Bài viết Tinh sạch Peptid người tái tổ hợp có khả năng thấm qua màng, khả năng ứng dụng trong protein trị liệu trình bày những khiếm khuyết của protein là nguyên nhân của phần lớn các bệnh ở người. Protein trị liệu là liệu pháp thay thế có hiệu quả cho phần lớn các bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp sai protein hoặc ức chế tiến trình biệt hóa sai của tế bào ung thư,... Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TINH SẠCH PEPTID NGƯỜI TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG THẤM QUA MÀNG, KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG PROTEIN TRỊ LIỆU Nguyễn Văn Hạnh Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm KH - CN Việt Nam Những khiếm khuyết protein nguyên nhân phần lớn bệnh người Protein trị liệu liệu pháp thay có hiệu cho phần lớn bệnh liên quan tới trình tổng hợp sai protein ức chế tiến trình biệt hóa sai tế bào ung thư Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết tổng hợp peptid có khả thấm qua màng tế bào (CPP) từ gen người nhằm cung cấp công cụ tạo protein tái tổ hợp xuyên màng để ứng dụng sinh học y học Hai CPP chọn từ vùng chuyển tín hiệu vào nhân tác nhân phiên mã người Chúng thử chức vận chuyển vào tế bào Hela Jurkat điều kiện in vitro Kết cho thấy, protein có hiệu vận chuyển tương tự đối TAT-EGFP chúng có trình tự acid amin ngắn Các protein vào tế bào chất nhân, từ giả thiết protein liên quan nội bào ứng dụng cho mục đích trị liệu Từ khóa: CPP, protein tái tổ hợp, protein trị liệu, TAT I ĐẶT VẤN ĐỀ Hướng quan trọng liệu pháp protein tạo protein có chức ngăn chặn kích hoạt gen dẫn đến phát triển tế bào ung thư Ngoài ra, protein định hướng để kích hoạt gen sản xuất sản phẩm cần thiết insulin hay làm tác nhân đáp ứng bệnh nhân thiếu hụt miễn dịch [1] Hiện có số thuốc protein hay có nguồn gốc từ protein thương mại hóa có mặt thị trường Theo thơng báo gần nghiên cứu “phân tích thị trường protein trị liệu toàn cầu”, thị trường dự báo tăng trung bình 13% giai đoạn 2012 - 2014 Thông báo tiết lộ lĩnh vực kháng thể đơn dòng chiếm ưu loại thuốc Ttuy nhiên thuốc lĩnh vực protein hứa hẹn tạo thị trường nhiều tỉ đô la [2] Địa liên hệ: Nguyễn Văn Hạnh - Viện Cơng nghệ Sinh học - 18 Hồng Quốc Việt - Hà Nội Email: nvhanh@ibt.ac.vn Ngày nhận: 27/11/2012 Ngày chấp thuận: 26/4/2013 Các peptid có khả thấm qua màng tế bào (cell permeable peptides - CPP) bao gồm nhóm peptid có khả thấm qua màng sinh chất tế bào sống [3] Các nghiên cứu phát triển CPP tiến hành sau khám phá chế truyền nhiễm HIV chúng dựa vào protein TAT để thâm nhập vào tế bào người [4] Dựa vào phát này, CPP phát triển peptid có chiều dài 10 - 14 acid amin, giàu arginin leucin loài sinh vật hay tổng hợp nhân tạo [5] Đánh giá chức CPP thường dựa vào khả vận chuyển protein từ mơi trường ngồi vào tế bào Tuy nhiên, peptid việc chúng có chức vận chuyển protein qua màng, chúng yếu tố ngoại sinh nên thường gây độc cho tế bào người Do vây, để tăng khả ứng dụng y học tránh tính độc hại peotein ngoại lai, peptid có nguồn gốc gần gũi tổng hợp từ DNA người công cụ tốt để phát triển thuốc theo định hướng protein trị liệu [6] TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong nghiên cứu này, nhằm mục tiêu thử nghiệm khả vận chuyển protein peptid có nguồn gốc từ đoạn gen chuyển tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear localling signal) người thay cho peptid có nguốc gốc từ virus hay vi sinh vật khác để ứng dụng tạo protein trị liệu tương lai II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Chuẩn bị protein tái tổ hợp Protein EGFP tái tổ hợp tổng hợp tinh theo phương pháp Choi cộng [7] Trình tự DNA TAT CPP khác nhân lên với gen EGFP (hình 1) vector pET28a(+), biểu E coli BL21 (hình 2) Hình Sơ đồ cấu tạo thành phần protein nghiên cứu Protein hoạt hóa tổng hợp IPTG (500 µM), tinh phương pháp sử dụng cột Niken (Qiagen) gắn kết với đuôi Histidin vector pET28a (+) Sau tinh sạch, protein khử muối cột PD10 (Qiagen), môi trường PBS 20% glycerol Protein định lượng, chia nhỏ bảo quản -20oC sử dụng Đánh giá khả vận chuyển protein tế bào Jurket Phương pháp thử nghiệm chức xuyên màng protein thực theo Gomez cộng [3] Tế bào lympho T (tế bào Jurkat, RIKEN) nuôi mơi trường RPMI-1640 có bổ sung 10% FBS, 50 IU/ml penicillin 50 µg/ml streptomycin Thu tồn tế bào sau ngày nuôi, ly tâm 3000 v/p, gieo tế bào theo nồng độ 1,5 triệu tế bào vào đĩa nuôi giếng Protein thử nghiệm bổ sung vào đĩa nuôi đạt nồng độ mM Ni tế bào vòng 37oC, độ ẩm bão hòa, 5% CO2 Thu mẫu tế bào xử lý, rửa lần PBS trước đo độ phát xạ huỳnh quang máy FACS (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) Đánh giá khả vận chuyển protein tế bào Hela Hình Sơ đồ vector biểu protein TCNCYH 82 (2) - 2013 Phương pháp thử nghiệm chức xuyên màng protein thực theo Choi cộng [3] Tế bào Hela nuôi môi trường D-MEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium), bổ sung 10% huyết bò, phiến kính tròn đĩa ni giếng Sau ngày ni, tế bào mọc chiếm khoảng 60% diện tích phiến kính tiến hành thí nghiệm Q trình thí nghiệm tiến hành theo bước sau: 1) hút toàn môi trường nuôi cũ, thay 500 ml môi trường nuôi chứa mM protein, nuôi trong tủ ni 37oC, độ ẩm bão hòa, 5% CO2 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2) hút tồn môi trường, rửa lần 500 ml dung dịch PBS, sau thêm 500 ml hóa chất nhuộm nhân Hoechst pha loãng theo tỷ lệ 1/4000 PBS Tế bào nhuộm 30 phút; 3) Tế bào rửa lần 500 ml dung dịch PBS, sau cố định formaldehyd 10% 15 phút 4) rửa phiến kính lần nước cất đặt lên lam kính để quan sát kính hiển vi huỳnh quang (Olympus, Nhật Bản) Hình Hình ảnh điện di gen SDS sản phẩm protein sau tinh Khối lượng EGFP (30,55 kDa); TAT-EGFP (30,1 kDa); CPP2-EGFP (29,85 kDa); CPP3EGFP (31,48kDa) III KẾT QUẢ Kết tổng hợp protein tái tổ hợp trình bày hình Kết cho thấy, protein có độ tinh cao, kích thước từ 29,85 kDa (CPP2-EGFP) đến 31,48 kDa (CPP3EGFP) Hai CPP-EGFP có kích thước protein tương tự với TAT-EGFP Kết hấp thụ protein vào tế bào Jurkat đánh giá máy flow cytometric thể hình a b Hình So sánh khả vận chuyển protein peptid với TAT vận chuyển protein vào tế bào jurkat a) với EGFP mức vận chuyển khơng có khác biệt so với đối chứng không tế bào CPP2 EGFP có mức độ biểu tương đương TAT-EGFP b) với EGFP mức vận chuyển khơng có khác biệt so với đối chứng không tế bào CPP3 EGFP có mức độ biểu tương đương TAT-EGFP 10 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Với hàm lượng protein mM, ủ vòng biểu phát quang lô xử lý EGFP tương đương với lô đối chứng không xử lý lô xử lý CPP2-EGFP CPP3-EGFP có mức độ biểu tương tự với TAT-EGFP Kết hấp thụ protein vào tế bào Hela thể hình Hình ảnh hiển vi cho thấy, hàm lượng protein hấp thụ vào tế bào tương đồng với TATEGFP Các protein CPP-EGFP thấm vào tế bào chất nhân tế bào Trong hầu hết lơ thí nghiệm xử lý 100% tế bào có hấp thụ protein Thời gian protein vận chuyển vào đến nhân tế bào giao động từ 15 đến 30 phút Hình Protein biểu tế bào Hela Với bước sóng ánh sáng chuyên dụng cho Hoechst tất lô xử lý cho ánh sáng bước sóng cho ánh sáng phù hợp EGFP có lơ tế bào xử lý CPP - EGFP có phát quang tương tự TAT - EGFP IV BÀN LUẬN Cơ chế vận chuyển qua màng peptid nghiên cứu suốt thập kỷ qua Mục tiêu hướng nghiên cứu khẳng định khả ứng dụng trị liệu, trình xử lý cần tránh tổn thương tới tế bào khỏe mạnh Gần đây, nghiên cứu dần làm sáng tỏ đường vận chuyển qua màng CPP [1] Từ kết này, CPP có khả kết hợp với protein trị bệnh mà có đặc tính phù hợp với loại tế bào nghiên cứu phát triển Các nghiên cứu cho thấy, đoạn peptid ngắn thuộc đoạn gen chuyển tín hiệu vào nhân tế bào (nuclear TCNCYH 82 (2) - 2013 localization signal) protein có hoạt động dẫn truyền protein qua màng sinh chất tế bào sống [7] Các protein tái tổ hợp thường thiết kế để vận chuyển EGFP từ môi trường nuôi vào tế bào, với cấu trúc gắn đầu cuối N peptid với đầu cuối C EGFP (hình 1) [8] Trong nghiên cứu này, tập trung vào đánh giá khả vận chuyển protein peptid khảo sát thơng qua kết hình ảnh thu đích đến protein EGFP Kết cho thấy protein sau khoảng thời gian định khu trú vùng nhân tế bào (hình 5) Việc phát triển CPP nhằm ứng 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC dụng cho hướng protein trị liệu nhiều phòng thí nghiêm giới theo đuổi Từ việc thay đổi vài acid amin trình tự TAT để tăng tính thấm vào loại tế bào chuyên biệt [9] hay tạo CPP tổng hợp có trình tự tồn arginin [10] Đáng ý, việc xác định nhóm protein có vùng khả đảm nhiệm chức vượt qua màng tế bào cách thụ động dẫn đến hướng nghiên cứu lĩnh vực đánh giá tính chất thâm nhập vào màng tế bào protein [11] Các CPP ngồi việc xác định có khả chuyển qua màng phát triển để đến loại tế bào hay quan định [12] Trong nghiên cứu chúng tôi, khả vận chuyển peptid không cao so với TAT ưu peptid có nguồn gốc từ DNA người nên có khả ứng dụng cao hạn chế tính độc tính kháng miễn dịch protein lạ thể V KẾT LUẬN Nghiên cứu tổng hợp peptid có nguồn gốc từ người có khả vận chuyển qua màng tế bào Việc phát triển gắn peptid với protein định hướng chữa bệnh tiếp tục thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Stewart K.M., Horton K.L., Kelley S.O., (2008) Cell-penetrating peptides as delivery vehicles for biology and medicine Org Biomol Chem 6, 2242 - 2255 Szlachcic A., Zakrzewska M., Otlewski J., (2011) Longer action means better drug: Tuning up protein therapeutics Biotech Adv 29, 436 - 441 Gomez J.A., Chen J., Ngo J., et al (2010) 12 Cell-Penetrating Penta-Peptides (CPP5s): Measurement of Cell Entry and ProteinTransduction 3594 - 3613 Activity Pharmaceuticals 3, Frankel A.D., Pabo C.O (1988) Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus Cell 55 (6), 1189 - 1193 Torchilin V.P., (2008) Tat peptidemediated intracellular delivery of pharmaceutical nanocarriers Adv Drug Del Rev 60, 548 – 558 Torchilin V.P., (2011) Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect Adv Drug Del Rev 63, 131 – 135 Choi J.M., Ahn M.H., Chae W.J., et al (2006) Intranasal delivery of the cytoplasmic domain of CTLA-4 using a novel protein transduction domain prevents allergic inflammation Nat med 12 (5), 574 - 579 Wadia J.S., Stan R.V., Dowdy S.F., (2004) Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis Nat Med 10 (3), 310 - 315 Lea N.C., Buggins A.G.S., Orr S.J., et al (2003) High efficiency protein transduction of quiescent and proliferating primary hematopoietic cells J Biochem Biophys Methods 55, 251 - 258 10 Fuchs S.M., Raines R.T., (2005) Polyarginine as a multifunctional fusion tag Protein Sci 14, 1538 - 1544 11 Wadia J.S., Dowdy S.F., (2005) Transmembrane delivery of protein and peptide drugs by TAT-mediated transduction in the treatment of cancer Adv Drug Del Rev 57, 579 – 596 12 Foerg C., Merkle H.P., (2008) On the biomedical promise of cell penetrating peptides: limits versus prospects J Pharm Sci 97 (1), 144 - 162 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary PURIFICATION OF RECOMBINANT CELL PERMEABLE PROTEINS AND THE POSSIBILITY FOR PROTEIN THERAPY Inactivated proteins caused many human diseases Protein therapy is one of the therapies for many diseases related to a defected protein or inhibitor of a biological process to stop the growth of the tumor Here, we present the results of improved recombinant cell-penetrating peptides (rCPPs) These rCPPs can serve as new tools for delivering protein in biology and medicine applications We cloned the CPP in-frame with green fluorescent protein (rCPP - GFP) We were able to express and purify full-length rCPP - GFP fusion proteins The results showed that, each purified r.protein was tested in Hela and Jurkat cell lines for their transduction efficiency and translocation The purified rCPPs - GFP fusion proteins have biological activity as good as HIV virus derived TAT - EGFP peptides The expressed rCPPs-EGFPs were able to translocate across both the cytoplasm and nucleus, thus, these intracellular regulatory proteins can be used as protein transporters for therapeutic purposes Key words: CPP, protein recombination, TAT, therapeutic protein PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT Hồng Đạo Bảo Trâm1, Tơ Minh Quân2, Đoàn Nguyên Vũ2, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ2, Lê Thị Ngọc Hương2, Lưu Phương Nam3, Phan Kim Ngọc2 Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Thử nghiệm phân lập nuôi cấy tế bào gốc tủy chuột tiến hành 15 mẫu tủy chuột nhắt trắng Mus musculus var albino - tuần tuổi Răng cửa hàm chuột xử lý dung dịch Peniciline 400UI/ml, Streptomycine 400µg/ml 20 phút Mảnh mơ tủy nuôi cấy sơ cấp đĩa 35mm môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, điều kiện 37oC, CO2 5% Sau tuần, tế bào hợp dòng, cấy chuyền sang Flask 25cm2 tiếp tục q trình ni cấy thứ cấp hệ thứ tư (P4) Sự biểu marker bề mặt tế bào đánh giá phương pháp Flow Cytometry Kết cho thấy tế bào tủy chuột P4 có biểu marker tế bào gốc trung mô CD73, CD90, CD105 không biểu marker tế bào máu CD19, CD34, CD45 Các tế bào có thời gian nhân đơi 45 đỉnh đường cong tăng trưởng đạt vào ngày thứ Tế bào gốc tủy chuột nuôi cấy thành công phương pháp nuôi cấy mảnh mơ tủy chuột Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, phân lập tế bào, nuôi cấy tế bào I ĐẶT VẤN ĐỀ Tủy mô liên kết chứa tế bào, mạch máu thần kinh, có chức trì TCNCYH 82 (2) - 2013 sống Tương tự tủy xương, tủy chứa tế bào gốc trung mơ Ngồi ra, tủy chứa tiền nguyên bào ngà 13 ... từ virus hay vi sinh vật khác để ứng dụng tạo protein trị liệu tương lai II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Chuẩn bị protein tái tổ hợp Protein EGFP tái tổ hợp tổng hợp tinh theo phương pháp Choi cộng... peptid có nguồn gốc từ DNA người nên có khả ứng dụng cao hạn chế tính độc tính kháng miễn dịch protein lạ thể V KẾT LUẬN Nghiên cứu tổng hợp peptid có nguồn gốc từ người có khả vận chuyển qua màng... KẾT QUẢ Kết tổng hợp protein tái tổ hợp trình bày hình Kết cho thấy, protein có độ tinh cao, kích thước từ 29,85 kDa (CPP2-EGFP) đến 31,48 kDa (CPP3EGFP) Hai CPP-EGFP có kích thước protein tương