Thí nghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức bao gồm nghiệm thức đối chứng và ba nghiệm thức còn lại là ba nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau, được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 3 lần lặp lại.
Chuẩn bị các nghiệm thức (môi trường lỏng):
- Pha môi trường MSB cho lần lượt vào các ống nghiệm, mỗi ống thể tích 5ml, đậy nắp sau đó đem khử trùng ở nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121o
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Để nguội môi trường sau đó tiến hành chủng dòng vi khuẩn vào các ống nghiệm trong điều kiện vô trùng. Ở mỗi thí nghiệm, thể tích vi khuẩn được chủng vào các nghiệm thức cũng như các lần lặp lại là 500 µl (mật độ 2.102 CFU/ml)
- Dung môi hữu cơ được cho trực tiếp vào môi trường ở các nghiệm thức dưới dạng dung dịch lỏng theo những thể tích đã được mô tả ở bảng 4.
- Các nghiệm thức sau khi được tiến hành như trên được giữ trên máy lắc, 120 vòng/phút ở 45oC (điều kiện hiếu khí) trong suốt quá trình theo dõi.
- Chuẩn bị môi trường MSB agar đếm mật số vi khuẩn: Môi trường MSB lỏng được bổ sung thêm agar 1,8 đến 2g/100ml môi trường để có môi trường MSB agar trong đĩa Petri.
Bảng 4: Các nghiệm thức sử dụng trong thí nhiệm
NT1 NT2 NT3 NT4 500µl VK + 0% VToluene 500µl VK + 1% VToluene 500µl VK + 1,5% VToluene 500µl VK + 2% VToluene
Ghi chú: V: thể tích; VK: vi khuẩn; NT: nghiệm thức)
* Tiến hành pha loãng và đếm mật số.
Để xác định mật số vi khuẩn ở từng nghiệm thức ta tiến hành pha loãng, nhỏ giọt và đếm mật số trong các ngày 0, 2, 4, 6.
Pha loãng môi trường có chứa vi khuẩn thành các nồng độ thấp hơn. Từ ống nghiệm, hút 100µl dung dịch có chứa vi khuẩn cho vào eppendoft đã có sẵn 900 µl nước cất tiệt trùng. Tiếp tục thực hiện một loạt pha loãng từ 10-1 đến 10-9 (Hình 2). Chọn các nồng độ 10-2 đến 10-9 để tiến hành nhỏ giọt. Dung dịch pha loãng sẽ được hút 3 giọt, mỗi giọt 5 µl rồi nhỏ lên bề mặt đĩa Petri đã đổ sẵn môi trường MSB agar, để những giọt dung dịch cho khô trên môi trường agar, sau đó đem ủ ở 45oC. Sau 48 giờ (hoặc khi quan sát thấy các khuẩn lạc đã mọc lên) tiến hành đếm số khuẩn lạc được hình thành ở các nồng độ pha loãng khác nhau (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc vi sinh vật trong dung dịch ban đầu).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Số tế bào vi khuẩn trong 1 ml (CFU/ml) trong dịch nuôi ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng D1 được tính theo công thức là:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong đó:
Ai là số khuẩn lạc trung bình/giọt Di : độ pha loãng
V: dung tích huyền phù tế bào trong mỗi giọt (ml)
Hình 2: Nguyên tắc pha loãng
Xử lý số liệu: dùng chương trình Excel xử lý vẽ biểu đồ, phần mềm thống kê
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN