Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym β-galactosidaza có hiệu suất cao

Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym β-galactosidaza có hiệu suất cao

B KH&CN VCNTP B KH&CN VCNTP B KH&CN VCNTP Bé khoa học công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm 301 Nguyễn TrÃi, Thanh xuân, Hà nội Báo cáo tổng kết Khoa học kỹ thuật Đề tài Nghiên cứu øng dơng c«ng nghƯ enzym chÕ biÕn mét sè nông sản thực phẩm Mà số : KC 04 07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nớc : PGS TS Ngô Tiến Hiển Đề tài nhánh Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym -galactosidaza có hiệu suất cao Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nớc : TS Nguyễn Văn Cách Hà nội, 10 2004 Bàn quyền: Đơn xin chép toàn phần tài liệu phải gửi đến Viện trởng Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu Bộ khoa học công nghƯ ViƯn C«ng nghƯ thùc phÈm 301 Ngun Tr·i, Thanh xuân, Hà nội Báo cáo tổng kết Khoa học kỹ thuật Đề tài cấp nhà nớc Nghiên cứu ứng dơng c«ng nghƯ enzym chÕ biÕn mét sè n«ng s¶n thùc phÈm M· sè : KC 04 – 07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nớc : PGS TS Ngô Tiến Hiển Đề tài nhánh cấp nhà nớc Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym -galactosidaza có hiệu suất cao Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nớc : TS Nguyễn Văn Cách Hà nội, 10 2004 Bản thảo viết xong tháng 09 2004 Tài liệu đợc chuẩn bị sở kết thực đề tài cấp nhà nớc, mà số : KC 04 - 07 Danh s¸ch c¸n bé tham gia thực đề tài Nguyễn Văn Cách, Tiến sĩ, Chủ nhiệm đề tài nhánh Nguyễn Tú Anh, Thạc sĩ Quản Lê Hà, Tiến sĩ Nguyễn Lan Hơng, Thạc sĩ Nguyễn Phơng Linh, Cử nhân Đặng Minh Hiếu, Kỹ s Trịnh Ngọc Phơng, Kỹ s Nguyễn Thị Hải Yến, Kỹ s Cơ quan chủ trì đề tài nhánh Trờng Đại học Bách khoa Hà nội Đại Cồ Việt Quận Hai Bµ Tr−ng Hµ néi, ViƯt nam Tel.: 04.8692764 http://www.hut.edu.vn Mục lục Tóm tắt Báo cáo kết thực đề tài nhánh Trang Danh sách cán tham gia đề tài Tóm tắt nội dung Tóm tắt tiến độ thực đề tài nhánh I Mở đầu II Nguyên liệu phơng pháp nghiên cứu 10 2.1 Nguyên vật liệu trang thiết bị 2.1.1 Nguồn phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật 2.1.2 Hoá chất 2.1.3 Trang thiết bị 2.2 Phơng pháp nghiên cứu III Kết thảo luận 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ lên men thu enzym -galactzidaza 3.2 Nghiên cứu quy trình tách tinh chế thu chế phẩm enzym galactozidaza 3.3 Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn sử dụng nấm mốc để lên men thu nhận enzym β-galactozidaza 3.4 Nghiªn cøu thư nghiƯm øng dơng enzym -galactozidaza để thuỷ phân đờng lactoza sữa 10 10 10 11 12 15 15 20 22 25 IV KÕt luận 27 V Tài liệu tham khảo 29 VI Phụ lục 30 Hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ số 02/2001/HĐ-ĐTCT-KC 04-07, ngày 10 tháng 12 năm 2001 Hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ số 02/2002/HĐ-ĐTCT-KC 04-07, ngày 01 tháng 01 năm 2002 Hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ số 02/2003/HĐ-ĐTCT-KC 04-07, ngày 01 tháng 01 năm 2003 Danh sách cán sinh viên đợc đào tạo liên quan đến hoạt động củađề tài Hợp tác quốc tế (liên quan đến đề tài) 31 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 37 43 49 54 55 Tóm tắt nội dung Sữa nhóm sản phẩm có giá trị dinh dỡng cao tốt cho sức khoẻ Tuy nhiên, đại đa số ngời trởng thành ngời già thờng xuất hội chứng thiểu chuyển hoá lactoza nên không sử dụng đợc sản phẩm sữa thờng, sữa vốn đà chứa nhiều lactoza Đồng thời, lợng đờng lactoza nguyên liệu sữa cao cao ảnh hởng xấu đến số tiêu chất lợng sản phẩm gây khó khăn cho công nghệ chế biến Enym -galactosidaza (-Dgalactoside-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23) enzym có khả xúc tác phản ứng thuỷ phân đờng lactoza thành hai đờng đơn đễ chuyển hoá galactoza vµ glucoza, n−íc ta cã ngn tµi nguyên vi sinh vật vô phong phú; Với mục tiêu giải vấn đề lactoza phơng pháp vi sinh vật, đề tài Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym -galactosidaza có hiệu suất cao đà đợc triển khai Trên sở khai thác nguồn vi sinh vật từ số sản phẩm thực phẩm, đề tài đà tiến hành phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu xác định nhiều tiêu khoa học công nghệ khác Tổng hợp kết nghiên cứu thu ®−ỵc cho phÐp rót mét sè kÕt ln sau: Đà phân lập tuyển chọn đợc 16 chủng vi khuẩn chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp enzym -galactozidaza cao từ hệ sinh thái Việt nam, hai chủng vi khuẩn có hoạt lực sinh tổng hợp cao là: Sphingomonas paucimobilis BK16 vµ Aeromonas sobria BK41; hai chđng nÊm mèc cã hoạt lực cao đợc lựa chọn Aspergillus aculeatus BK-M4 Penicillium implicatum BK-M12 Đà nghiên cứu xác định đợc số đặc tính sinh lý sinh hoá chủng đà tuyển chọn vài đặc tính enzym galactozidaza đợc tổng hợp Đà xây dựng đợc quy trình công nghệ lên men quy trình công nghệ tách tinh chế thu chế phẩm enzym -galactozidaza, với thông số công nghệ là: + Sư dơng chđng vi khn S paucimobilis BK16 , lªn men hiếu khí môi trờng dịch thải phomat bổ xung thêm đờng lactoza 15,4g/l; bổ xung pepton NH4NO3 (theo tỉ lệ 3:1,41) để đạt hàm lợng nitơ tổng số 3,022g/l điều chỉnh pH giá trị pH=7; tỉ lệ cấp giống 5%, nhiệt độ lên men 30oC kết thúc trình sau thời gian lên men 36 Hiệu tích tụ enzym thực tế đạt 6420 MU/ml khả tích tụ lý thuyết đạt 7456 MU/ml + Phơng trình điều chỉnh tối u cho trình lên men là: Y = 5317,65 + 126,85.X1 - 488,72.X2 + 74,47.X3 Víi: Y X1 X2 X3 hoạt lđộ enzym tích tụ, MI/ml hàm lợng lactoza bổ xung vào dịch thải phomat, g/l hàm lợng pepton + NH4NO3 ( tỉ lệ 3:1,41), g/l Ntổng pH môi trờng + Kết thúc lên men ly tâm 8000v/ph, 10 phút để thu sinh khối; nghiền tế bào 10 phút, siêu âm tần số 14kHez, đệm photphat pH=7 4oC; ly tâm thu dịch trong; kết tủa thu enzym (NH4)2SO4 57,5%; loại muối; tách qua cột trao đổi ion cellulose Hiprep 16/10 DEAE; rửa tách dung dịch muối NaCl 2M với gradient nồng độ biến thiên từ 0,0-0,8M thu phân đoạn tơng ứng nồng độ muối tách khoảng 0,08-0,18M; loại muối cô đặc thu chế phẩm enzym Đà thu đợc hai chủng nấm mốc A aculeatus BK-M4 P implicatum BK-M12 có khả sinh tổng hợp enzym -galactozidaza bền nhiệt đà xác định đợc vài đặc tính chúng là: pHopt = 4,7-6,0, topt = 55oC; bảo tồn >80% hoạt lực điều kiện sau nồng độ galactoza cho phép dới 3,0g/l Đà kết hợp sử dụng kinh phí đề tài vào việc đào tạo 02 thạc sĩ kỹ s công nghệ sinh học Đồng thời đà tạo điều kiện hỗ trợ tích cực việc thiết lập triển khai hợp tác quốc tế Tóm tắt tiến độ thực đề tài nhánh Tên đề tài nhánh: Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym -galactosidaza có hiệu suất cao KC- 04-07 Mà số đề tài : Năm Theo hợp đồng Năm 2001 Đà phân lập đợc chđng vi khn cã ho¹t tÝnh βgalactosidaza tõ hƯ sinh thái vi sinh vật nớc Bớc đầu nghiên cứu đặc tính sinh lý chủng có hoạt lực cao KC-02-07-BK01 KC-02-07-BK05 về: đặc điểm hình thái, đặc điểm phát triển môi trờng đặc, dải nhiệt độ phát triển thích hợp Vợt kế hoạch Cha hoàn thành Không Đà phân lập đợc chủng nấm mốc có hoạt tính -galactosidaza Tuyển chọn Đà phân lập tuyển chọn đợc chủng vợt mức chủng vi khuẩn chủng đăng ký nấm mốc có khả sinh tổng hợp enzym -galactozidaza cao Đang triển khai nghiên cứu thử từ hệ sinh thái nớc nghiệm Đà tuyển chọn đợc chủng vi công nghệ sản khuẩn chđng nÊm mèc cã xt phomat theo ho¹t tÝnh đặc tính enzym cao hớng khai thác cho nghiên cứu tiếp lợng chất tan Đà tiến hành nghiên cứu điều nớc dịch kiện lên men, tốc độ phát triển xử lý chất thải sinh khối tốc độ tích tụ bảo vệ môi enzym, yếu tố ảnh hởng đến trờng Hớng phát triển lực sinh nghiên cứu tổng hợp enzym chủng nh: bớc đầu cho kết nhiệt độ, pH, hàng loạt nguồn khả quan dinh dỡng cacbon nitơ khác đà lên men đạt nồng độ enzym 7456 MU/ml Đà xác định đợc số đặc tính enzym -galactosidaza từ chủng BK16 Năm 2002 Năm 2003 Nghiên cứu điều kiện lên men, tốc độ phát triển sinh khối tốc độ tích tụ enzym, yếu tố ảnh hởng đến phát triển lực sinh tổng hợp enzym chủng nh: nhiệt độ, pH, hàng loạt nguồn dinh dỡng cacbon nitơ khác (tiếp theo kỳ trớc) Đà nghiên cứu, đánh giá lựa chọn sơ chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzym bền nhiệt cho nghiên cứu sau Nghiên cứu thử nghiệm công nghệ sản xuất phomat theo hớng khai thác lợng chất tan nớc dịch xử lý chất thải bảo vệ môi trờng Hớng nghiên cứu bớc đầu cho kết khả quan đà lên men đạt nồng độ enzym 7456 MU/ml Đà nghiên cứu, đánh giá lựa chọn sơ chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzym bền nhiệt cho nghiên cứu sau Đà nghiên cứu, xác định đặc tính định tên chủng vi sinh vật BK16, BK41, M4 M12 Đà triển khai nghiên cứu tách tinh chế thu chế phẩm enzym xác định số đặc tính enzym -galactosidaza *** Đề tài đà kết hợp sử dụng kinh phí để đào tạo 02 thạc sÜ khoa häc kü thuËt, sinh viªn nghiªn cøu khoa học tạo điều kiện hợp tác giúp đỡ cho 01 nghiên cứu sinh Ph.D nớc tham gia nghiên cứu enzym -galactozidaza (trong khuôn khổ thoả thuận hợp tác nghiên cứu hỗ trợ đào tạo song phơng trờng Đại học Bách khoa Hà nội trờng Đại học BOKU-Vienna, Cộng hoà áo) I mở đầu Sữa nhóm sản phẩm có giá trị dinh dỡng cao, đầy đủ chất khoáng có hoạt tính kháng thể; Do vậy, sữa tốt cho sức khoẻ, cho trẻ em cho ngời già Đờng lactoza thành phần quan trọng sữa với hàm lợng sữa tơi dao động khoảng 4,5-5,0% Tuy nhiên, khả hấp thu chuyển hoá đờng lactoza ngời thay đổi theo tuổi tác có dao động đáng kể cộng đồng dân c khác giới Trẻ sơ sinh có khả đồng hoá tốt lactoza nhờ hệ enzym -galactozidaza đợc tổng hợp thành ruột non; Tuy nhiên lực sinh tổng hợp enzym bị dần trẻ qua tuổi cai sữa Kết đại đa số ngời trởng thành ngời già sử dụng nhiều sản phẩm sữa, bị suy giảm hay không lực đồng hoá lactoza, thờng bị xuất triệu chứng nh: đau bụng, đầy hơi, đau bụng quặn, dội (hội chứng thiểu chuyển hoá lactoza, lactose maldigestion hay mức trầm trọng sử dụng đợc sản phẩm sữa có chứa lactoza, lactose instolerance) Ngoài ra, công nghệ chế biến sữa, lợng đờng lactoza cao ảnh hởng xấu đến số tiêu chất lợng sản phẩm nh làm sẫm màu (làm tăng cờng độ caramen cờng độ melanoidin) tái kết tinh đờng bảo quản sản phẩm Chính vậy, việc tìm kiếm giải pháp công nghệ để làm giảm hàm lợng đờng lactoza sữa vấn đề có giá trị thực tiễn khả ứng dụng triển khai cao; Đặc biệt nớc ta, năm gần sản phẩm sữa có xu hớng đợc sử dụng ngày nhiều ngày rộng rÃi Enzym -galactosidaza (-D-galactoside-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23) enzym có khả xúc tác phản ứng thuỷ phân đờng lactoza thành hai đờng đơn galactoza glucoza Enzym -galactosidaza có mặt nhiều tổ chức động vật, thùc vËt vµ rÊt nhiỊu loµi vi sinh vËt cã khả sinh tổng hợp hệ enzym Ưu to lín cđa c«ng nghƯ øng dơng vi sinh vËt sinh tổng hợp enzym đà đợc khẳng định thực tiễn sản xuất công nghiệp, nớc ta có nguồn tài nguyên vi sinh vật vô phong phú, tiền đề thuận lợi để triển khai nghiên cứu sản xuất nhóm chế phẩm enzym -galactosidaza Với luận điểm đà nêu, đà triển khai đề tài "Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chđng gièng b»ng kü tht di trun ®Ĩ sinh tỉng hỵp enzym βgalactosidaza cã hiƯu st cao" Néi dung chÝnh đề tài tập trung giải bốn nhiệm vụ là: + Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzym -galactosidaza cao tõ hƯ sinh th¸i vi sinh vËt n−íc; áp dụng kỹ thuật tuyển chọn tạo giống tiên tiến (bao gồm việc tách dòng gien -galactosidaza biến nạp tạo chủng siêu tổng hợp enzym để thu chđng sinh tỉng hỵp β-galactosidaza hiƯu st cao + Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hoá chủng đà tuyển chọn, đặc tính enzym -galactosidaza chủng nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ lên men thích ứng để sản xuất chế phẩm enzym -galactosidaza + Nghiên cứu thử nghiệm khả ứng dụng chế phẩm enzym -galactosidaza thu đợc chế biến sữa Điểm riêng biệt đề tài đà định hớng nghiên cứu nhằm sản xuất nhóm chế phẩm enzym -galactosidaza, hớng nghiên cứu đợc triển khai số nớc t công nghiệp; qua mở khả tiếp cận xu nghiên cứu đại kết hợp đào tạo, bồi dỡng lực cán để hội nhập hợp tác nghiên cứu khoa học với đối tác nớc III Kết thảo luận 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ lên men thu enzym -galactzidaza Từ nguồn sữa chua (Sản phẩm công ty Vinamilk, Nestle' sản phẩm thủ công) loại nem chua lu hành thị trờng Hà nội, phân lập sơ môi trờng Lactoza-broth đà tách đợc 64 dạng khuẩn lạc phản ứng dơng tính rõ nét môi trờng chứa thị X-Gal; từ khuẩn lạc tuyển chọn lại thu đợc 16 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzym -galactosidaza Giữa chủng khác đáng kể cờng độ màu thời gian xuất màu, phần lớn khuẩn lạc chủng màu rõ nét khoảng thời gian 24-48 giờ, khuẩn lạc vài chủng màu sau 3-4 ngày nuôi Từ chủng đà lựa chọn chủng có khuẩn lạc tạo màu đậm sau 48 để kiểm tra lên men tiếp môi trờng lỏng Tốc độ phát triển chủng hoạt lực enzym galactozidaza nội bào môi trờng sở đợc biểu thị hình Trên hình 1và cho thấy hầu hết chủng kiểm tra phát triển mạnh 24 lên men hoạt lực enzym nội bào tăng mạnh mẽ giai đoạn phát triển logarit đạt giá trị cao vào đầu đến giai đoạn phát triển cân bằng, dờng nh đồng biến với mật độ tế bào canh trờng thời kỳ Kết nghiên cứu cho thấy chủng BK16 đợc xem có nhiều u cả, chủng BK41 Phân tích theo kit máy định tên vi khuẩn Mini API Bio Merieux (CH Pháp; sử dụng tiêu phân loại theo: List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature - URL : http://www.bacterio.cict.fr/ hay www.bacterio.net) đà định danh đợc: + chủng BK 16 đồng cao với loài Sphingomonas paucimobilis nên đợc định tên S paucimobilis BK16 15 + chủng BK41 đồng cao với loài Aeromonas sobria nên đợc định tên Mật độ VSV (OD600nm) lµ A sobria BK41 1.5 0.5 0 12 24 36 48 60 72 Thêi gian lªn men (giê) Chñng BK2 Chñng BK4 Chñng BK41 Chñng BK8 Chđng BK15 Chđng BK16 Chđng BK32 Chđng BK47 Ho¹t lùc enzym (MU/ml) Hình 1: Sự phát triển vi khuẩn môi trờng lên men 200 Chủng BK2 150 Chủng BK4 Chñng BK41 100 Chñng BK8 Chñng BK15 50 Chñng BK16 0 12 24 36 48 60 Thêi gian lên men (giờ) 72 Chủng BK32 Chủng BK47 Hình 2: Sự biến đổi hoạt lực enzym chủng trình lên men Hai chủng vi khuẩn đợc lựa chọn làm đối tợng cho phần nghiên cứu sau §ång thêi, thư nghiƯm kiĨm tra ho¹t lùc enzym tù dịch lên men, dịch nghiền sinh khối vi khuẩn đà cho thấy tất chủng kiểm tra hoạt lực enzym 16 nội bào cao nhiều so với enzym ngoại bào hoạt lực enzym tăng kéo dài thời gian xử lý siêu âm Từ kết cho phép rút kết kuận enzym galactosidaza enzym nội bào liên kết tế bào chất Một số thực nghiệm xử lý tạo biến chủng siêu tổng hợp tia cực tím đà đợc triển khai; nhiên cha mang lại hiệu mong đợi Khả phát triển sinh khối lực tích tụ enzym nguồn thức ăn cacbon đà đợc xác định việc thay chất: fructoza, xyloza, galactoza, xenlobioza, saccaroza, glucoza, lactoza vµ maltoza, víi hàm lợng 20g/l, môi trờng (pepton 3g/l; NaNO3 3,0g; KH2PO4 1g; FeSO4.7H2O 0,01g; ZnSO4.7H2O 0,01g; KCl 0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g CuSO4.5H2O 0,05g/l) Kết thí nghiệm cho thấy với nguồn thức ăn kiểm tra (trừ fructoza) phát triển sinh khối chủng xảy mạnh mẽ khoảng từ 12-36 lên men, sinh khối tích tụ tốt chất: galactoza, lactoza, xyloza maltoza (xem hình 3) Thí nghiệm xác định lực sinh tổng hợp enzym nội bào chủng, tơng ứng với điều kiện trên, cho thấy (xem hình 4) khả sinh tổng hợp enzym -galactosidaza cao chất; lactoza, xyloza, maltoza, galactoza xenlobioza, trong môi trờng lactoza tốc độ sinh tổng hợp enzym xảy mạnh mẽ từ 12-24 lên men đầu Kết trên, phù hợp với nhiều công trình đà công bố, đà khẳng định vai trò cảm ứng sinh tổng hợp Mật độ tế bào (OD600nm) -galactosidaza chất lactoza MT víi fructoza MT víi xyloza 1.5 MT víi galactoza MT víi D-xenlobioza MT víi Saccaroza 0.5 zM T víi glucoza MT víi lactoza 0 12 24 36 48 60 72 MT víi maltoza Thê i g ian lên m en (g iờ) Hình 3: Sự phát triển S paucimobilis BK16 nguồn C khác 17 Hoạt độ enzym NB (OD600nm) 400 MT với fructoza MT víi xyloza 300 MT víi galactoza MT víi D-xenlobioza 200 MT víi Saccaroza 100 zMT víi glucoza MT víi lactoza 0 12 24 36 48 60 72 MT với maltoza Thời gian lên men (giờ) Hình 4: Khả tích tụ enzym S paucimobilis BK16 môi trờng Với mục tiêu tìm kiếm khả sản xuất công nghiệp thí nghiệm tiếp đợc định hớng nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu lactoza nớc thải công nghệ sản xuất phomat Sử dụng sữa tơi đà loại cazein (bằng cách sử dụng HCl hạ pH xuống pH=4,8-4,9, giữ 30 phút 10oC để cazein đông tụ, ly tâm 8000v/ph, 10 phút thu dịch trong) có bổ xung thêm nguồn thức ăn nitơ: pepton, NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3, pepton, cao nÊm men ®· xác định đợc khả đồng hoá rộng rÃi nguồn thức ăn nitơ khác S paucimobilis BK16 ; nhiên, tốc độ phát triển sinh khối cao nhÊt sư dơng cao nÊm men phèi hỵp víi (NH4)2SO4 thấp môi trờng sử dụng NaNO3 Trong khả tích tụ enzym -galactozidaza dao động lớn thay đổi nguồn nitơ này, hoạt độ enzym cao môi trờng sử dụng phối hợp pepton NH4NO3 (sau 24 lên men đạt 1938UI/ml, sau 60 đạt 2046,9UI/ml) Kết đợc áp dụng để so sánh lực tích tụ enzym ba môi trờng sau: môi trờng (thay NaNO3 NH4NO3), bổ xung nitơ vào môi trờng dịch sữa bổ xung vào dịch thải phomat công nghiệp Kết nghiên cứu (trên hình 5) cho thấy dịch thải phomat có hiệu tích tụ enzym cao hẳn hai trờng hợp trên; Hiện tợng lý giải chủng S paucimobilis BK16 đợc phân lập từ môi trờng sữa, chúng cần có yếu tố thuận lợi trình lên men sữa tạo để vi khuẩn sinh tổng hợp enzym 18 Hoạt độ enzym NB (MU/ml) 5000 4000 MT 3000 2000 MT sữa loại cazein 1000 MT dịch thải phomat Thêi gian lªn men (giê) Hình 5: Năng lực tích tụ enzym S paucimobilis BK16 môi trờng Kết nghiên cứu tích cực nguồn nguyên liệu rẻ tiền hiệu để định hớng lên men sản xt chÕ phÈm enzym βgalactozidaza (võa chi phÝ nguyªn liƯu rẻ, vừa góp phần giảm tải ô nhiễm môi trờng cho sở chế biến sữa) Quá trình lên men tổng hợp enzym môi trờng lỏng phụ thuộc vào nhiều yếu tố: thành phần môi trờng lên men (bản chất nồng độ cấu tử thức ăn chính), nhiệt ®é , pH, thêi gian lªn men, tØ lƯ cÊp giống Theo số tác giả tỉ lệ giống cấp 5%-10% hầu nh không ảnh hởng đến trình sinh tổng hợp -galactozidaza vi khuẩn kết hợp với kết nghiên cứu đà trình bày phần trên, áp dụng phơng pháp tối u hoá, đà lựa chọn hoạt độ enzym tích tụ làm hàm mục tiêu với biến thay đổi: - Thành phần môi trờng sở: dịch thải phomat, từ trung tâm nghiên cứu dê thỏ, Ba vì, Hà tây - X1 nguồn cacbon bổ xung: lactoza, với mức 0g, 5g, 10g, 15g 20g - X2 nguồn thức ăn nitơ bổ xung: pepton kết hợp với NH4NO3(1,41g/l 3g NaNO3); với mức: không bổ xung thêm, bổ xung thêm 1, 2, lần hàm lợng - X3 pH môi trờng thay đổi theo mức pH=4, pH=5, pH=6 pH=7 19 Đề tài đà triển khai thí nghiệm xử lý theo phơng pháp quy hoạch thực nghiệm đà thu đợc hàm tối u là: Y = 5317,65 + 126,85.X1 - 488,72.X2 + 74,47.X3 Víi: Y X1 X2 X3 lµ hoạt lđộ enzym tích tụ, MI/ml hàm lợng lactoza bổ xung vào dịch thải phomat, g/l hàm lợng pepton + NH4NO3 ( tØ lƯ 3:1,41), g/l Ntỉng lµ pH môi trờng Theo kết luận trên, hoạt độ enzym -galactozidaza đạt giá trị cực đại 7456MU/ml, tơng ứng với chế độ lên men sử dụng dịch thải phomat, cã bỉ xung 15,4g/l lactoza, bỉ xung pepton vµ NH4NO3 (theo tỉ lệ 3:1,41) để đạt hàm lợng nitơ tổng số 3,022g/l điều chỉnh pH giá trị pH=7, tỉ lệ cấp giống 5%, nhiệt độ lên men 30oC kết thúc trình sau thời gian lên men 36 3.2 Nghiên cứu quy trình tách tinh chÕ thu chÕ phÈm enzym βgalactozidaza KÕt thóc qu¸ trình lên men, dịch lên men đợc ly tâm 8000v/ph, sau 10 thu sinh khèi TiÕp theo, hoµ lại sinh khối vào dung dịch đệm Z lạnh 4oC, pH=8,0; råi xư lý tÕ bµo vi khn theo phơng án là: xử lý hoá chất (bổ xung cloroforc SDS 0,1% để làm tăng tính thấm thành tế bào vi khuẩn), nghiền tế bào siêu âm 18MHez, thời gian phút (trong đá lạnh, gián đoạn nghiền 30'' lại dừng nghiền 30'') ly tâm 8000v/ph thu dịch thu vỏ tế bào (ở dạng phần cặn, hoà tan lại đệm Z) Kết thu đợc cho thấy hoạt độ enzym phần dịch ly tâm sau nghiền siêu âm lớn nhất, nhiên lợng đáng kể enzym liên kết với xác tế bào (khoảng 30-40%), nghĩa việc tìm kiếm giải pháp hỗ trợ nhằm làm tăng hiệu thu hồi enzym cần thiết phải đợc triển khai thêm nghiên cứu 20 Hoạt độ enzym (MI/ml) 1000 Xư lý SDS, cloroforc 800 600 DÞch sau nghiền siêu âm 400 Vở TB sau nghiền siêu âm 200 Thời gian lên men (giờ) Hình 6: Hiệu thu hồi enzym điều kiện xử lý khác Việc thay đổi thời gian siêu âm xử lý phá vỡ tế bào khoảng 15 phút đầu có tác dụng làm tăng đáng kể lợng enzym tự trích ly đợc (đạt tới khoảng 73%); nhiên thời gian tăng giá trị hầu nh không cải thiện thêm đợc hiệu khai thác enzym Dịch thu đợc sau ly tâm đợc xử lý kết tủa enzym sử dụng (NH4)2SO4, với nồng độ thay đổi khoảng 30-70% đà cho thấy khả kết tủa enzym thuận lợi khoảng nồng độ 50-60% (xem hình 7); thử nghiệm kiểm tra lại dải nồng độ đà xác định đợc nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp Hoạt lùc enzym thu håi (%) lµ 47,5% 120 100 80 60 40 20 0 30 40 50 60 70 Nồng độ m uối am on (% ) Hình 7: HiƯu qu¶ thu håi enzym kÕt tđa b»ng sulphatamon 21 Sau khi ly t©m ë 8000v/ph, 10 gạn bỏ phần dịch trong, phần cặn đợc chuyển vào túi xelophan, ngâm đệm photphat pH=7 4oC qua đêm để loại muối; hoà tan lại vào đệm photphat pH=7, lọc qua màng lọc tách sắc ký qua cột trao đổi ion cellulose Hiprep 16/10 DEAE; sử dụng dung dịch đệm Tris-HCl 10 mmol, pH=7,5, rửa tách dung dịch muối NaCl 2M, với gradient nồng độ biến thiên từ 0,0-0,8M Kết thu đợc cho thấy hoạt độ enzym tập trung phân đoạn tách tơng ứng với trờng nồng độ muối NaCl khoảng 0,08-0,18M Phần thí nghiệm xác định đặc tính enzym đợc tiến hành theo trình tự: thu gom phân đoạn trên, cô đặc thiết bị đông khô, loại muối cô đặc lại để thu chế phẩm lỏng Kết nghiên cứu cho thấy enzym -galactozidaza vi khn S paucimobilis BK16 cã nhiƯt ®é tèi thÝch kho¶ng 40-50oC, cao nhÊt ë 45oC; pH tèi −u quanh giá trị pH=7 hoạt lực enzym đạt >80% sau thời gian phản ứng 60 phút 3.3 Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn sử dụng nấm mốc ®Ĩ lªn men thu nhËn enzym β-galactozidaza NÊm mèc cã khả sinh tổng hợp enzym -galactozidaza đợc phân lập từ số sản phẩm sữa, từ mốc tơng từ bánh men rợu (sử dụng thị X-Gal; m«i tr−êng gåm: lactoza 30g/l; NaNO3 3,0g; KH2PO4 1,0g; MgSO4.H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4 0,01g aga-agar 25g/l) Kết phân lập sơ thu đợc 10 chủng nấm mốc khác phản ứng dơng tính với môi trờng X-Gal Tiếp tục tuyển chọn phân lập lại thu đợc chđng, ký hiƯu lµ M4, M6, M7, M8, M9 vµ M12 phản ứng rõ nét với thị Với mục tiêu tìm kiếm nguồn nấm mốc sinh tổng hợp enzym -galactozidaza bền nhiệt, đề tài tiếp tục triển khai thử nghiƯm nu«i cÊy m«i tr−êng láng, ë pH=6,0; 30oC tốc độ lắc 200v/ph, sau 72 thu dịch lên men để xác định hoạt lực enzym nội bào (tiến hành nh đối tợng vi khuẩn) hai chế độ phản ứng 30oC 60oC Kết nghiên cứu thu đợc cho thấy có chủng nấm mốc M4, M6, M9 M12 sinh tổng hợp enzym -galactozidaza 22 bền nhiệt, đặc biệt nguồn enzym -galactozidaza hai chủng M4 M12 thể hoạt tính sau thời gian phản ứng giờ, chủng M12 có hoạt lực cao Kết nghiên cứu hình thái đặc điểm sinh lý áp dụng tiêu phân loại Raper đà cho phép phân loại định tên cho hai chủng là: + Chủng nấm mốc M4 định tên Aspergillus aculeatus BK-M4 + Chủng nấm mốc M12 định tên Penicillium implicatum BK-M12 Hai chủng nấm mốc đà đợc lên men hiếu khí m«i tr−êng láng fermentor lÝt (m«i tr−êng lên men gồm dịch đờng hoá malt 10,6oBx 10%; pepton 0,3% lactoza 7%) Sau ngày lên men thu dịch, ly tâm 5000v/ph, 10 phút để thu sinh khối Hoà lại sinh khối nấm đệm photphat pH=6,9 (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4; 10 mM KCl; mM MgSO4) bổ xung thêm vài giọt SDS 0,1% nghiền siêu âm 14kHez nồi đá lạnh, phút, sau ly tâm thu dịch làm dung dịch enzym Kết tiến hành phản ứng điều kiện nhiệt độ khác đà cho thấy enzym từ hai đối tợng có nhiệt độ tối thích khoảng 55oC (xem hình 8) Ho¹t lùc enzym [%] 120 100 80 60 Chđng A aculeatus BK-M4 40 Chñng P implicatum BKM12 20 30 50 55 60 65 70 Nhiệt độ phản ứng [C] Hình 8: ảnh hởng nhiệt độ đến hoạt tính enzym -galactozidaza nấm 23 Thử nghiệm nghiên cứu ảnh hởng pH đến hoạt tính enzym đà cho thấy enzym β-galactozidaza cña P implicatum BK-M12 cã pH tèi thÝch khoảng pH=4,7-6,0 dờng nh chúng bền điều kiện pH này, đến mức hoạt tính enzym gần nh suy giảm không đáng kể sau 29 phản ứng (hình 9) Hoạt lực enzym (%) 120 100 80 60 4.7 40 20 0 0.5 1.3 5.2 7.9 23.7 29.4 Chñng P implicatum BK-M12 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 9: ảnh hởng pH đến hoạt tính enzym -galactozidaza P implicatum BKM12 ảnh hởng nồng độ sản phẩm tạo thành đà đợc kiểm tra chất galactoza; kết thí nghiệm củng cố thêm kết luận cho hoạt tính enzym bị kìm hÃm nồng độ galactoza cao môi trờng; nhiên, nồng độ galactoza khoảng 0-3,0g/l ảnh hởng mức chấp nhận đợc Ho¹t lùc enzym (%) 100 80 60 40 20 P implicatum BK-M 12 H×nh 10: nång ®é ®−êng galactoza [g / l] ảnh hởng nồng độ sản phẩm cuối galactoza đến hoạt tính enzym -galactozidaza P implicatum BK-M12 24 3.4 Nghiªn cøu thư nghiƯm øng dơng enzym β-galactozidaza để thuỷ phân đờng lactoza sữa Khả ứng dụng chế phẩm enzym -galactozidaza để thuỷ phân lactoza sữa đợc triển khai theo hai phơng án là: Sử dụng chủng vi khuẩn S paucimobilis BK16 làm tác nhân, lên men điều kiện đà xác định đợc mơc 3.1 ®Ĩ thu sinh khèi vi khn råi ®−a đông khô Thực nghiệm từ lít dịch lên men với hoạt độ enzym 6420 MU/ml đà thu đợc 5,2g sinh khối đông khô với hoạt độ 1012MU/mg; nghĩa khả thu hồi enzym khoảng 82% Sữa tơi có đờng, sản phẩm thơng mại công ty Vinamilk, đợc điều chỉnh đến hàm lợng đỡng xấp xỉ 30g/l; bổ xung chế phẩm sinh khối đông khô 0,5g/500ml sữa (tơng ứng nồng độ enzym xấp xỉ 2000MU/ml) Giữ hỗn hợp phản ứng 30oC, giờ; tiến hành xác định hàm lợng đờng lactoza glucoza hai thời điểm trớc sau xử lý Kết thu đợc cho thấy hàm lợng đờng lactoza đà giảm đáng kể (từ 12,81g xuống 4,63g - tơng ứng làm giảm 63,86%; xem chromatogram phần phụ lục); hàm lợng glucoza tăng từ 11,75g/l lên 13,61g/l, nghĩa phần lactoza không bị thuỷ phân thành glucoza galactoza Nguyên nhân tợng suy giảm cần đợc nghiên cứu tiếp, khả mong đợi nguồn enzym có hoạt tính galactozyl hoá đáng kể, nên phần đờng lactoza đà đợc chuyển hoá theo hớng tạo sản phẩm galactooligosaccharide Sử dụng chế phẩm enzym -galactozidaza tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn E coli ATCC 11105 (do nhóm tác giả Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm khoa học tự nhiên Công nghệ quốc gia sản xuất) để xử lý sữa t−¬i thêi gian 30 ë 30oC, víi nång độ enzym khác nhau: 1, 2, 4, 6, 10 lần nồng độ sở tơng ứng với nồng độ chất sữa tơi, dơn vị nồng độ sở tơng ứng với 1àmol lactoza sữa) đà thu đợc kết bảng sau: 25 Bảng 1: Sự biến đổi hàm lợng đờng lactoza saz xử lý enzym -galactozidaza tái tổ hợp từ E coli ATCC 11105 Nång ®é enzym x 2X 4X 6X 8X 10X 69,73 60,07 38,67 28,80 12,60 7,93 Hàm lợng lactoza lại sau xử lý (%) Nh ghi nhận hiệu tích cực khả sử dụng enzym -galactozidaza tái tổ hợp để làm giảm hàm lợng đờng lactoza sữa; nhiên vấn đề cần đợc nghiên cứu chi tiết 26 IV Kết luận Tổng hợp kết nghiên cứu cho phép rút kết luận sau: Đà phân lập tuyển chọn đợc 16 chủng vi khuẩn chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp enzym β-galactozidaza cao tõ hƯ sinh th¸i ViƯt nam, ®ã hai chđng vi khn cã ho¹t lùc sinh tỉng hợp cao là: Sphingomonas paucimobilis BK16 Aeromonas sobria BK41; hai chđng nÊm mèc cã ho¹t lùc cao đợc lựa chọn Aspergillus aculeatus BK-M4 Penicillium implicatum BK-M12 Đà nghiên cứu xác định đợc số đặc tính sinh lý sinh hoá chủng đà tuyển chọn vài đặc tính enzym -galactozidaza đợc tổng hợp Đà xây dựng đợc quy trình công nghệ lên men quy trình công nghệ tách tinh chế thu chế phẩm enzym -galactozidaza, với thông số công nghệ là: + Sử dụng chủng vi khuÈn S paucimobilis BK16 , lªn men hiÕu khÝ trªn môi trờng dịch thải phomat bổ xung thêm đờng lactoza 15,4g/l; bỉ xung pepton vµ NH4NO3 (theo tØ lƯ 3:1,41) để đạt hàm lợng nitơ tổng số 3,022g/l điều chỉnh pH giá trị pH=7; tỉ lệ cấp giống 5%, nhiệt độ lên men 30oC kết thúc trình sau thời gian lên men 36 Hiệu tích tụ enzym thực tế đạt 6420 MU/ml khả tích tụ lý thuyết đạt 7456 MU/ml + Phơng trình điều chỉnh tối u cho trình lên men là: Y = 5317,65 + 126,85.X1 - 488,72.X2 + 74,47.X3 Víi: Y X1 X2 X3 lµ hoạt lđộ enzym tích tụ, MI/ml hàm lợng lactoza bổ xung vào dịch thải phomat, g/l hàm lợng pepton + NH4NO3 ( tØ lƯ 3:1,41), g/l Ntỉng lµ pH môi trờng 27 + Kết thúc lên men ly tâm 8000v/ph, 10 phút để thu sinh khối; nghiền tế bào 10 phút, siêu âm tần số 14kHez, đệm photphat pH=7 4oC; ly tâm thu dÞch trong; kÕt tđa thu enzym b»ng (NH4)2SO4 57,5%; loại muối; tách qua cột trao đổi ion cellulose Hiprep 16/10 DEAE; rửa tách dung dịch muối NaCl 2M với gradient nồng độ biến thiên từ 0,0-0,8M thu phân đoạn tơng ứng nồng độ muối tách khoảng 0,08-0,18M; loại muối cô đặc thu chế phẩm enzym Đà thu đợc hai chủng nấm mốc A aculeatus BK-M4 P implicatum BKM12 có khả sinh tổng hợp enzym -galactozidaza bền nhiệt đà xác định đợc vài đặc tính chúng là: pHopt = 4,7-6,0, topt = 55oC; bảo tồn >80% hoạt lực điều kiện sau nồng độ galactoza cho phÐp d−íi 3,0g/l §· thư nghiƯm kiĨm tra sư dụng chế phẩm enzym -galactozidaza để làm giảm hàm lợng đờng lactoza sữa thu đợc kết tốt; nhiên vấn đề cần đợc nghiên cứu chi tiết Đà kết hợp sử dụng kinh phí đề tài vào việc đào tạo 02 thạc sĩ kỹ s công nghệ sinh học Đồng thời đà tạo điều kiện hỗ trợ tích cực việc thiết lập triển khai hợp tác quốc tế (có giải trình bổ xung phần phụ lục) 28 V Tài liệu tham khảo Nguyễn Tú Anh Hoạt tính -galactosidaza từ vi khuẩn khả ứng dụng công nghiệp chế biến sữa Luận văn thạc sĩ KHKT, Đại học Bách khoa Hà nội, Hà nội 2002 H Nagano, M Omori, Z shori, T Kawaguchi and M Arai Purification and characterization of β-galactosidaza from Enterobacter cloacae GAO Biosci Biotech Biochem.,1992, 56(4), p.674-675 H Nagano, M Omori, Z shori, T Kawaguchi and M Arai Molecular cloning and nucleotide sequence of β-galactosidaza gene from Enterobacter cloacae GAO Biosci Biotech Biochem.,1994, 58(10), p.1866-1869 J Loveland, K Gutshall, J Kasmir, P Prema and J.E Brenchley Characterization of psychrotrophic microorganisms producing β-galactosidaza activities Applied environ Microbiology, Jan 1994, p.12-18 R.C Dickson, L.R Dickson and J.S Markin Purification and properties of an inducible β-galactosidaza isolated from the yeast Kluyveromyces lactics Journal of bacteriology, Jan 1979, p.51-61 J.E Prenosil, E Stuker and J.R Bourne Formation of oligosaccharides during enzymatic lactose: Part I: State of art Biotech And Bioengineering, 1987, Vol 30, p.1019-1025 S hekmat and D.J McMahon Survival of Lactobacillus acidophilus and Bifridobacterium bifidum in ice cream for use as probiotic food Journal of dairy Sci., 1992, 75, p.1415-1422 R.G Crittenden and M.J Playne Production, properties and application of food-grade oligosaccharides Trends in Food Sci & Techn., Nov 1996, p.353-361 29 ... phân lập tuyển chọn tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym galactosidaza có hiệu suất cao" Nội dung đề tài tập trung giải bốn nhiệm vụ là: + Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh. .. nhánh: Nghiên cứu phân lập tuyển chọn tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym β-galactosidaza cã hiƯu st cao KC- 04-07 M· sè ®Ị tài : Năm Theo hợp đồng Năm 2001 Đà phân lập đợc chủng. .. chủng siêu tổng hợp enzym để thu chủng sinh tổng hợp -galactosidaza hiệu suất cao + Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hoá chủng đà tuyển chọn, đặc tính enzym -galactosidaza chủng nghiên cứu xây