàng, trắng

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

- Dung môi hữu cơ (toluene)

- Hóa chất dùng để nhuộm Gram vi khuẩn

+ Iod

+ Crystal violet

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

+ Ethanol 70%

+ Fushin

+ Nước cất vô trùng

- Môi trường thử hoạt tính enzyme

Môi trường LB (Luria Bertani), gồm các thành phần:

Tryptone 1%

Yeast extract 0,5%

NaCl 1%

3.1.3 Vật liệu

Mẫu nghiên cứu được lấy từ 4 nguồn trên địa bàn thành phố Cần Thơ:

- Mẫu đất gần nhà máy thuộc da Tây Đô

- Mẫu đất ở gần xí nghiệp nhựa Cần Thơ

- Mẫu đất ở hồ Xáng Thổi

- Mẫu đất ruộng lúa

3.1.4 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian thu mẫu: ngày 17/02/2013

Môi trường phân lập: MSB (mineral salts basal) theo công thức của Na et al., (2005)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

3.2.2 Phân lập vi khuẩn

Lấy 5g mẫu đất, nghiền mịn và trộn đều trong 2ml môi trường MSB rồi đem ủ trong chai 50 ml có nắp đậy kín, bên trong chai có chứa 1 tuýp toluene mở nắp ở điều kiện ủ là 45oC trong 1 tuần nhằm tăng sinh vi khuẩn phát triển ở điều kiện môi trường

có Toluene

Tiếp theo, 1ml dung dịch này được thêm vào chai 50ml có nắp đậy kín chứa 9ml môi trường MSB và 1 ml và 0,1 ml Toluene (10% và 1% v/v) Ủ chai ở 45oC và lắc

120 vòng/phút trong 5 ngày

Sau đó, 1ml dung dịch này tiếp tục được chuyển sang 9ml môi trường MSB mới

và ủ trong 2 ngày Dung dịch này được pha loãng với 1 loạt các nồng độ khác nhau sau

đó trải trên môi trường MSB agar và ủ trong tủ ủ với 1 cốc chứa Toluene

Khi khuẩn lạc đã xuất hiện trên mặt đĩa, chọn những khuẩn lạc rời khác nhau cấy chuyển nhiều lần đến khi thu được những khuẩn lạc ròng

Điều kiện ủ mẫu trong suốt quá trình phân lập là 45oC Những khuẩn lạc thu được trên môi trường này được kiểm tra bằng cách ủ trở lại trong môi trường lỏng để xác định khả năng phân hủy Toluene (Na, 2005; Faizal et al., 2005)

3.2.3 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn

Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường MSB agar

Sau khi phân lập và tách ròng các dòng vi khuẩn trên môi trường MSB agar, tiến hành quan sát các khuẩn lạc rời và mô tả các đặc điểm: kích thước, hình dạng khuẩn lạc, độ nổi, màu sắc của khuẩn lạc… (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)

Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

Sau khi tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng Các dòng vi khuẩn đã phân lập sẽ được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo phương pháp giọt ép Phương pháp này cho phép thấy sự chuyển động của vi khuẩn bằng cách:

- Nhỏ 10μl nước cất vô trùng lên kính mang vật

- Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật

- Dùng lamen đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc với kính mang vật một góc 45o đặt nhẹ nhàng tránh không cho có bọt khí

- Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để

thấy hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

Quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn

Các dòng vi khuẩn sau khi quan sát sự chuyển động trong môi trường nước cất

vô trùng được tiếp tục đo kích thước tế bào dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần bằng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)

Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn

Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:

Nhỏ 10 μl nước cất vô trùng lên giữa kính mang vật

Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn cho lên giọt nước vô trùng trên kính mang vật, trải mẫu thật đều và mỏng trên toàn bộ kính mang vật, cố định mẫu bằng cách hơ kính mang vật có sẵn vi khuẩn trên ngọn lửa đèn cồn

Nhỏ từ 1 đến 2 giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi khuẩn đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút

Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô

Nhỏ từ 1 đến 2 giọt dung dịch iod và trải đều bằng que cấy, để yên trong 1 phút Rửa bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô

Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu đến khi giọt cuối cùng không còn

màu tím nữa Dung dịch này có tác dụng rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn Gram dương giữ lại màu tím, còn vi khuẩn Gram âm trở mất màu

Tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô

Nhuộm tiếp với Fushin, nhỏ từ 1 đến 2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy, để yên trong 1 phút Cả 2 nhóm vi khuẩn đều bắt màu thuốc nhuộm này, nhưng vi khuẩn